第14章 遺傳病的診斷

1、 遺傳病診斷包括：遺傳病診斷包括： 現(xiàn)癥患者診斷現(xiàn)癥患者診斷 癥狀前診斷癥狀前診斷 產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷 （植入前診斷）（植入前診斷） 例如：假肥大型肌營養(yǎng)不良（例如：假肥大型肌營養(yǎng)不良（DMDDMD）約有）約有1/31/3的病例為新的基因突變引起的。一般認(rèn)為的病例為新的基因突變引起的。一般認(rèn)為是由于患者母親卵子形成過程中是由于患者母親卵子形成過程中X X染色體上染色體上DMDDMD基因突變所致。基因突變所致。 對系譜的分析要注意區(qū)別對系譜的分析要注意區(qū)別： 1. 1.孟德爾遺傳病孟德爾遺傳病 包括包括ADAD遺傳病、遺傳病、ARAR遺傳病、遺傳病、XDXD遺傳病、遺傳病、XRXR遺傳遺傳病、病、

2、YLYL疾病等。疾病等。 系譜分析對這類疾病的分析非常有用，分析時系譜分析對這類疾病的分析非常有用，分析時要考慮到某些疾病的遺傳異質(zhì)性、不規(guī)則外顯、外要考慮到某些疾病的遺傳異質(zhì)性、不規(guī)則外顯、外顯不全和延遲顯性等情況，可能會造成一些臨床假顯不全和延遲顯性等情況，可能會造成一些臨床假象，由于遺傳的異質(zhì)性可能將不同的遺傳病誤認(rèn)為象，由于遺傳的異質(zhì)性可能將不同的遺傳病誤認(rèn)為同一種遺傳病進(jìn)行分析。同一種遺傳病進(jìn)行分析。 三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 （三）（三）染色體原位雜交染色體原位雜交 四、生物化學(xué)檢查四、生物化學(xué)檢查 單基因遺傳病往往是由于基因突變導(dǎo)致酶單基因遺傳病往往是由于基因突變導(dǎo)致

3、酶和蛋白質(zhì)的改變或缺如，使一些器官的發(fā)育和和蛋白質(zhì)的改變或缺如，使一些器官的發(fā)育和正常的代謝發(fā)生改變，并在臨床上表現(xiàn)出一系正常的代謝發(fā)生改變，并在臨床上表現(xiàn)出一系列癥狀。列癥狀。 因此，酶和蛋白質(zhì)的定性和定量分析可反因此，酶和蛋白質(zhì)的定性和定量分析可反映基因結(jié)構(gòu)的改變，是診斷單基因病的主要方映基因結(jié)構(gòu)的改變，是診斷單基因病的主要方法之一，由于主要采用生化手段故稱之為生物法之一，由于主要采用生化手段故稱之為生物化學(xué)檢查?；瘜W(xué)檢查。 一、產(chǎn)前診斷的適應(yīng)征一、產(chǎn)前診斷的適應(yīng)征二、產(chǎn)前診斷的方法二、產(chǎn)前診斷的方法 儀器診斷儀器診斷 包括：包括：X X線檢查線檢查 超聲波檢查超聲波檢查 胎兒鏡檢查胎兒鏡

4、檢查 細(xì)胞學(xué)方法（染色體檢查；染色質(zhì)檢查）細(xì)胞學(xué)方法（染色體檢查；染色質(zhì)檢查） 生化方法（蛋白質(zhì)或酶檢查；代謝產(chǎn)物檢查）生化方法（蛋白質(zhì)或酶檢查；代謝產(chǎn)物檢查） 分子生物學(xué)方法（基因分析）分子生物學(xué)方法（基因分析） 利用限制酶酶切技術(shù)、分子雜交技術(shù)、利用限制酶酶切技術(shù)、分子雜交技術(shù)、PCRPCR技術(shù)技術(shù)等分子生物學(xué)手段，對羊水細(xì)胞、絨毛或其他胎兒組等分子生物學(xué)手段，對羊水細(xì)胞、絨毛或其他胎兒組織中提取的織中提取的DNADNA進(jìn)行基因診斷。進(jìn)行基因診斷。 三、產(chǎn)前診斷的標(biāo)本及采集技術(shù)三、產(chǎn)前診斷的標(biāo)本及采集技術(shù)可用于檢測的標(biāo)本：可用于檢測的標(biāo)本： 羊水上清液、羊水細(xì)胞羊水上清液、羊水細(xì)胞 絨毛絨

