中藥指紋圖譜操作技巧指南

1、中藥指紋圖譜操作指南說明：本實驗研究規(guī)程指南為在原技術(shù)要求的基礎(chǔ)上規(guī)范中藥注射劑色譜指紋圖譜試驗研究而制訂。本指南未能概括的內(nèi)容，通過實踐可自行補充調(diào)整，但申報資料或復(fù)核資料中須有相應(yīng)的說明和申述。指南中的"色譜指紋圖譜"指采用柱色譜及薄層色譜等各種色譜技術(shù)實驗研究的指紋圖譜。光譜指紋圖譜將另行規(guī)定。一、 供試品收集供試品收集是研究指紋圖譜最初也是最關(guān)鍵的步驟，由于不可能對一個藥材的所有樣本進行試驗，而且生長環(huán)境條件對藥材代謝產(chǎn)物有影響，所以要收集有代表性的供試品。收集不少于 10 批供試品的含義是指樣本的數(shù)和量要有足夠的代表性。（一 ） 原料藥材：在藥材的化學(xué)成分與中醫(yī)臨

2、床療效的之間的關(guān)聯(lián)尚未能闡明的現(xiàn)階段，基本上是在承認(rèn)其傳統(tǒng)的功能主治及臨床驗證的基礎(chǔ)上進行指紋圖譜的實驗研究。原料藥材的指紋圖譜主要是反映其自然狀態(tài)的內(nèi)在質(zhì)量情況，研究其指紋圖譜是以此作為選擇原藥材投料或混批提取的依據(jù)，同時作為研究注射劑成品指紋圖譜相關(guān)性的基礎(chǔ)。由于自然條件的變化，藥材個體之間指紋圖譜的差異是正常的，在品種鑒定無誤的基礎(chǔ)上，力爭藥材有較為固定和穩(wěn)定的來源，個體之間的指紋圖譜主要特征大致相似即可，使成品指紋圖譜特征的穩(wěn)定有起碼的保證。藥材的 "批 " 不是工業(yè)生產(chǎn)的"批 "， 是指相互獨立的供試品，即不能將同一地點或同一渠道同一時間獲得的

3、供試品分成若干份供試品，以保證試驗結(jié)果的代表性。由于收集藥材供試品受主觀和客觀的條件限制，供試驗的供試品嚴(yán)格講均沒有統(tǒng)計學(xué)的意義，所以供試品數(shù)越多越好，10 批是最低的要求。供試品應(yīng)保證其真實性，應(yīng)有完整采樣原始記錄，內(nèi)容包括：藥材名稱供試品來源（真實記錄供試品來自何處：傳統(tǒng)產(chǎn)地收集或是資源豐富的產(chǎn)地收集，或者來自GAP 基地供應(yīng)；還是產(chǎn)地購買、市場購買或委托購買，等，以便于生產(chǎn)原料的采購選擇和測試數(shù)據(jù)的可追溯）。收集時間（購買時間）及收集人貨源情況調(diào)查（貨源是否充足和穩(wěn)定）基原鑒定及鑒定人：產(chǎn)地或GAP 基地收集的藥材結(jié)合植物形態(tài)鑒定品種。如缺原植物，由熟練的專業(yè)人員憑性狀或顯微特征鑒別。如

4、近緣品種、難以區(qū)分的野生品種（如白花蛇舌草、蒲公英），應(yīng)在指紋圖譜研究中仔細(xì)比較，如獲得的指紋圖譜相似度很高，也可應(yīng)用，但須明確記錄。并在今后實施 GAP 時確定一個品種，如指紋圖譜相似度很低，則須確定品種，改為栽培品使用。商品混亂的品種（如陳皮）產(chǎn)區(qū)的選擇應(yīng)縮小范圍，并結(jié)合資源選用藥典收載品種中的一種。復(fù)方制劑中的君藥及處方量大的藥材必需重點注意品種的鑒定，以避免今后執(zhí)行指紋圖譜過程中出現(xiàn)難以預(yù)料的困 難。質(zhì)量評估：為了便于對色譜的正確分析，減少試驗結(jié)果的判斷誤差， 首先藥材需符合藥典或部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，并詳細(xì)記錄。所有藥材均須編號，必要時附藥材外形照片。供試品的留樣、貯藏和標(biāo)簽：由于指紋圖譜研

