菌種的篩選和分離

1、工業(yè)微生物菌種的分離與篩選來源：青島海博 一、微生物工業(yè)對菌種的要求(一)、微生物工業(yè)的生產(chǎn)水平由三個要素決定：生產(chǎn)菌種的性能、發(fā)酵及提純工藝條件、生產(chǎn)設(shè)備。其中生產(chǎn)菌種的性能是最重要的因素。（二）、微生物工業(yè)對菌種的要求是：（1）菌株高產(chǎn)，在較短的時間內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物的能力;（2）在發(fā)酵過程中不產(chǎn)生或少產(chǎn)生與目標產(chǎn)品相近的副產(chǎn)品及其他產(chǎn)物;（3）生長繁殖能力強，較強的生長速率，產(chǎn)孢子的菌種應(yīng)該具有較強的產(chǎn)孢子能力;（4）能夠高效地將原理轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品;（5）能利用廣泛的原材料，并對發(fā)酵原料成分的波動敏感性小;（6）對需要添加的前體物質(zhì)有耐受能力，并且不能將這些前體物質(zhì)作為一般碳源

2、利用;（7）在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的泡沫要少;（8）具有抗噬菌體的能力；（9）遺傳穩(wěn)定性， 二、工業(yè)用微生物菌種的來源及選育（一）微生物菌種的來源一般通過以下幾個途徑收集菌種、采集樣品和分離篩選：（1）是根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；（2）從大自然中采集樣品分離；（3）從一些發(fā)酵制品中分離篩選目的菌株。當前發(fā)酵工業(yè)所用菌種總趨勢是從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌，自然選用轉(zhuǎn)向代謝育種，從誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種。（二）微生物工業(yè)菌種的分離1、野生菌株的分離、篩選過程（1）新菌種分離與篩選的步驟菌種分離的流程如下：標本采集 標本材料的預(yù)處理富集培養(yǎng)菌種初篩 菌

3、種復(fù)篩性能鑒定 菌種保藏 采樣采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。標本預(yù)處理純種分離：采用劃線分離法、稀釋分離法等純化方法獲取單菌落。高產(chǎn)菌株的篩選：這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，獲得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。還要對菌種進行發(fā)酵性能測定，毒性試驗：據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和

4、枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。 2、菌種的分離方法（1）施加選擇性壓力分離法主要是利用不同種類的微生物其生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)的要求不同，如溫度、pH、滲透壓、氧氣、碳源、氮源等，人為控制這些條件，使之利于某類或某種微生物生長，而不利于其他種類微生物的生存，以達到使目的菌種占優(yōu)勢而得以快速分離純化的目的。如可以控制培養(yǎng)時的氧，可將好氧微生物和厭氧微生物分開；通過控制溫度，可將嗜熱微生物和非嗜熱微生物分開；控制pH，可將嗜酸、嗜堿微生物分離等。在分離培養(yǎng)基中也可以加入不同的抗生素或試劑來增加選擇性。如在分離放線菌和細菌時，可加入抗真菌抗

5、生素；分離真菌時，可加入抗細菌藥物。（2）隨機分離方法有些微生物的產(chǎn)物對篩選沒有直接的選擇性指示作用，因此常采用隨機分離方法分離。A、抗生素產(chǎn)生菌的分離抗生素產(chǎn)生菌的分離常用抑菌圈法。實驗必須用工具菌：采用抗生素的敏感菌，傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草桿菌。、抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離抗腫瘤藥物產(chǎn)生菌的分離常用方法：生化誘導(dǎo)法、SOS生色檢測法、DNA修復(fù)能力突變株。原理是利用DNA的損傷，微生物發(fā)生突變。B1、生化誘導(dǎo)法：將大腸桿菌的lacZ基因連接在噬菌體的PL啟動子下，當DNA損傷時，誘發(fā)阻遏物CI分解，PL啟動子啟動lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測藥物的存在