5、毛 臍帶血、孕婦外周血中胎兒細(xì)胞臍帶血、孕婦外周血中胎兒細(xì)胞 孕婦血清和尿液孕婦血清和尿液 受精卵、胚胎組織受精卵、胚胎組織 羊膜穿刺術(shù)羊膜穿刺術(shù)（amniocentesisamniocentesis） 羊膜穿刺術(shù)一般在妊娠羊膜穿刺術(shù)一般在妊娠16161818周時進(jìn)行。因周時進(jìn)行。因?yàn)榇藭r羊水量多、胎兒浮動，穿刺時容易進(jìn)針，為此時羊水量多、胎兒浮動，穿刺時容易進(jìn)針，且不易傷及胎兒。取材最好是在且不易傷及胎兒。取材最好是在B B超監(jiān)視下進(jìn)行。超監(jiān)視下進(jìn)行。 絨毛吸取術(shù)絨毛吸取術(shù) 臍帶穿刺術(shù)臍帶穿刺術(shù)（cordocentesiscordocentesis） 臍帶穿刺術(shù)可在臍帶穿刺術(shù)可在B B超監(jiān)視

6、下進(jìn)行。用一細(xì)針超監(jiān)視下進(jìn)行。用一細(xì)針經(jīng)孕婦腹壁進(jìn)入胎兒的臍帶，抽取胎兒臍靜脈血。經(jīng)孕婦腹壁進(jìn)入胎兒的臍帶，抽取胎兒臍靜脈血。 一般在孕中期（妊娠一般在孕中期（妊娠1818周）進(jìn)行。周）進(jìn)行。 臍血可作染色體或血液學(xué)各種檢查，亦可用臍血可作染色體或血液學(xué)各種檢查，亦可用于因羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗、于因羊水細(xì)胞培養(yǎng)失敗、DNADNA分析無法診斷而能分析無法診斷而能用胎兒血漿或血細(xì)胞進(jìn)行生化檢測的疾病、或在用胎兒血漿或血細(xì)胞進(jìn)行生化檢測的疾病、或在錯過絨毛和羊水取樣時機(jī)時進(jìn)行。錯過絨毛和羊水取樣時機(jī)時進(jìn)行。 孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞分離孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞分離 孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞是一項(xiàng)非創(chuàng)傷性產(chǎn)孕婦

7、外周血分離胎兒細(xì)胞是一項(xiàng)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)，并易于被孕婦接受。孕婦外周血中前診斷技術(shù)，并易于被孕婦接受。孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞至少有的胎兒細(xì)胞至少有3 3種，即滋養(yǎng)葉細(xì)胞、有核紅種，即滋養(yǎng)葉細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。 目前許多學(xué)者都致力于解決胎兒細(xì)胞的識別、目前許多學(xué)者都致力于解決胎兒細(xì)胞的識別、富集和如何排除母血的富集和如何排除母血的“污染污染”等。此方法將以等。此方法將以簡便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)在遺傳病的預(yù)防中發(fā)揮作用。簡便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)在遺傳病的預(yù)防中發(fā)揮作用。 植入前診斷是利用微操作技術(shù)和植入前診斷是利用微操作技術(shù)和DNADNA擴(kuò)增技擴(kuò)增技術(shù)對胚泡植入前進(jìn)行檢測。術(shù)對胚泡植入

8、前進(jìn)行檢測。 植入前遺傳學(xué)診斷植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantationpreimplantation genetic genetic diagnosis,PGDdiagnosis,PGD） 是指用分子或細(xì)胞是指用分子或細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)對體外受精遺傳學(xué)技術(shù)對體外受精的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，確定正常后再將胚胎植確定正常后再將胚胎植入子宮。入子宮。 獲得植入前胚胎的主要方法：獲得植入前胚胎的主要方法： 子宮沖洗子宮沖洗 體外授精體外授精 植入前診斷的基本技術(shù)：植入前診斷的基本技術(shù)： （1 1） 胚胎組織微活檢：胚胎組織微活檢： 目前多采用在目前多采用在6 68 8個細(xì)胞期，