5、究周期較長，供試品必須在干燥、低溫、避光處貯藏，標(biāo)簽必須有編號，收集供試品的編號應(yīng)與貯藏樣品、試驗樣品的編號一致。留樣數(shù)量應(yīng)不少于試驗實際用量的3 倍。以保證試驗結(jié)果有異議時的可追溯。如以中藥飲片或炮制品為起始原料，應(yīng)采用符合中國藥典或飲片炮制規(guī)范的供試品。申報資料可將關(guān)鍵內(nèi)容扼要填寫于表一中：表一（推薦）藥材名稱供試品編號供試品來源收集時間（購買時間）及收集人貨源情況調(diào)查基原鑒定及鑒定人學(xué)名：鑒定人：質(zhì)量評估供試品留樣數(shù)量：容器：貯藏地點及條件：標(biāo)簽原始記錄保存處附一：藥材外形照片。附二：藥材的色譜圖（試驗完畢后）。（二 ） 半成品（提取物）： 藥材所含成分的個體差異是難以避免的，指紋圖譜研

6、究用的半成品應(yīng)來自生產(chǎn)車間通過藥材混批調(diào)整及規(guī)范的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的實際樣品。關(guān)鍵技術(shù)及相應(yīng)參數(shù)填寫于表二，并附試驗完畢后指紋圖譜。表二（推薦）半成品（提取物）名稱混批前批號日期提取方法（關(guān)鍵技術(shù)）混批后批號混批比例原始記錄保存處供試品留樣數(shù)量：?容器：?貯藏地點及條件：? 附：混批前后的指紋圖譜。（三 ） 成品（注射劑）：產(chǎn)品批號、生產(chǎn)單位、成品批號與半成品（提取物）批號的相關(guān)性均須有明確的記錄，以保證試驗數(shù)據(jù)的可追溯。成品的“對照用指紋圖譜”是建立在標(biāo)準(zhǔn)化提取物或 10 批以上產(chǎn)品指紋圖譜的基礎(chǔ)上。各批供試樣品須有留樣。主要內(nèi)容填寫于表三，并附試驗完畢后的指紋圖譜。表三（推薦）供試品批號生產(chǎn)單

7、位供試品數(shù)量供試品留樣數(shù)量：?容器：?貯藏地點及條件：? 指紋圖譜研究用的原藥材、半成品及注射劑成品均應(yīng)有10 批以上的樣品供實驗，以保證指紋圖譜的可重復(fù)性。二、供試品溶液的制備（一 ） 藥材供試品溶液的制備取樣：供試品取樣應(yīng)注意代表性，以保持實驗室取樣與實際生產(chǎn)應(yīng)用藥材一致，例如地上部分的藥材，取樣約0.51Kg,分別稱量莖、葉、花、果的大致比例并做記錄。例如果實類藥材，生產(chǎn)時去除種子的，供試品也應(yīng)除去種子，并做記錄。 如果藥材表觀質(zhì)量不均勻（如大小不一、肥瘦不等、粗細(xì)不勻等），應(yīng)注意供試品的取樣有代表性，其后的試驗中，必要時應(yīng)做比較試驗，以考察所含成分有無顯著差異，供生產(chǎn)參考。稱樣：應(yīng)按照

