第十章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

1、第十章第十章 蛋白質(zhì)和氨基酸的測定蛋白質(zhì)和氨基酸的測定 （一）測定方法概述（一）測定方法概述1、測定蛋白質(zhì)含量的方法：、測定蛋白質(zhì)含量的方法：凱氏定氮法、比色法凱氏定氮法、比色法快速測定法（雙縮脲、紫外、水楊酸比色、快速測定法（雙縮脲、紫外、水楊酸比色、染料結(jié)合法）染料結(jié)合法）2、測定氨基酸的方法：、測定氨基酸的方法：甲醛、電位滴定、茚三酮比色甲醛、電位滴定、茚三酮比色氣相、液相、薄層、離子交換色譜、氣相、液相、薄層、離子交換色譜、自動分析儀自動分析儀（二）凱氏定氮法（二）凱氏定氮法1 1、實(shí)驗原理、實(shí)驗原理以硫酸銅為催化劑，以硫酸銅為催化劑，用濃硫酸消化試樣，用濃硫酸消化試樣，使有機(jī)氮分解為

2、氨，使有機(jī)氮分解為氨，與硫酸生成硫酸銨。與硫酸生成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨逸出，然后加堿蒸餾使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用用硼酸溶液吸收，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的據(jù)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量計算蛋白質(zhì)的含量。消耗量計算蛋白質(zhì)的含量。水水 2 2、實(shí)驗步驟、實(shí)驗步驟 （1 1）試樣的制備與稱樣（稱）試樣的制備與稱樣（稱0.5-5g0.5-5g試樣（含試樣（含氮氮30-40mg30-40mg） 放入凱氏燒瓶中）放入凱氏燒瓶中） （2 2）消化）消化 向凱氏燒瓶中依次加入硫酸銅向凱氏燒瓶中依次加入硫酸銅0.4g0.4g、硫酸、硫酸鉀鉀10g10g、硫酸、硫酸20

3、mL20mL。將凱氏燒瓶放在電爐上，。將凱氏燒瓶放在電爐上，緩慢加熱。待起泡停止，內(nèi)容物均勻后，升高緩慢加熱。待起泡停止，內(nèi)容物均勻后，升高溫度，保持液面微沸。當(dāng)溶液呈藍(lán)綠色透明時，溫度，保持液面微沸。當(dāng)溶液呈藍(lán)綠色透明時，繼續(xù)加熱繼續(xù)加熱0.5-1h0.5-1h。取下凱氏燒瓶冷卻至約。取下凱氏燒瓶冷卻至約4040，緩慢加人適量水，搖勻，冷卻至室溫。緩慢加人適量水，搖勻，冷卻至室溫。 （3 3）蒸餾與吸收）蒸餾與吸收 將消化好并冷卻至室溫的消化溶液全部轉(zhuǎn)移到將消化好并冷卻至室溫的消化溶液全部轉(zhuǎn)移到100mL100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻。 向接

4、收瓶內(nèi)加入向接收瓶內(nèi)加入30mL2%30mL2%硼酸溶液和硼酸溶液和1 1滴混合指示滴混合指示劑。將接收瓶置于蒸餾裝置的冷凝管下口，使下口浸劑。將接收瓶置于蒸餾裝置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取入硼酸溶液中。取 10100.05mL0.05mL稀釋定容后的試液，稀釋定容后的試液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室。并用少量水沖洗小玻璃杯，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室。并用少量水沖洗小玻璃杯，一并移入反應(yīng)室。塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加一并移入反應(yīng)室。塞緊棒狀玻璃塞，向小玻璃杯內(nèi)加入約入約10mL40%10mL40%氫氧化鈉溶液。提起玻璃塞，使氫氧化氫氧化鈉溶液。提起玻璃塞，使氫氧化鈉溶液緩慢流入反應(yīng)室。立

5、即塞緊玻璃塞，并在小玻鈉溶液緩慢流入反應(yīng)室。立即塞緊玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸餾璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸餾5min5min。降低。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口離開液面，繼續(xù)蒸餾接收瓶的位置，使冷凝管管口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min1min。用少量蒸餾水沖洗冷凝管管口，洗液并入接收。用少量蒸餾水沖洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶內(nèi)。取下接收瓶。瓶內(nèi)。取下接收瓶。 (4) (4) 滴定滴定 用用0.1mol/L0.1mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定收集液鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定收集液至剛剛出現(xiàn)紫紅色為終點(diǎn)。至剛剛出現(xiàn)紫紅色為終點(diǎn)。 同一試樣做兩次平行實(shí)驗，同時做空白實(shí)同一試