9、通過顯微操個細(xì)胞期，通過顯微操作技術(shù)取出作技術(shù)取出1 12 2個細(xì)胞進(jìn)行染色體或基因的檢個細(xì)胞進(jìn)行染色體或基因的檢查。查。 （2 2） PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： 單細(xì)胞單細(xì)胞PCRPCR技術(shù)主要用于單基因遺傳病的診技術(shù)主要用于單基因遺傳病的診斷。采用引物延伸預(yù)擴(kuò)增技術(shù)，以隨機(jī)引物對斷。采用引物延伸預(yù)擴(kuò)增技術(shù)，以隨機(jī)引物對單個細(xì)胞單個細(xì)胞，使單個細(xì)胞，使單個細(xì)胞的多位點(diǎn)分析成為可能。熒光的多位點(diǎn)分析成為可能。熒光PCRPCR也是常用的技也是常用的技術(shù)。術(shù)。 （3 3） FISHFISH技術(shù)：技術(shù)： 該技術(shù)利用熒光標(biāo)記的特定探針與固定在該技術(shù)利用熒光標(biāo)記的特定探針與固定在玻片上的卵裂球細(xì)胞核進(jìn)行雜

10、交，在顯微鏡下玻片上的卵裂球細(xì)胞核進(jìn)行雜交，在顯微鏡下鑒定鑒定。第四節(jié)第四節(jié) 基因診斷基因診斷 （gene diagnosisgene diagnosis） （一）基因診斷的基本技術(shù)（一）基因診斷的基本技術(shù) 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(PCR)技術(shù)技術(shù) DNADNA序列測定技術(shù)序列測定技術(shù) 基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù) 1. 1.分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù) （molecular hybridizationmolecular hybridization） 原理：雙鏈原理：雙鏈DNADNA在加熱到一定溫度以上或在在加熱到一定溫度以上或在堿性溶液中會變性成為兩條單鏈，

11、互補(bǔ)的兩條堿性溶液中會變性成為兩條單鏈，互補(bǔ)的兩條DNADNA單鏈在一定條件下結(jié)合成為雙鏈。即能夠進(jìn)單鏈在一定條件下結(jié)合成為雙鏈。即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNADNA和和DNADNA之間進(jìn)之間進(jìn)行，也能在行，也能在DNADNA和和RNARNA之間進(jìn)行。之間進(jìn)行。 因此因此 ，當(dāng)一段已知基因的核酸序列作為探，當(dāng)一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈針，與變性后的單鏈DNADNA接觸時，如果兩者的堿接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而基完全配對，它們即

12、互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組表明被測基因組DNADNA中含有已知的基因序列。中含有已知的基因序列。 基因探針基因探針（probe）：）： 是一段帶有標(biāo)記的，與待測基因有關(guān)的是一段帶有標(biāo)記的，與待測基因有關(guān)的核酸序列。核酸序列。 探針探針 基因組探針基因組探針（genomic probe） cDNAcDNA探針探針（cDNA probe） 寡核苷酸探針寡核苷酸探針（oligonucleotide probe） 雜交方法：雜交方法： 斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交 Southern Southern雜交雜交 Northern Northern雜交雜交 Western Western印跡雜交印跡雜交 原位

13、雜交原位雜交 寡核苷酸探針雜交寡核苷酸探針雜交(1)(1)斑點(diǎn)雜交法斑點(diǎn)雜交法 又稱等位基因特異的寡核苷酸又稱等位基因特異的寡核苷酸(ASO(ASO) )探針雜探針雜交。交。 用人工合成的用人工合成的2020個堿基左右長度的個堿基左右長度的ASOASO探針，探針，一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。 將待測的細(xì)胞或?qū)⒋郎y的細(xì)胞或DNADNA直接點(diǎn)在硝酸纖維膜或直接點(diǎn)在硝酸纖維膜或尼龍膜上，將標(biāo)記有同位素（或其他標(biāo)記）的變尼龍膜上，將標(biāo)記有同位素（或其他標(biāo)記）的變性探針與其進(jìn)行雜交，通過放射自顯影，判斷受性探針與其進(jìn)行雜交，通過放射自顯影，判斷受檢基因