8、常規(guī)要求，將選取的供試品適當(dāng)粉碎后混合均勻，再從中稱取試驗所需的數(shù)量，一般稱取供試品與選取樣品的比例為1： 10，即如稱取1g 供試品，應(yīng)在混合均勻的10g 選取的樣品中稱取。因為指紋圖譜需要提供量化的信息，稱取供試品的精度一般要求取3 位有效數(shù)字。制備：藥材指紋圖譜的主要目的，一是考察藥材本身的質(zhì)量情況，二是以藥材的指紋圖譜為參比，提取物及制劑的指紋圖譜與之比較，以考察制劑與原藥材的相關(guān)性。藥材供試品溶液的制備，可選用適宜的溶劑和提取方法，定量操作進行，盡量使藥材中的成分較多地在色譜圖中反映出來，并達到較好的分離。最終制備的供試品溶液還應(yīng)能適應(yīng)色譜試驗的需要，如液相色譜的供試品溶液宜用色譜流

9、動相或色譜洗脫強度較弱的溶劑；薄層色譜用的供試品溶液可采用液液萃取或固液萃取，選用適宜的溶劑制備供試品溶液。氣相色譜的供試品可采用水蒸氣蒸餾法、頂空進樣法或固相微萃取法，供試品如需使用溶劑，應(yīng)用低極性低沸點的溶劑。定容：供試品溶液最終應(yīng)用適宜的溶劑溶于標(biāo)定容量的容器中，制成標(biāo)示濃度的供試品溶液（g/mL 或 mg/mL ） 。放置： 一般要求供試品溶液盡量新鮮配制，如連續(xù)試驗需要，供試品溶液應(yīng)在避光、低溫、密閉容器條件下短期放置，一般不超過兩周，溶液不穩(wěn)定的，一般不超過48 小時。標(biāo)簽：須注明編號或批號，應(yīng)與取樣的藥材編號一致，或有明確的關(guān)聯(lián)，以保證數(shù)據(jù)的可追溯。主要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)記錄。

10、（二 ）半成品（提取物）供試品溶液的制備： 稱取不同批次的半成品（提取物），參照 "供試品溶液"的制備方法中相應(yīng)的內(nèi)容制備成一定量的溶液，備用。標(biāo)簽須注明編號或批號，應(yīng)與取樣的藥材編號一致，或有明確的關(guān)聯(lián)，以保證數(shù)據(jù)的可追溯。主要操作過程及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)記錄。（三 ）成品（注射劑）供試品溶液制備：液體注射劑一般可直接或稀釋后作為供試品溶液，必要時也可用適宜的溶劑提取并制備成一定量的溶液。固體形式的注射劑（凍干粉針）須注意注射劑成品的附加劑有無對色譜試驗干擾。如有干擾，須研究采取適宜的樣品預(yù)處理方法以排除干擾（如含有氯化鈉則液相色譜不可使用蒸發(fā)光散射檢測器；如糖分太多，可能影響薄

11、層色譜的清晰度和分離度；凍干粉針的骨架劑用量較大時也可能影響色譜的質(zhì)量等）。此外，單方注射劑藥材或復(fù)方注射劑中不同藥材成分類別如果相差較大，色譜條件要求不同，需要進行樣品的預(yù)處理時，應(yīng)分別進行試驗，便于制備2 張以上的指紋圖譜。主要步驟及數(shù)據(jù)應(yīng)詳細(xì)記錄。三、參照物（一 ）參照物的選擇：指紋圖譜的參照物質(zhì)一般選取容易獲取的一個以上注射劑中的主要活性成分或指標(biāo)成分，主要用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性，并有助于色譜的辨認(rèn)。在與臨床藥效未能取得確切關(guān)聯(lián)的情形下，參照物（復(fù)方注射劑應(yīng)首選君藥的活性成分或指標(biāo)成分）起著辨認(rèn)和評價色譜指紋圖譜特征的指引作用，它并不等同于含量測定的對照品。指紋圖譜一般色譜