6、樣做兩次平行實(shí)驗，同時做空白實(shí)驗。驗。 3 3、結(jié)果計算、結(jié)果計算 (V0 / V)0.014c X(%) =-F100 m(10/100) （三）比色法（三）比色法 1、實(shí)驗原理：食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件、實(shí)驗原理：食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在，在 pH 4.8的乙酸鈉的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的 3,5-二乙酰二乙酰-2,6-二甲基二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長二氫化吡啶化合物。在波長 400 nm下測定吸下測定吸光度值

7、，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。 2、操作步驟：、操作步驟：（1）試樣消解：稱取試樣）試樣消解：稱取試樣0.2 g移入定移入定氮瓶中，加入氮瓶中，加入0.1 g硫酸銅、硫酸銅、1 g硫酸鉀及硫酸鉀及5 mL 硫酸，搖硫酸，搖勻后于瓶口放一小漏斗，加熱，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明勻后于瓶口放一小漏斗，加熱，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，取下放冷，慢慢加入后，取下放冷，慢慢加入20 mL水，放冷后移入水，放冷后移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻備用。按同一方法做試劑空容量瓶中，加水至刻度，混勻備用。按同一方法做試

8、劑空白試驗。白試驗。 （2）試樣溶液的制備：吸取試樣溶液的制備：吸取5.00 mL試樣或試樣或試劑空白消化液于試劑空白消化液于100 mL容量瓶內(nèi)，加容量瓶內(nèi)，加1滴滴2滴對硝基滴對硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加300 g/L氫氧化鈉溶液中和氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。混勻。 （3 3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取0.00 mL0.00 mL、0.05 mL0.05 mL、0.10 mL0.10 mL、0.20 mL0.20 mL、0.40 mL0.40 mL、

9、0.60 mL0.60 mL、0.80 mL 0.80 mL 和和1.00 1.00 mLmL氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（相當(dāng)于氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（相當(dāng)于0.00 0.00 g g、5.00 5.00 g g、10.0 10.0 g g、20.0 20.0 g g、40.0 40.0 g g、60.0 60.0 g g、80.0 80.0 g g和和100.0 100.0 g g氮）氮） ，分別置于，分別置于10 mL10 mL比色管中。加比色管中。加4.0 mL4.0 mL乙酸鈉乙酸鈉- -乙酸乙酸緩沖溶液及緩沖溶液及4.0 mL4.0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻

10、。置于100 100 水浴中加熱水浴中加熱15 min15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm1 cm比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長400 nm400 nm處測量吸光處測量吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算線性回度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)各點(diǎn)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計算線性回歸方程歸方程（4 4）試樣測定：吸?。┰嚇訙y定：吸取0.50 mL0.50 mL2.00 mL2.00 mL（約相當(dāng)于（約相當(dāng)于氮氮100 g100 g）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10 10 mLmL比色管中。

11、加比色管中。加4.0 mL4.0 mL乙酸鈉乙酸鈉- -乙酸緩沖溶液及乙酸緩沖溶液及4.0 mL4.0 mL顯顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100 100 水浴中加熱水浴中加熱15 15 minmin。取出用水冷卻至室溫后，移入。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm1 cm比色杯內(nèi)，以零比色杯內(nèi)，以零管為參比，于波長管為參比，于波長400 nm400 nm處測量吸光度值，試樣吸光度值處測量吸光度值，試樣吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。3 3、結(jié)果計算、結(jié)果計算試樣中蛋白質(zhì)的含量按下式計算：試樣

12、中蛋白質(zhì)的含量按下式計算：式中：式中： XX試樣中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為克每百克（試樣中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，單位為克每百克（g/100gg/100g）；）； cc試樣測定液中氮的質(zhì)量，單位為微克（試樣測定液中氮的質(zhì)量，單位為微克（g g）；）；c0c0試劑空白測定液中氮的質(zhì)量，單位為微克（試劑空白測定液中氮的質(zhì)量，單位為微克（g g）；）；V1V1試樣消化液定容體積，單位為毫升（試樣消化液定容體積，單位為毫升（mLmL）；）；V2V2制備試樣溶液的消化液體積，單位為毫升（制備試樣溶液的消化液體積，單位為毫升（mLmL）；）；V3V3試樣溶液總體積，單位為毫升（試樣溶液總體積，單位為毫升（mLm