6、。B2、SOS生色檢測法：利用當DNA損傷時，可活化yecA蛋白，進而分解噬菌體的阻遏蛋白，再引起sifA基因啟動lacZ基因轉(zhuǎn)錄，測定表達的ß-半乳糖苷酶活性，來檢測藥物的存在。、生長因子產(chǎn)生菌的分離以氨基酸產(chǎn)生菌為例，介紹篩選方法。首先將待試菌接入加了抗真菌的化合物（如亞胺環(huán)己酮）的分離培養(yǎng)基中生長，然后采用影印法，將菌落復(fù)印到能支持氨基酸產(chǎn)生菌生長的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后，用紫外線殺司長好的菌落，再往此平板上面鋪一層相應(yīng)營養(yǎng)缺陷型菌株菌懸液，培養(yǎng)16小時后，被殺死的氨基酸產(chǎn)生菌的菌落周圍應(yīng)有一檢測菌的生長圈。（3）目的微生物分離A、根據(jù)形態(tài)篩選突變株B、根據(jù)平板菌落生化反應(yīng)篩

7、選變株 透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、渾濁圈法等。透明圈法：在平板培養(yǎng)基中加入溶解性較差的底物，使培養(yǎng)基混濁。能分解底物的微生物便會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，圈的大小初步反應(yīng)該菌株利用底物的能力。該法在分離水解酶產(chǎn)生菌時采用較多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶產(chǎn)生菌都會在含有底物的選擇性培養(yǎng)基平板上形成肉眼可見的透明圈。 在分離某種產(chǎn)生有機酸的菌株時，也通常采用透明圈法進行初篩。在選擇性培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，使平板成混狀，將樣品懸浮液涂抹到平板上進行培養(yǎng)，由于產(chǎn)生菌能夠把菌落周圍的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈，可以輕易地鑒別出來。分離乳酸產(chǎn)生菌時，由于乳酸是一種較強的有機酸，因此，在培養(yǎng)

8、基中加入的碳酸鈣不僅有鑒別作用，還有酸中和作用。 變色圈法：對于一些不易產(chǎn)生透明圈產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，可在底物平板中加入指示劑或顯色劑，使所需微生物能被快速鑒別出來。如篩選果膠酶產(chǎn)生菌時，用含0.2%果膠為惟一碳源的培養(yǎng)基平板，對含微生物樣品進行分離，待菌落長成后，加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便會出現(xiàn)絳紅色水解圈。在分離谷氨酸產(chǎn)生菌時，可在培養(yǎng)基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6.27.6，當pH在6.2以下時為黃色，pH7.6以上為藍色。若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可以從這些產(chǎn)酸菌中篩選谷氨酸產(chǎn)生菌。 生長圈法：生

9、長圈法通常用于分離篩選氨基酸、核苷酸和維生素的產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養(yǎng)物的平板上進行培養(yǎng)，若某菌株能合成平板所需的營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍便會形成一個混濁的生長圈。如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（如E.coliP264）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。 抑菌圈法：常用于抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被檢菌能分泌某些抑制菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，很容易被鑒別出來。實驗十從自然界中分離篩選微生物菌種

10、60;1 目的（1）學(xué)習(xí)并掌握優(yōu)良曲霉菌的分離原理和方法。（2）學(xué)習(xí)工掌握酸乳中乳酸菌的分離原理和方法。2 原理從自然界中分離篩選微生物菌種，是我們獲得優(yōu)良新菌種最基本、最主要的方法，因此，食品工業(yè)菌種的分離篩選是一項重要的、長期而繁重的工作。自然界存在著各種各樣的微生物，尤其是土壤中微生物種類齊全，是微生物的大本營。因此可以從土壤中分離到幾乎所有微生物。另外，不同的自然界環(huán)境中生存的微生物優(yōu)勢菌種也不同。各種食品、農(nóng)副產(chǎn)品等營養(yǎng)組成不同，從中可以分離出不同的微生物。食品工業(yè)菌種常用的分離源有被污染的生產(chǎn)或科研菌種、生產(chǎn)中長期使用的菌種、發(fā)酵食品用菌種、動物腸道菌群、經(jīng)各種