12、比較復(fù)雜， 內(nèi)標(biāo)物不易選擇，也不易插入，指紋圖譜不是含量測定，故內(nèi)標(biāo)物的作用也不等同于含量測定的內(nèi)標(biāo)物，因此應(yīng)慎重考慮選用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的必要性和可能性。參照物應(yīng)說明名稱、來源和純度。如無參照物也可選指紋圖譜中的穩(wěn)定的色譜峰做為參照峰，說明其色譜行為和有關(guān)數(shù)據(jù)，并應(yīng)盡可能闡明其化學(xué)結(jié)構(gòu)及化學(xué)名稱。如情況需要，又有可能也可考慮選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)物插入色譜中。（二 ）參照物溶液的制備：精密稱取，用適宜的溶劑制成標(biāo)示濃度的溶液，備用。四、實驗常用的色譜技術(shù)有薄層色譜、液相色譜、氣相色譜及其他色譜技術(shù)。須注意各種色譜技術(shù)的特點和不足，結(jié)合實際選用。不論何種色譜技術(shù)，選用的原則是必需具有良好的專屬性、重現(xiàn)性和可行

13、性。專屬性：建立的指紋圖譜必須能夠表達該品種的特征，即唯一性。重現(xiàn)性：同一品種同一樣品指紋圖譜中構(gòu)成指紋的各特征峰（斑點）作為整體（峰位、峰數(shù)、峰的豐度、各峰的大致比例）在不同實驗室和不同操作者之間得到的色譜整體特征應(yīng)有較高的相似度，以表明方法的可行性。同一品種不同樣品之間的相似度不屬于此范圍?？尚行裕荷V方法和試驗條件應(yīng)易于推廣和便于執(zhí)行，即一旦由藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)成為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容后，生產(chǎn)企業(yè)、中等水平的分析實驗室和省級以上的法定檢驗機構(gòu)均可執(zhí)行該標(biāo)準(zhǔn)。（一 ） 實驗室 ：承擔(dān)色譜指紋圖譜的實驗室應(yīng)符合以下6 個條件：1、 實驗室具備承擔(dān)指紋圖譜的總體能力；2、 實驗室設(shè)備通過檢驗證明符

14、合指紋圖譜試驗研究的需要；3、 技術(shù)人員具備從事指紋圖譜試驗研究的能力；4、 對實驗室的技術(shù)能力評價應(yīng)有定期的內(nèi)部的獨立檢查；5、 試驗數(shù)據(jù)有可追溯，與其他實驗室有可比性；6、 實驗室應(yīng)有質(zhì)量保證體系，以確保各種措施實施的透明和一致。（二 ）儀器：所用的儀器性能應(yīng)能滿足指紋圖譜試驗的需要，并須經(jīng)校驗；如果同一臺儀器有兩個以上的項目共用，須有特別措施保證儀器的清洗和維護，儀器使用要有明確記錄。液相色譜柱記錄商品名稱、生產(chǎn)廠家及相關(guān)參數(shù)（固定相、柱長度、內(nèi)徑、填料粒度等）；一般需用三根以上不同生產(chǎn)廠家的柱子進行比較，經(jīng)比較試驗后應(yīng)固定色譜柱來源與規(guī)格。色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性試驗可用該品種指紋圖譜所用的參

15、照物，參照常法進行，如柱效明顯降低，在排除其它因素后，說明該色譜柱不能繼續(xù)使用。另一方法是用制作 " 對照用指紋圖譜" 的提取物留樣樣品定期重復(fù)試驗，將前后得到的指紋圖譜垂直疊加，直觀比較，各指紋特征峰是否能重合及整個色譜的形狀是否有變異，如有變異致使指紋特征已難以辨認(rèn)，或選擇難分離的一對或一組峰，其分離度如明顯降低，在排除其他可能的影響因素后，可認(rèn)作該色譜柱不能使用。儀器使用人、使用時間及周期應(yīng)有記錄。薄層色譜系離線操作，薄層板為一次性器材，不存在重復(fù)使用問題，但不同廠家的商品預(yù)制薄層板質(zhì)量可能不一致，手工自制的薄層板只能供篩選試驗條件使用，用確定的條件制作指紋圖譜（圖像