14、的有無以及基因的拷貝數(shù)，進(jìn)行基因診斷。檢基因的有無以及基因的拷貝數(shù)，進(jìn)行基因診斷。 （6 6）WesternWestern印跡雜交印跡雜交（Western blotting） 是在蛋白質(zhì)水平檢測或研究基因表達(dá)與功是在蛋白質(zhì)水平檢測或研究基因表達(dá)與功能的一種方法。能的一種方法。 Western Western印跡雜交又稱免疫印跡，由細(xì)胞提印跡雜交又稱免疫印跡，由細(xì)胞提取蛋白質(zhì)并按其大小分類。一般通過聚丙烯酰取蛋白質(zhì)并按其大小分類。一般通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得，電泳后分類的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移胺凝膠電泳獲得，電泳后分類的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移（即印跡）于硝酸纖維素膜上而后暴露于特異（即印跡）于硝酸纖維素膜上而后暴

15、露于特異的抗體，產(chǎn)生抗原抗體的特異性結(jié)合，從而檢的抗體，產(chǎn)生抗原抗體的特異性結(jié)合，從而檢測待檢蛋白質(zhì)的含量、分子量大小等。測待檢蛋白質(zhì)的含量、分子量大小等。 染色體原位雜交是應(yīng)用標(biāo)記的特異性染色體原位雜交是應(yīng)用標(biāo)記的特異性DNADNA探探針與玻片上的細(xì)胞中期染色體或間期核的針與玻片上的細(xì)胞中期染色體或間期核的DNADNA進(jìn)進(jìn)行檢測。行檢測。 熒光原位雜交技術(shù)使用熒光原位雜交技術(shù)使用熒光素標(biāo)記核酸探針，以檢熒光素標(biāo)記核酸探針，以檢測探針和分裂中期的染色體測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質(zhì)的雜交?；蚍至验g期的染色質(zhì)的雜交。 2. 2.聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase cha

16、in polymerase chain reactionreaction，PCRPCR） 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在體外迅速的選擇擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在體外迅速的選擇擴(kuò)增特定的靶特定的靶DNADNA的方法。又稱體外的方法。又稱體外DNADNA克隆技術(shù)。克隆技術(shù)。 （1 1）按靶）按靶DNADNA片段的片段的5 5和和3 3端的堿基順序各合端的堿基順序各合成兩條引物（長約成兩條引物（長約2020個堿基的寡核苷酸）；個堿基的寡核苷酸）； （2 2）將待測）將待測DNADNA變性后，加入四種單核苷變性后，加入四種單核苷 （dNTPdNTP），），引物和耐熱引物和耐熱DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTa

17、q 酶）；酶）； （3 3）反應(yīng)液進(jìn)）反應(yīng)液進(jìn)行熱循環(huán)，每一周行熱循環(huán)，每一周期經(jīng)過變性（期經(jīng)過變性（92929595），），（40406060）和）和（65657272）三個階段產(chǎn)生倍增三個階段產(chǎn)生倍增的的DNADNA。一般進(jìn)行一般進(jìn)行20204040個周期。個周期。 PCR-ASO PCR-ASO PCR-RFLPPCR-RFLP RT-PCR RT-PCR 多重多重PCR PCR PCR-SSCP PCR-SSCP PCR-DGGE PCR-DGGE 定量定量PCRPCR （2 2）PCR-RFLPPCR-RFLP （PCR-PCR-限制性片段長度多態(tài)性連鎖分析）限制性片段長度多態(tài)性連鎖

18、分析） （3)RT-PCR(3)RT-PCR(反反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄PCRPCR）從組織中提取總從組織中提取總RNARNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNAcDNA，再以再以cDNAcDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。為模板，擴(kuò)增合成目的片段。 可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中RNARNA病毒的含量和直接克隆特定基因的病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNAcDNA序序列。列。 (4)(4)多重多重PCRPCR 1 2 3 4 5a b1 1：正常人：正常人 2,4,5 2,4,5：純合體患者：純合體患者 3 3：雜合體：雜合體(2(2的弟弟的弟弟) )左為泳動

