DNA甲基化與癌癥

1、DNA甲基化與癌癥甲基化與癌癥2018.07.25 表觀遺傳學與DNA甲基化 DNA甲基化的檢測手段 DNA甲基化與癌癥一、表觀遺傳學與DNA甲基化基因型相同基因型相同現(xiàn)象現(xiàn)象1 1：一個生物體的不同組織基因表達模式截然不同一個生物體的不同組織基因表達模式截然不同表達模式迥異表達模式迥異現(xiàn)象2：同卵雙生的孿生子具有完全相同的基因組。但他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。 現(xiàn)象現(xiàn)象3 3： 腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導致失去活性，而基因腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導致失去活性，而基因的的DNADNA序列并不發(fā)生變化。序列并不發(fā)生變化?，F(xiàn)象現(xiàn)象4 4：橘生淮南則為橘，生于淮北則

2、為枳，葉徒相似，橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味其實味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠。道，大小，外觀可能相差很遠。Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他們出生在不同如果他們出生在不同的地方的地方基因環(huán)境表型表觀遺傳學相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 什么是表觀遺傳學？什么是表觀遺傳學？ 表觀遺傳學：表觀遺傳學： 基因序列無變化基因序列無變化 基因功能發(fā)生變化基因功能發(fā)生變化 可遺傳并且是可逆的可遺傳并且是可逆的 表觀遺傳學機制：表

3、觀遺傳學機制： DNADNA甲基化甲基化 組蛋白修飾組蛋白修飾 RNA RNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干擾，microRNA, long non-coding microRNA, long non-coding RNARNA等等) )表觀遺傳學表觀遺傳學/ /Epigenetics 基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學研究的是在基因組表觀遺傳學研究的是在基因組DNA序列不變的序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛或潛在的可遺傳性在

4、的可遺傳性)的變化。的變化。 定義定義Epigenetics - On or over the genetic information encoded in the DNA在細胞基因組上存在兩類信息：在細胞基因組上存在兩類信息： A- 遺傳學信息遺傳學信息 B- 表觀遺傳學信息表觀遺傳學信息前者前者維持細胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料維持細胞活性功能工廠的所有物質(zhì)材料后者后者怎么建、何時建、在哪建的附加信息怎么建、何時建、在哪建的附加信息基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以基因組不僅僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也可以記載遺傳信息。記載遺傳信息。DNA sequence codin

5、gEpigenetic programming廣泛，多樣，廣泛，多樣，復雜復雜 DNA甲基化甲基化 染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑 RNARNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干擾， 非編碼非編碼RNA:microRNARNA:microRNA, , long non-coding RNA long non-coding RNA等等) )表觀遺傳學目前的主要研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學目前的主要研究發(fā)現(xiàn)細胞命運個體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺 傳調(diào)控基因選 擇表達表表 觀觀 遺遺 傳傳 學學基因表達前的調(diào)控：DNA甲基化、基因印記、染色質(zhì)重塑基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控：ncRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖開關RNA蛋白翻譯后的修

6、飾：組蛋白的甲基化和乙?；?、非組蛋白的共價修飾DNA甲基化甲基化組蛋白翻譯后修飾組蛋白翻譯后修飾RNA機制機制甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移 到其他化合物的過程,可形成各種甲 基化合物，或是對某些蛋白質(zhì)或核 酸等進行化學修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化 的，這種甲基化涉及基因表達的調(diào) 控、蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)以及核糖核 酸(RNA)加工。甲甲 基基 化化DNA DNA 甲基化的概念及機理甲基化的概念及機理 1950年，年，Wyatt在在Nature上首次指出測序結果表明上首次指出測序結果表明DNA可能存在第可能存在第5堿基。堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移

7、酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAHDNMTs活性甲基化合物活性甲基化合物DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、 胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶 的C-5位等。但在哺乳動物中DNA甲基化主 要發(fā)生在5-CpG-3的C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的作用下，將一個甲基添加在DNA分子中的堿基上，最常見的是加在胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化位點CpG島或富含島或富含

8、CpG島的區(qū)域島的區(qū)域CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持 或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGCGCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCG

9、CC CCGCGCGACCCGCTGCpG島特征：A、CpG島主要位于基因的啟動子區(qū)，部分位 于基因的第一個外顯子區(qū)； B、CpG島甲基化可以直接導致相關基因的表 觀遺傳學沉默。高等生物基因組甲基化特點高等生物基因組甲基化特點 1）廣泛性）廣泛性 2）可遺傳性可遺傳性 3）可逆性）可逆性 4）組織特異性）組織特異性 CpG島島(CpG islands) 在結構基因在結構基因5端附近的調(diào)控區(qū)段，端附近的調(diào)控區(qū)段， CG二聯(lián)核苷常常二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。 預測軟件預測軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/