16、）時必須用有質(zhì)量保證的商品預(yù)制薄層板 （如 Silicagel 60 ， Merck 等） 。 圖譜攝像時如用數(shù)碼攝像機，解像度應(yīng)在20,00,000 象素以上，熒光色譜須在薄層色譜專用的紫外光燈箱下加濾光片拍攝。如有相應(yīng)的積分軟件，可立即生成輪廓掃描圖以及積分?jǐn)?shù)據(jù)；也可用常規(guī)的薄層色譜掃描儀進行積分和繪制輪廓圖譜。薄層掃描儀的機械部分、電子部分及光源需定期校驗。氣相色譜如色譜柱類型、長度、 內(nèi)徑、 老化條件、載氣、流速、柱溫、柱頭壓力、進樣方式、進樣口溫度、檢測器等均需考察；儀器除定期檢查校驗外，填充柱或毛細(xì)管柱的柱效也應(yīng)參照液相色譜柱定期校驗柱效。其他種類的色譜儀參照上述原則校驗和記錄。各

17、種儀器均須按照儀器操作手冊以及SOP 進行。（三 ）試驗方法和試驗條件：色譜指紋圖譜試驗方法和試驗條件的優(yōu)選：試驗條件應(yīng)能滿足指紋圖譜的需要，不宜簡單套用含量測定用的試驗條件，并需根據(jù)指紋圖譜的特點進行試驗條件的優(yōu)選。試驗方法和試驗條件選擇的目的是通過比較實驗，從中選取相對簡單易行的方法和條件，獲取足以代表品種特征的指紋圖譜，以滿足指紋圖譜的專屬性、重現(xiàn)性和普遍適用性的要求。方法和條件須經(jīng)過嚴(yán)格的方法學(xué)驗證。由于色譜指紋圖譜具有量化的概念，所以從樣品的稱取、供試液的制備和進行色譜分析時均須定量操作。在指紋圖譜研究中，"量化 "的含義是指在定量操作的條件下所得到的指紋圖譜在整

18、體特征上可以作半定量的比較，以表達供試品個體之間指紋圖譜在"量 "方面的總體差異程度，以及半成品（提取物）和成品之間及成品批間指紋圖譜在"量 "方面的相似程度。選擇試驗方法及試驗條件須根據(jù)供試品的特點和需要設(shè)計合適的試驗方案，在保證專屬性、重現(xiàn)性的前提下，宜選擇簡單、實用、便于實施的方法和試驗條件，并需要進行方法學(xué)驗證。（四 ）試驗中應(yīng)注意的事項：（1）液相色譜的色譜柱需做比較試驗加以選擇，流動相至少用三種不同組成進行比較，并從中選取最合適的色譜條件。目前，高效液相色譜一般為反相色譜，采用十八烷基硅烷鍵合相柱，特殊情況下可選擇其他類型的化學(xué)鍵合相柱。不同

19、生產(chǎn)廠家不同牌號的色譜柱因選用的硅膠原料、鍵合條件、封尾情況等的差異，致使在性能上互有差異，故通過試驗比較，選擇合適的色譜柱很重要，選用的色譜柱最好是多數(shù)實驗室常用的。如需梯度洗脫時，應(yīng)盡量采用線性梯度。并應(yīng)報告儀器梯度滯后時間。測定梯度滯后時間，可用一零死體積連接器代替色譜柱，以甲醇為溶劑A， 含 0.1%丙酮的甲醇為溶劑B,檢測波長為260nm,運行0100% B的線性梯度，梯度時間20 分鐘，流速1.0ml/min ，記錄梯度圖形，測定梯度曲線中間點的時間，減去10 分鐘，即得。不同的儀器，由于梯度滯后時間的不同，可能影響方法的重現(xiàn)性，通?？赏ㄟ^調(diào)整進樣和梯度起始時間減少這種影響。檢測器

