貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同課件

1、 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)(shyn)三、細(xì)胞的傳代與凍存三、細(xì)胞的傳代與凍存第一頁，共二十頁。l1. 1.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？l2.2.使用使用(shyng)(shyng)血清需注意哪些方面？血清需注意哪些方面？l3.3.消化液胰酶的濃度是多少？消化液胰酶的濃度是多少？l4.4.使用小濾器過濾要注意哪些？使用小濾器過濾要注意哪些？第二頁，共二十頁。 針頭濾器針頭濾器(lq)(lq)使用應(yīng)注意的問題使用應(yīng)注意的問題 1. 1.擰緊濾器擰緊濾器 2.2.注射器吸液體注射器吸液體 3.3.注射器插好濾器注射器插好濾器 4.4.對(duì)著燒杯慢推壓針芯看是否漏對(duì)著燒杯慢推壓針芯看是否漏 5

2、.5.如不漏對(duì)小瓶過濾。如不漏對(duì)小瓶過濾。 6.6.濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)濾器放在小瓶瓶口上，取下針頭再吸液體，反復(fù)屢次，濾完。屢次，濾完。 7.7.檢查濾器濾膜是否完好。檢查濾器濾膜是否完好。第三頁，共二十頁。一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理(yunl)(yunl) 細(xì)胞貼壁過程細(xì)胞貼壁過程第四頁，共二十頁。培養(yǎng)細(xì)胞一代(y di)生長過程第五頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同 什么什么(shn me)(shn me)時(shí)候傳代？時(shí)候傳代？第六頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同第七頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同 細(xì)胞消化細(xì)胞

3、消化(xiohu)(xiohu)的最正確程度的最正確程度第八頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同 細(xì)胞凍存細(xì)胞凍存要求要求凍存條件凍存條件(tiojin)(tiojin)操作要點(diǎn)操作要點(diǎn) 第九頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無菌操作技術(shù)。 掌握傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的一般方法與步驟。 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)(xngti)和生長狀況。第十頁，共二十頁。三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1. 1. 細(xì)胞細(xì)胞 人宮頸癌人宮頸癌HeLa HeLa 細(xì)胞細(xì)胞 人胃癌人胃癌BGC-823BGC-823細(xì)胞細(xì)胞2.

4、 2. 試劑試劑 胰酶、DMEM培養(yǎng)基、血清、DMSO、抗生素 3. 3. 儀器儀器 超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管(shgun)，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈 第十一頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 1.準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)紫外線處理準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)紫外線處理3030分鐘分鐘, , 用肥皂洗手用肥皂洗手, , 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 2. 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要

5、稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)(piyng)(piyng)用液置用液置室溫下預(yù)熱。室溫下預(yù)熱。3 3關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈, , 翻開可見光燈開關(guān)翻開可見光燈開關(guān), ,翻開抽風(fēng)翻開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用75%75%酒精擦雙手消毒酒精擦雙手消毒 。 4.4.正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、酒精棉球、正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒頭、吸管筒新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒頭、吸管筒頭、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試劑：頭、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試劑：DMEMDMEM培養(yǎng)基其中血清含量

6、培養(yǎng)基其中血清含量10%10%、 血清、胰酶血清、胰酶等。等。第十二頁，共二十頁。第十三頁，共二十頁。5.點(diǎn)燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6.將培養(yǎng)用液90mL) 瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7. 翻開血清10.5mL) 瓶，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8. 無菌吸取10mL血清參加到培養(yǎng)液90mL)中，用微量移液器參加雙抗100L輕輕混勻，配置(pizh)完全培養(yǎng)基。9. 在血清中剩余0.5mL) 參加4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，參加0.5mL DMSO凍存保護(hù)劑，輕輕混勻即為凍存液 。

7、第十四頁，共二十頁。第十五頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同10.細(xì)胞(xbo)瓶口靠近火焰翻開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對(duì)于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細(xì)胞，棄胰酶，再參加一滴管或兩滴管胰酶以蓋住細(xì)胞量為準(zhǔn)，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個(gè)細(xì)胞層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化狀態(tài)，待細(xì)胞大局部收縮、突起、一半變圓，細(xì)胞邊界清晰時(shí)，即可立起或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺(tái)內(nèi)靠近火焰處棄胰酶第十六頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同13. 加兩滴管約1.8-2mL凍存液既全面吹打細(xì)胞瓶壁,吹

8、打均勻，細(xì)胞濃度宜大，3106個(gè)/mL左右。將細(xì)胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標(biāo)記(bioj)好細(xì)胞種類，凍存時(shí)間，保存條件以及凍存者姓名等懸浮細(xì)胞凍存將細(xì)胞離心后再加凍存液在培養(yǎng)瓶(剩余少量細(xì)胞中參加5mL完全培養(yǎng)及，蓋好瓶蓋擰緊后并旋回半圈。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。凍存管在4度以下存放30min，轉(zhuǎn)放到20度 1.52h，再轉(zhuǎn)到70度412h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)，注意做好凍存記錄。第十七頁，共二十頁。把握好傳代時(shí)機(jī)，80-90%集合度階段最好，過早細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳消化時(shí)間要適度，過短細(xì)胞不易脫落，過長細(xì)胞可脫落流失。消化液濃度

9、(nngd)要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反響快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。不同細(xì)胞對(duì)消化反響不同。 貼壁不牢直接吹下細(xì)胞損傷本卷須知本卷須知第十八頁，共二十頁。1. 1.試述傳代培養(yǎng)的步驟和本卷須知，并指出哪些是關(guān)鍵步驟試述傳代培養(yǎng)的步驟和本卷須知，并指出哪些是關(guān)鍵步驟? ?2.2.細(xì)胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么細(xì)胞胞傳代培養(yǎng)的目的是什么? ? 3.3.貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同? ? 4.4.如何估計(jì)是否傳代和傳代的方式如何估計(jì)是否傳代和傳代的方式(fngsh)?(fngsh)?5.5.細(xì)胞凍存應(yīng)注意的問題。細(xì)胞凍存應(yīng)注意的問題。思考題第十九頁，共二十頁。貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞傳代方法上有什么不同內(nèi)容(nirng)總結(jié)實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞的傳代與凍存。3關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈, 翻開可見光燈開關(guān),翻開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管。6.將培養(yǎng)