10、cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/可遺傳性可遺傳性DNA 修復修復基因表達的調(diào)節(jié)基因表達的調(diào)節(jié)癌基因代謝癌基因代謝 凋亡凋亡分化分化細胞周期細胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能DNA甲基化的生物學意義DNA甲基化直接影響基因的活化狀甲基化直接影響基因的活化狀態(tài)態(tài) DNA甲基化的生物學意義在于： A、基因表達的時空調(diào)控 B、保護基因組的穩(wěn)定性表現(xiàn)：基因在不同時期不同身體部位特異表達I.有些基因在發(fā)育早期甲基化II.發(fā)育晚期被誘導去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印記基因高甲基化Cp

11、G甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比CpG島的數(shù)目與基因密度相關人類基因組甲基化情況人類基因組甲基化情況1%- 2%的人類基因組是CpG群人類基因組CpG島約為28890個 平均值為每Mb含1 0.5個CpG島80%- 90%的CpG位點已被甲基化一、一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因因子子對對DNA元件元件的的識別識別與與結合結合序列特異性的甲基化DNA結合蛋白與啟動子區(qū)甲基化CpG島結合，募集組蛋白去乙酰化酶（HDAC）， 形成轉(zhuǎn)錄抑制復合物，阻止轉(zhuǎn)錄 因子與啟動子區(qū)靶序列的結合， 從而影響基因的轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制沒有甲基化基因表達沒有甲基化基因表達基因啟動子區(qū)域基因啟動子區(qū)域

12、轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子結合結合不能結合不能結合甲基化基因不表達甲基化基因不表達甲基化甲基化二、二、序序列列特特異性異性的的甲甲基基化化DNA結結合合蛋蛋白與白與啟啟動動子子區(qū)甲區(qū)甲基基化化CpG島結島結合合，募募集組集組蛋蛋白白 去乙?；ヒ阴；该福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑，形成轉(zhuǎn)錄抑制復制復合合物物，阻，阻止轉(zhuǎn)止轉(zhuǎn)錄因子錄因子與與啟啟動動子區(qū)靶子區(qū)靶序序列列的的結結 合，從而影響基因的轉(zhuǎn)合，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制Sin3AMeCP2啟動子基因轉(zhuǎn)錄因子基因表達啟動子基因基因不表達染色質(zhì)構型的變化伴隨組蛋白的乙酰化和去 乙?；?，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的開關。DNA甲基化能引起染色

13、質(zhì)結構、DNA構象、 DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的 改變，從而控制基因表達。三、三、DNA甲基甲基化化通過通過改改變?nèi)咀內(nèi)旧|(zhì)結質(zhì)結構構抑制抑制基基因表因表達達DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄的機制二、DNA甲基化的檢測手段亞硫酸氫鹽測序的原理亞硫酸氫鹽測序的原理1. 直接測序法直接測序法1. 直接測序法直接測序法 注： A：癌組織；B：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序克隆測序2. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序克隆測序3. 甲基化特異性甲基化特異性PCR 3

14、. 甲基化特異性甲基化特異性PCR U M U M U M ladder100150200250MSP法檢測抑癌基因法檢測抑癌基因RASSF1A啟動子區(qū)的甲基化啟動子區(qū)的甲基化圖圖 MSP檢測組織切片檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性甲基化特異性PCR（MSP）結果，）結果，U為非甲基化，為非甲基化，M為甲基化。為甲基化。4. 結合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法結合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法5. 基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法6. 基于親和純化的甲基化分析方法基于親和純化的甲基化分析方法三、DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥 DN

15、A甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，DNA甲基化改變包括高甲基化和去（低）甲基化。 對不同腫瘤細胞的DNA分析表明，癌變細胞中出現(xiàn)基因突變的概率要遠遠低于預期，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大的作用。DNA甲基化與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系 高甲基化抑癌基因沉默 低甲基化原癌基因被激活CpG島抑癌基因高甲基化抑癌基因高甲基化在腫瘤細胞中，抑癌基因啟動子區(qū)域的CpG島處于高甲基化狀態(tài)，因而抑癌基因沉默，使得細胞脫離正常的細胞周期，進入腫瘤發(fā)生過程。 原癌基因激活正常細胞中，由于甲基化作用原癌基因多處于沉默狀態(tài)，但在多種腫瘤細胞中，均發(fā)現(xiàn)原癌基因處于低甲基化狀態(tài)

16、，并且低甲基化狀態(tài)與其蛋白表達升高密切相關，表明低甲基化狀態(tài)可使原癌基因激活。腫瘤細胞的特性： 現(xiàn)在認為，腫瘤細胞具有以下特征:1.逃避細胞死亡(resisting cell death)2.對生長抑制信號不敏感( evading growth suppressors )3.誘導新血管生成(inducing angiogenesis)4.無限的復制潛能(enablingreplicative immortality)5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移(activatinginvasion and metastasis)6.持續(xù)的增殖信號(sustainingproliferative signaling) 另