20、最常見的是紫外-可見光檢測器，文獻報道的檢測波長常常是為含量測定某一特定成分，不一定完全適合指紋圖譜的需要，為了獲取多層次的信息，常常需要選擇數(shù)個不同的檢測波長，條件許可的可使用二極管陣列檢測器，獲取不同波長得到的色譜圖，從中汲取更多的信息。對在紫外區(qū)無吸收的化合物，也可選擇其它類型的檢測器，如差示折光檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器等。(2) 薄層色譜一般采用常規(guī)硅膠預(yù)制板或高效硅膠預(yù)制板，必要時也可選用聚酰胺薄膜板或纖維素薄層板等，選用時主要是保證色譜圖像的質(zhì)量，劣質(zhì)的預(yù)制板不能使用。展開用溶劑系統(tǒng)的選擇至少需做三種不同展開系統(tǒng)的比較，另外，需注意觀察溫度和相對濕度對色譜行為的影響。雜質(zhì)的干擾對柱

21、色譜，常常是"隱性"的；薄層色譜則由于樣品供試液中所有成分均可在薄層板上觀察，所以雜質(zhì)成分對色譜的干擾是 "顯性"的，可直觀地反映在薄層色譜上，甚至直接影響指紋圖譜的觀察，因此樣品供試液的預(yù)處理常常是需要考慮的步驟之一。薄層色譜指紋圖譜宜在同板將"對照用提取物"與供試品平行比較，即每一薄層板必須有"隨行對照用提取物 " 或相應(yīng)的參照物。顯色劑分通用顯色劑和專屬顯色劑，結(jié)合使用可在一個色譜條件下得到的指紋圖譜獲取成分類別或化學(xué)成分功能團的信息，如生物堿、黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類等，專用的顯色劑可以直觀地顯示各

22、自的特征。(3) 氣相色譜通常使用毛細(xì)管柱，如填充柱得到的色譜雖然簡單，但如確能表達該品種的指紋特征，也可采用。一般極性與非極性固定相均須比較，以確定選用合適的固定相。色譜運行時間能保證供試品中的成分均能流出色譜柱。如需要將相對保留時間作為固定的常數(shù)( "保留指數(shù)") ， 也可根據(jù)實際需要和可能選取1,2 個內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計算。如需程序升溫宜采用線性升溫，盡量避免復(fù)雜的多階程序。其它色譜技術(shù)可參照上述基本要求設(shè)計試驗。色譜中的參照峰由于作用不同于含量測定，提高其分離度應(yīng)以不犧牲色譜的整體特征為前提，所以不應(yīng)孤立地苛求其分離度必需達到含量測定的要求。試驗研究中一般需要實驗室模擬生產(chǎn)

23、工藝制備供試品溶液，作為實驗室模擬樣品，以考察試驗條件，并與實際生產(chǎn)的供試品的指紋圖譜作參考比較。由于實驗室制備條件不可能與大生產(chǎn)工藝制備的產(chǎn)品完全一致，在其后的相關(guān)性比較時，有關(guān)數(shù)據(jù)僅供參考用，如大生產(chǎn)樣品與實驗室模擬樣品指紋圖譜相差十分明顯，則提示有必要從生產(chǎn)工藝和實驗室模擬樣品兩方面檢查原因。五、色譜指紋圖譜的建立和辨認(rèn)試驗條件確立后，將獲得的所有樣品的指紋圖譜逐一研究比較，首先試驗人員應(yīng)將原藥材、半成品（提取物） 、成品的指紋圖譜分別直觀比較。一張指紋圖譜，特別是分辨率較高的圖譜，必須制備有足夠代表性的樣品的圖譜，仔細(xì)觀察，首先找出藥材色譜具有指紋意義的各個峰，給以編號，藥材、 半成品