13、L）；）； V4V4測定用試樣溶液體積，單位為毫升（測定用試樣溶液體積，單位為毫升（mLmL）；）；mm試樣質(zhì)量，單位為克（試樣質(zhì)量，單位為克（g g）；）； FF氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。024131001000 1000ccFVVmVV ( (三三) ) 快速測定法快速測定法 為滿足生產(chǎn)過程的快速控制分析，減少環(huán)境污染、簡便操為滿足生產(chǎn)過程的快速控制分析，減少環(huán)境污染、簡便操作省時，建立了快速測定方法作省時，建立了快速測定方法 如：雙縮脲法、紫外分光光度法、水楊酸比色法、染料結(jié)合法如：雙縮脲法、紫外分光光度法、水楊酸比色法、染料結(jié)合法 1 1、雙縮脲法、雙縮脲法 （1 1

14、）原理：雙縮脲在堿性條件下，能與硫酸）原理：雙縮脲在堿性條件下，能與硫酸銅銅結(jié)合生成紅紫結(jié)合生成紅紫色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)中含有肽鍵，與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，也呈此反應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比；應(yīng)。在一定條件下其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比；max=560nmmax=560nm可用吸收光度法進(jìn)行比色測定?？捎梦展舛确ㄟM(jìn)行比色測定。 （2 2）測定）測定 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)以采用凱氏定氮法測出蛋白質(zhì)含量的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣，按蛋白質(zhì)含量樣，按蛋白質(zhì)含量4040、5050、606

15、0、7070、8080、9090、100100、110mg110mg稱取稱取樣品樣品8 8份于鈉氏比色管中，各加入份于鈉氏比色管中，各加入1mlCCl1mlCCl4 4（阻滯淀粉、還原糖、（阻滯淀粉、還原糖、色素、類脂物溶解，消除干擾）加入雙縮脲試劑（酒石酸鉀色素、類脂物溶解，消除干擾）加入雙縮脲試劑（酒石酸鉀鈉，鈉，KOH KOH ，CuSO4CuSO4）50.00ml50.00ml振搖均勻（振搖均勻（10min10min）靜置）靜置1h1h，取上，取上層清液離心層清液離心5min5min，再測，再測max=560nmmax=560nm時的時的A A（水作參比）（水作參比） 樣品測定樣品測定

16、 準(zhǔn)確稱取適量樣品，同樣方法測樣品的準(zhǔn)確稱取適量樣品，同樣方法測樣品的A A （3 3）計算）計算 x x 蛋白質(zhì)（）蛋白質(zhì)（）=-=-100100 w w x x從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得蛋白質(zhì)含量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得蛋白質(zhì)含量，mgmg w w測定樣液相當(dāng)樣品質(zhì)量，測定樣液相當(dāng)樣品質(zhì)量，mgmg （4 4）說明）說明 高脂肪樣品，先用醚抽出棄之高脂肪樣品，先用醚抽出棄之 若有不溶物可抽出蛋白質(zhì)后再測若有不溶物可抽出蛋白質(zhì)后再測 2 2、水楊酸比色法、水楊酸比色法 （1 1）原理）原理: : 樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化后轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，與水楊酸樣品中蛋白質(zhì)經(jīng)硫酸消化后轉(zhuǎn)變?yōu)殇@鹽，與水楊酸鈉作用生成藍(lán)色化合物，在

17、鈉作用生成藍(lán)色化合物，在max=660nmmax=660nm處比色測定，求出含氮處比色測定，求出含氮量，計算蛋白質(zhì)量，計算蛋白質(zhì) （2 2）測定）測定: :標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 吸取含氮吸取含氮2.5g/ml2.5g/ml的硫酸銨的硫酸銨 （NHNH4 4）2 2SOSO4 4標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液0 0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、4.04.0、5.0ml5.0ml置于置于25ml25ml容量瓶中，分別加入：空白酸溶液容量瓶中，分別加入：空白酸溶液2ml P76.32ml P76.3（2 2） 、磷酸鹽緩、磷酸鹽緩沖液沖液5ml5ml、加水至、加水至15ml15ml、水楊酸鈉、水楊酸鈉5

18、ml5ml、36363737恒溫水浴恒溫水浴15min15min，加入次氯酸鈉加入次氯酸鈉2.5ml2.5ml，再在，再在36363737恒溫恒溫15min15min，加水至刻度，加水至刻度, , max=660nmmax=660nm測測A A 樣品處理：稱取樣品處理：稱取0.20.21.0g1.0g置于凱氏燒瓶中，置于凱氏燒瓶中，加入加入15ml15ml濃濃H H2 2SOSO4 4，0.5gCuSO0.5gCuSO4 4，4.5g4.5g無水硫酸鈉，小火加熱沸騰無水硫酸鈉，小火加熱沸騰后，進(jìn)行消化，待溶液澄清，呈暗綠色時，冷卻，移至后，進(jìn)行消化，待溶液澄清，呈暗綠色時，冷卻，移至250ml