11、育種方法處理過的微生物材料和自然界菌種樣品。自然界的微生物是混雜生存的，要從中分理出一種微生物，不僅需要考慮分離源應(yīng)含有較多數(shù)量的目的菌，還要在分離操作中使之與其他菌種相互分開。對于樣品中含量較低的菌處，要針對其生物學(xué)特點合理設(shè)計分離方法，如富集培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、利用其特殊的生理反應(yīng)產(chǎn)生特定的生長現(xiàn)象等，以便于從大量雜菌中選出目的菌種。從混雜群體中分離特定微生物的常用方法有：控制分離培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、控制培養(yǎng)基的pH值、添加抑制劑、控制培養(yǎng)溫度、控制空氣條件、對樣品進行特殊處理等。常用的純種分離方法有平板劃線分離法、簡單平板分離法、稀釋分離、涂布分離法、毛細管分離法、顯微操作單細胞分離法等。本實

12、驗將采用稀釋法和涂布法對目的微生物進行分離篩選。優(yōu)良曲霉菌的分離采用透明圈法，即先用淀粉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)樣品，由于糖化酶的作用，長出的菌落周圍的淀粉被水解，遇碘后呈無色透明圈而平板的其他處呈藍色。一般來講，透明圈的直徑越大，該菌的糖化力越強?？筛鶕?jù)透明圈的大小篩選出糖化力強的菌株。酸乳中乳酸菌的分離采用溴甲酚綠（BCG）牛乳營養(yǎng)瓊脂平板分離法。溴甲酚綠指示劑在酸性環(huán)境中呈黃色，在堿性環(huán)境中呈藍色。在分離培養(yǎng)基（pH6.8）中加處溴酚綠指示劑后呈藍綠色，乳酸菌在該培養(yǎng)基中生長并分解乳糖，產(chǎn)生乳酸，使菌落呈黃色，菌落周圍的培養(yǎng)基也變?yōu)辄S色。乳酸可用紙上層析法鑒別。3 材料3.1 

13、樣品黑曲霉種曲、酸奶。3.2 器具及其他用品平皿、三角瓶、涂布器、試管、玻璃珠、紗布。3.3 培養(yǎng)基及試劑2%淀粉察氏培養(yǎng)基、BCG牛乳培養(yǎng)基、0.02mol/L碘液、10%牛乳培養(yǎng)基、無菌生理鹽水。4 流程4.1 優(yōu)良糖化酶菌株的分離與篩選融化培養(yǎng)基倒平板打散孢子團粒梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察滴加碘液挑菌落接種培養(yǎng)糖化酶活力測定菌種保存4.2 酸乳制品中的乳酸菌的分離制培養(yǎng)基倒平板梯度稀釋涂布平板培養(yǎng)觀察挑菌落接牛乳管培養(yǎng)觀察傳代培養(yǎng)挑選凝乳管乳酸測定菌種保存5 步驟5.1 優(yōu)良糖化酶菌株的分離與篩選（1）融化淀粉察氏培養(yǎng)基

14、，稍冷后倒平板與斜面數(shù)個。（2）取種曲少許，加入10mL帶玻璃球的無菌生理鹽水的三角瓶中，用力振蕩打散孢子團粒，使之形成均勻的孢子懸浮粒。然后將其用無菌紗布過濾于無菌試管中。（3）將上述濾液以10倍稀釋法知釋至10-7，取后3個稀釋度的稀釋液各0.2mL，于淀粉察氏培養(yǎng)基平板上用無菌涂布器分別依次涂布2至3個皿，30培養(yǎng)12d。（5）性能測定：測定各菌落的糖化酶活力。5.2 酸乳制品中的乳酸菌的分離（1）制備BCG牛乳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。稱取脫脂奶粉10g，溶于50mL水中，加入1.6%溴甲酚綠酒精溶液0.07mL，0.075MPa壓力下滅菌20min。另取瓊脂2g，溶于50mL水中，加酵母膏1g，溶解后調(diào)pH值至6.8，0.1MPa壓力下滅菌20min。趁熱將上述兩液以無菌操作混合均勻，倒平板6個，待凝固后，置37培養(yǎng)24h，若無雜菌生長，即可使用。（2）將樣品以10倍稀釋法稀釋至10-7，取其中10-7、10-6 2個稀釋度的稀釋液各0.10.2mL，分別置于上述各營養(yǎng)平板上，用無菌涂布器依次涂布2至3個皿，置43培養(yǎng)48h，如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基亦為黃色者初步定為乳酸菌。（3）將典型菌