24、和成品之間的圖譜比較，如有缺峰，則缺號，以保持峰的編號不變，便于清楚地考察相互之間的相關(guān)性。半成品（提取物）的指紋圖譜與原藥材的指紋圖譜應(yīng)有一定的相關(guān)性，即半成品（提取物）指紋圖譜的特征應(yīng)在原藥材的指紋圖譜中可以追溯，而原藥材中的某些特征在提取物指紋圖譜中允許因生產(chǎn)工藝關(guān)系而有規(guī)律的丟失。半成品（提取物）指紋圖譜與成品（注射劑）的指紋圖譜應(yīng)有較高的相關(guān)性。中藥復(fù)方注射劑如處方藥味較多，藥量各異，成分復(fù)雜，難以要求在指紋圖譜中全部體現(xiàn)，但作為原料的各味藥材，必須研究各自的指紋圖譜。有的品種某一種成分含量很高（如黃芩中的黃芩苷），在色譜圖中占絕對優(yōu)勢，其它特征很弱，雖然這本身就是特征，但有時為了區(qū)

25、別用藥材作起始原料和單一成分直接投料（如用黃芩苷代替黃芩藥材） ，可試用不同的檢測波長或不同色譜方法，突出其它特征，相互參照辨認(rèn)。有的復(fù)方注射劑數(shù)種藥材均含同一類別的成分，而且成分又較多時（如人參、三七、黃芪并存），建立指紋圖譜的難度很大，除盡量改進試驗條件，提高色譜的分辨率外，可用陰性對照，考察相關(guān)峰的疊加關(guān)系，此時，各指紋峰之間比例的穩(wěn)定成為重要特征。因此更說明用藥材的標(biāo)準(zhǔn)提取物投料將是必然的發(fā)展趨勢。指紋圖譜的辨認(rèn)應(yīng)注意指紋特征的整體性。一個品種的指紋圖譜是由各個具有指紋意義的峰組成的完整圖譜構(gòu)成，各個有指紋意義的峰（或薄層色譜的斑點）其位置（保留時間或比移值）、大小或高低（積分面積或峰

26、高）、各峰之間相對的比例是指紋圖譜的綜合參數(shù)，辨認(rèn)和比較時從整體的角度綜合考慮，注意各有指紋意義的峰相互的依存關(guān)系。液相色譜不同儀器可能因滯留體積不同等原因?qū)е卤Ａ魰r間的漂移。薄層色譜的比移值不同實驗室漂移現(xiàn)象更較常見，所以比較色譜的整體特征很重要，不宜糾纏細(xì)枝末節(jié)。指紋圖譜的評價指標(biāo)是供試品指紋圖譜與該品種對照用指紋圖譜（共有模式）及供試品之間指紋圖譜的相似性。指紋圖譜的相似性從兩個方面考慮，一是色譜的整體"面貌"，即有指紋意義的峰的數(shù)目、峰的位置和順序、各峰之間的大致比例（薄層色譜還有斑點的顏色）等是否相似，以判斷樣品的真實性。二是供試品與對照樣品或"對照用指

27、紋圖譜"之間及不同批次樣品指紋圖譜之間總積分值作量化比較。如總積分面積相差較大（如±20%） ， 則說明同樣量的樣品含有的內(nèi)在物質(zhì)有較明顯的"量的差異，這種差異是否允許，應(yīng)視具體品種，具體工藝的實際情況，并結(jié)合含量測定項目綜合判斷。這種比較應(yīng)在同一臺儀器平行進行測定。為了減輕日常檢驗的煩瑣計算，積分?jǐn)?shù)據(jù)可以簡化為3 位有效數(shù)字，或者直接讀取圖譜縱坐標(biāo)的刻度值。因為積分值本身由于不同成分響應(yīng)不同，而且量的多少與真值不一定呈線性關(guān)系；指紋圖譜的功能不同于含量測定， 它只需要數(shù)量的大概信息。相似性比較可以用"相似度"表達，相似度可以借助藥典會推薦的&