19、250ml容容量瓶中，定容。樣品測定：吸取樣液量瓶中，定容。樣品測定：吸取樣液5ml5ml（必要時稀釋）以下（必要時稀釋）以下步驟同上步驟同上“標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線”操作操作 （3 3）計算）計算 XkXk含氮量（）含氮量（）= -= -100 蛋（）蛋（）= = 總氮（）總氮（）F F（6.256.25） m m106 X-X-含氮量含氮量gg，k-k-樣品稀釋倍數(shù)，樣品稀釋倍數(shù)，m-m-樣品質(zhì)量，樣品質(zhì)量，g g （4 4）說明：消化樣品，當(dāng)天測定，重現(xiàn)性好）說明：消化樣品，當(dāng)天測定，重現(xiàn)性好. .嚴(yán)格控制反應(yīng)嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度（溫度（36363737）影響顯色影響顯色 （四）氨基酸總量測定（四

20、）氨基酸總量測定 1 1、雙指示劑甲醛滴定法（測定游離氨基酸）、雙指示劑甲醛滴定法（測定游離氨基酸） 有單指示劑滴定法、雙指示劑滴定法有單指示劑滴定法、雙指示劑滴定法 單指示劑有：百里酚酞單指示劑有：百里酚酞, ,酚酞酚酞; ;雙指示劑有：中性紅雙指示劑有：中性紅百里酚酞百里酚酞 其原理均是用甲醛與其原理均是用甲醛與NHNH2 2作用，使堿性消失，再用強(qiáng)堿滴定作用，使堿性消失，再用強(qiáng)堿滴定COOHCOOH R-CH-COOH + 2HCHO R-CH-COOH NH2 N(CH2OH)2 測定：樣品（溶液）（測定：樣品（溶液）（202030mg30mg氨基酸氨基酸+H+H2 2O+3O+3滴中

21、性紅，用滴中性紅，用0.1N NaOH0.1N NaOH滴定至黃橙色滴定至黃橙色 （V V1 1）樣品）樣品+ +中性甲醛中性甲醛+3+3滴百里酚酞，滴百里酚酞，搖，靜搖，靜1min1min，用，用0.1N NaOH0.1N NaOH滴定至淡藍(lán)色滴定至淡藍(lán)色 （V V2 2） 計算：計算： （V V2 2V V1 1）C C0.0140.014 氨基酸態(tài)氮（氨基酸態(tài)氮（% %）= - = - 100100 W W 式中：式中：V V1 1用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉的體用中性紅作指示劑滴定時消耗氫氧化鈉的體積積,V,V2 2用百里酚酞作指示劑滴定時耗氫氧化鈉的體積用百里酚酞作指示劑滴定時

22、耗氫氧化鈉的體積 2 2、電位滴定法、電位滴定法 （1 1）原理：加入甲醛，固定氨基堿性。用酸）原理：加入甲醛，固定氨基堿性。用酸度計指示滴定終點(diǎn)，據(jù)加入甲醛后耗用度計指示滴定終點(diǎn)，據(jù)加入甲醛后耗用NaOHNaOH量量計算蛋白質(zhì)計算蛋白質(zhì) 適用于混濁及色深樣品的直接滴定。適用于混濁及色深樣品的直接滴定。 （2 2）測定：樣液用）測定：樣液用NaOHNaOH滴定至滴定至pH=7.5pH=7.58.28.2 加入中性加入中性2020甲醛后，用甲醛后，用NaOHNaOH滴至滴至pH=9.2pH=9.2 同時作空白試驗同時作空白試驗 （3 3）計算：）計算： 氨基酸（）氨基酸（）= =100014.

23、0)(01稀釋系數(shù)mNVV 3 3、茚三酮比色法、茚三酮比色法 （1 1）原理）原理 氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用生成藍(lán)紫色化合物，物，max=570nmmax=570nm其顏色深淺與氨基酸含量成正比。其顏色深淺與氨基酸含量成正比。 （2 2）測定）測定 準(zhǔn)確吸取準(zhǔn)確吸取100g/ml100g/ml氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00.0、1.01.0、2.02.0、3.03.0、4.04.0、5.05.0、6.0ml6.0ml至比色管中，補(bǔ)加水至相同體至比色管中，補(bǔ)加水至相同體積。加入茚三酮、磷酸緩沖液各積。加入茚三酮、磷酸緩沖液各1ml1ml，水浴中加熱，水浴中加熱15min15min。加水至（或轉(zhuǎn)入容量瓶中）。加水至（或轉(zhuǎn)入容量瓶中）25ml25ml，靜置，靜置15min15min。在在570nm570nm下以空白液為參比液，測下以空白液為參比液，測