19、變位模式：左為泳動變位模式：a a 正常人；正常人；b b 純合體患者純合體患者PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC (6)PCR-DGGE (6)PCR-DGGE （PCRPCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳） MaxanMaxan和和GilbertGilbert首先建立了化學(xué)方法，首先建立了化學(xué)方法，SangerSanger建立了建立了DNADNA測序的酶學(xué)方法。測序的酶學(xué)方法。 最新的最新的DNADNA自動測序法以不同熒光色素標(biāo)自動測序法以不同熒光色素標(biāo)記的四種不同脫氧核苷酸為原料進(jìn)行酶促合成記的四種不同脫氧核苷酸為原料進(jìn)行酶促合成反應(yīng)，經(jīng)過凝膠電泳分離，應(yīng)用激

20、光分析及計(jì)反應(yīng)，經(jīng)過凝膠電泳分離，應(yīng)用激光分析及計(jì)算機(jī)處理就能直接讀出堿基順序。極大地推進(jìn)算機(jī)處理就能直接讀出堿基順序。極大地推進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的進(jìn)程，了生命科學(xué)的發(fā)展和人類基因組計(jì)劃的進(jìn)程，而且測序的長度可以達(dá)到而且測序的長度可以達(dá)到1000bp1000bp以上。以上。 DNADNA測序（測序（DNA Sequencing) )是檢測未知突變是檢測未知突變和已知突變基因的最基本和最重要的實(shí)驗(yàn)手段。和已知突變基因的最基本和最重要的實(shí)驗(yàn)手段。 基因芯片技術(shù)是近年基因芯片技術(shù)是近年來發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、來發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測技術(shù)。其高通量分子檢測技術(shù)。其基本原理

21、是核酸雜交，其基本過程是將許多基本原理是核酸雜交，其基本過程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，形成矩陣點(diǎn)。有規(guī)律地排列固定于支持物上，形成矩陣點(diǎn)?，F(xiàn)在的技術(shù)可以做到在現(xiàn)在的技術(shù)可以做到在1cm1cm2 2上排列成千上萬上排列成千上萬個個“點(diǎn)點(diǎn)”。 4. 4.基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)(gene chip) (gene chip) 樣品樣品DNA/RNADNA/RNA通過通過PCRPCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進(jìn)行摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對原理進(jìn)行雜交，再通過熒光

22、檢測系統(tǒng)等雜交，再通過熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描，并配對芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一探以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號做出比針上的熒光信號做出比較和檢測，得出所要的較和檢測，得出所要的信息。信息。 （二）基因診斷的途經(jīng)（二）基因診斷的途經(jīng) 1. 1.直接診斷直接診斷 檢測突變基因檢測突變基因 直接診斷是直接檢測致病突變的基因。它直接診斷是直接檢測致病突變的基因。它通常使用基因本身或緊鄰的通常使用基因本身或緊鄰的DNADNA序列作為探針，序列作為探針，或通過或通過PCRPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無突變、缺失擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適等異常

23、及其性質(zhì)，這稱為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病。用已知基因異常的疾病。 當(dāng)致病基因的某種突變類型與發(fā)病有直當(dāng)致病基因的某種突變類型與發(fā)病有直接的因果關(guān)系接的因果關(guān)系, ,或者對致病基因以及分子機(jī)或者對致病基因以及分子機(jī)制已完全了解制已完全了解, ,或者對致病基因以及分子機(jī)或者對致病基因以及分子機(jī)制部分了解但已知其中規(guī)律制部分了解但已知其中規(guī)律, ,可應(yīng)用此途徑?？蓱?yīng)用此途徑。 2. 2. 間接診斷間接診斷 基因連鎖分析基因連鎖分析 當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或突變類型較多時；或致病基因本身尚屬未知時，突變類型較多時；或致病基因本身尚屬未知時，

24、但被檢測基因有緊密連鎖的但被檢測基因有緊密連鎖的DNADNA多態(tài)標(biāo)記，可以多態(tài)標(biāo)記，可以通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷通過對受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。 連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種連鎖分析多使用基因組中廣泛存在的各種DNADNA多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多多態(tài)性位，特別是基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記。態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記。RFLPRFLP、VNTRVNTR、SSCPSSCP、AMPAMPFLPFLP等技術(shù)均可用于連鎖分析。等技術(shù)均可用于連鎖分析。 （三）基因診斷的方法選擇：（三）基