28、quot;中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件"計算，除個別品種視具體情況而定外，一般成品指紋圖譜相似度計算結(jié)果在0.91.0（或以90100表示）之間作為符合要求。自行開發(fā)的軟件必需公開算法。申報資料中除相似度計算結(jié)果外，需附指紋圖譜。相似度小于 0.9 ，但直觀比較難以否定的供試品，可進一步采用模式識別方法（如主成分分析）檢查原因。六、色譜指紋圖譜的校驗和復(fù)核生產(chǎn)企業(yè)申報的色譜指紋圖譜須經(jīng)獨立于生產(chǎn)企業(yè)以外的實驗室進行校驗，以確認(rèn)其專屬性和重現(xiàn)性。國家藥品監(jiān)督管理局指定的省級藥品檢驗所負(fù)責(zé)研制單位申報資料的技術(shù)審核與實驗復(fù)核，除另有規(guī)定外，已上市品種的指紋圖譜復(fù)核，如同品種經(jīng)統(tǒng)一

29、研究確定方法的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核由省級藥品檢驗所進行；廠家自己研制的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核由省級藥品檢驗所進行，并由國家藥典會組織另一藥品檢驗所對其進行二次復(fù)核。半成品（提取物）不做復(fù)核試驗，只做文字資料的技術(shù)審核，以判斷成品與原料及半成品（提取物）的相關(guān)性以及申報資料內(nèi)容是否合理。進行資料審核時注意申報的資料是否進行系統(tǒng)的方法學(xué)考察和驗證，書面審核內(nèi)容包括提取方法、提取溶劑、色譜柱或薄層板、色譜系統(tǒng)、檢測波長等的選擇；精密度、方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及成品儲放后指紋圖譜的穩(wěn)定性等考察，結(jié)果可通過相似度軟件檢查，結(jié)果相似度均應(yīng)在0.9 以上。所申報的上述資料應(yīng)書寫規(guī)范，數(shù)據(jù)齊全。除情況確實需要外，一般復(fù)核單

30、位不再進行方法學(xué)復(fù)核試驗，但復(fù)核單位本身對注射劑成品的復(fù)核試驗仍須進行自身的方法學(xué)驗證。復(fù)核申報的指紋圖譜試驗，應(yīng)與原申報資料提供的試驗條件相同。如復(fù)核結(jié)果難以與申報資料的指紋圖譜吻合，應(yīng)結(jié)合申報資料的有關(guān)內(nèi)容和數(shù)據(jù)以及復(fù)核單位的全部圖譜及數(shù)據(jù)，客觀地公正地分析原因。必要時，由第三方再復(fù)核。也可以隨行對照用提取物為參照，與供試品由申報單位和復(fù)核單位分別在各自實驗室進行核對試驗，雙方供試品與對照用提取物的指紋圖譜平行比較。如各自均能重復(fù)自身的結(jié)果，而色譜的指紋特征又可以相互印證，雖與標(biāo)準(zhǔn)所附對照用指紋圖譜有所差異，但相似度檢查均能通過，也可考慮予以認(rèn)可。但同一實驗室在完全相同的條件下獲得的指紋圖譜不應(yīng)發(fā)生上述情況。故每次檢驗時均應(yīng)用隨行對照提取物同時試驗，并進行相似度檢查。（一 ）送樣程序已上市品種的指紋圖譜，如同品種經(jīng)統(tǒng)一研究確定方法的指紋圖譜，其研究資料與制劑由生產(chǎn)廠家送所在地的省級藥品檢驗所復(fù)核，再轉(zhuǎn)報國家藥典會。如生產(chǎn)廠家自己研究的指紋圖譜，其研究資料及藥材與制劑送所