25、因診斷的方法選擇： 各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類型。根據(jù)對基體可分為基因缺失和突變兩大類型。根據(jù)對基因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。因異常類型的了解，可以采用不同的診斷方法。 遺傳的基因診斷方法遺傳的基因診斷方法基因異常基因異常 方法方法 探針、引物或限制酶探針、引物或限制酶基因缺失基因缺失 基因組基因組DNADNA印跡雜交印跡雜交 缺失基因的探針缺失基因的探針 PCRPCR擴(kuò)增擴(kuò)增 引物包括缺失或在缺失部位內(nèi)引物包括缺失或在缺失部位

26、內(nèi)點(diǎn)突變點(diǎn)突變 RFLPRFLP分析分析 突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶 ASO ASO雜交雜交 正常和異常的正常和異常的ASOASO探針探針 PCRPCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析產(chǎn)物的多態(tài)性分析 引物包括突變部位引物包括突變部位 （RFLPRFLP、SSCPSSCP、DGGEDGGE）基因已知基因已知 基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性 基因內(nèi)或旁基因內(nèi)或旁但異常不明但異常不明 （RFLPRFLP、 SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP） 側(cè)序列探針或引物側(cè)序列探針或引物 連鎖分析連鎖分析 基因未知基因未知 與疾病連鎖的多態(tài)性，與疾病連鎖的多態(tài)性， 與疾病連

27、鎖的多態(tài)與疾病連鎖的多態(tài) 如如SSCPSSCP、AMP-FLPAMP-FLP連鎖分析，連鎖分析， 位點(diǎn)探針或引物位點(diǎn)探針或引物 RFLPRFLP位點(diǎn)單體型連鎖分析位點(diǎn)單體型連鎖分析 （三）基因診斷在遺傳病診斷中的應(yīng)用（三）基因診斷在遺傳病診斷中的應(yīng)用 1. 1.對單基因病的基因診斷對單基因病的基因診斷 （1 1）點(diǎn)突變型遺傳病的基因診斷點(diǎn)突變型遺傳病的基因診斷 Normal probeMutation probe（acatalasemiaacatalasemia) ) 是一種常染色體隱性遺傳病，患者過氧化氫酶活是一種常染色體隱性遺傳病，患者過氧化氫酶活性只有正常人的性只有正常人的0.2%0.2

28、%0.4%0.4%，雜合體血液中過氧化氫，雜合體血液中過氧化氫酶活性則處于中間水平。過氧化氫酶基因由酶活性則處于中間水平。過氧化氫酶基因由1313個外顯個外顯子和子和1212個內(nèi)含子組成。個內(nèi)含子組成。應(yīng)用應(yīng)用32P32P標(biāo)記標(biāo)記PCRPCR反應(yīng)中底物反應(yīng)中底物方法，擴(kuò)增第方法，擴(kuò)增第4 4個外顯子和內(nèi)個外顯子和內(nèi)含子附近的含子附近的203bp203bp片段，應(yīng)用片段，應(yīng)用SSCPSSCP法可清楚地判斷患者和法可清楚地判斷患者和雜合體。雜合體。 aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/-14kb10kb10kb 4kbBamH IBamH I左側(cè)：左側(cè)：1616號染色體上攜有數(shù)目不同的

29、基因號染色體上攜有數(shù)目不同的基因右側(cè)：右側(cè)：a a基因探針雜交的結(jié)果基因探針雜交的結(jié)果1) - -地貧基因缺失的診斷地貧基因缺失的診斷正常正常貧血貧血癥狀癥狀攜帶攜帶者者HbH（2 2）基因缺失型遺傳病的診斷）基因缺失型遺傳病的診斷2) DMD2) DMDBMDBMD的缺失型診斷：的缺失型診斷： 以苯丙酮尿癥以苯丙酮尿癥( PKU )( PKU )的基因診斷為例。的基因診斷為例。 PAHPAH基因基因SphSph切點(diǎn)切點(diǎn) SphSph酶對酶對PKUPKU的的RFLPRFLP分析分析 示意圖示意圖 A.A.系譜；系譜；B.RFLPB.RFLP圖圖 一個一個PKUPKU家系的家系的 DMD家系家系單體型單體型分析分析圖解圖解PKU，AR1 21 2