17、外，近年的研究又提出了新的兩點:能量代謝的改變(reprogramming of energymetabolism)和逃避免疫系統(tǒng)的破壞(evading immune destruction)以上幾點在細胞發(fā)生癌變的過程中有著重要的意義.近年來的研究發(fā)現(xiàn)，特定基因的DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮重要作用.1.逃避細胞死亡 通常情況下，細胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號分子等刺激時會發(fā)生凋亡，但是癌細胞卻可以不受凋亡的控制，而大量分裂增殖. 例如，p53基因是一個重要的抑癌基因，可以促使損傷細胞發(fā)生凋亡.50%的癌癥中存在p53基因的突變失活. p53基因編碼區(qū)的甲基化狀態(tài)容易因為脫氨基作用發(fā)生5

18、mC-T的轉(zhuǎn)換.同時，INK4a/ARF基因啟動子區(qū)域的甲基化可以使表達下降，導致原來受抑制的MDM2表達上升，MDM2進而結合p53并使后者發(fā)生蛋白質(zhì)水平的降解，使細胞逃避p53引起的凋亡圈.DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥2.對生長抑制信號不敏感 細胞生長抑制因子對細胞生長的調(diào)控存在多種機制。 在丙肝病毒感染的肝細胞中，發(fā)現(xiàn)了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因啟動子的甲基化，p16表達水平下降從而促進了細胞的分裂，在丙肝誘導的肝癌中起著重要的作用DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥3.誘導新血管生成 新血管的生成是癌癥發(fā)生中重要的步驟.新血管生成首先需要金屬蛋白

19、酶分解細胞外基質(zhì)，再通過血管內(nèi)皮生長因子來誘導血管生成。 組織金屬蛋白酶抑制劑可以抑制金屬蛋白酶的活性，同時與血管內(nèi)皮生長因子結合阻止血管生成。腫瘤細胞中組織金屬蛋白酶抑制劑的下調(diào)有一部分原因是由于啟動子區(qū)域的甲基化引起的.血小管反應蛋白（TSP1）是另一個抑制血管生成的蛋白，TSP1基因啟動子區(qū)域甲基化引起基因表達抑制，進而導致腫瘤發(fā)生過程中細胞外基質(zhì)重構和血管生成.DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥4.無限的復制潛能 癌細胞無限的復制潛能主要與端粒酶活性的升高有關。端粒酶可以利用RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，解決DNA復制時末端缺失的問題。正常情況下端粒酶只有在受精卵和十細胞中才有活性，而腫瘤細胞大

20、多具有高活性的端粒酶。 端粒酶的重要組成部分是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。它的活性與端粒酶活性高度相關. 引起人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶激活的啟動子甲基化有位置特異性，即與啟動子特定部位的甲基化及相關區(qū)域整體的非甲基化相關。DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移 組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細胞惡變的重要特征，近年來這力一面的研究進展迅速.細胞骨架的異常調(diào)節(jié)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關。 DFNAS是一個新發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關基因.DFNAS可以促進細胞凋亡，而DFNA基因啟動子甲基化后的表達抑制導致了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移幾率增大DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥6.持續(xù)的增殖信號 大部分的癌細胞不需要外界的生長刺激因子的作用就可以

21、完成增殖，原因是細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)生了變化，導致促增殖因子作用的增強。 在結直腸癌中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞中SFRPs的啟動子區(qū)域的高甲基化使其表達抑制，引起了Wnt通路的過度激活而刺激細胞分裂，因而細胞在不需要外界生長刺激因子的作用下就可以不斷增殖。DNA高甲基化與癌癥高甲基化與癌癥 與癌癥發(fā)生過程中DNA的甲基化不同，DNA的低甲基化既包括特定基因(主要是原癌基因)的低甲基化，還包括基因組范圍內(nèi)以非編碼重復序列為主的DNA整體水平的低甲基化.DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥1. 特定基因的甲基化水平降低 CT ( cancer/testis antigen genes)抗原屬于MACE (

22、melanoma and germ cell expressed)基因家族，正常情況下只在生殖細胞表達。 CT抗原在多種腫瘤組織中高表達，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活與它的啟動子區(qū)域的去甲基化相關。 近年來，白血病基因，乳腺癌基因，結腸直腸癌，腎細胞癌基因肝癌基因中都發(fā)現(xiàn)了由啟動子低甲基化所引起的腫瘤相關基因的過表達.DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥2.基因組范圍整體DNA甲基化的降低基因組范圍DNA甲基化的程度可以通過甲基化敏感的DNA酶來檢測。在多種癌癥當中都發(fā)現(xiàn)了基因組范圍整體水平的DNA甲基化降低，包括許多重復序列甲基化水平的下降。正常組織細胞的甲基胞嘧啶含量約4%，而癌細胞則為

23、大約2%一3%。DNA甲基化水平的降低可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期階段。腫瘤細胞在基因缺乏區(qū)域(gene-poor areas)的DNA甲基化水平明顯下降，而基因啟動子區(qū)域的甲基化差異則相對較小，提示這些非編碼區(qū)域的甲基化水平降低可能與腫瘤發(fā)生有更密切的關系.DNA低甲基化與癌癥低甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥診斷表觀遺傳學的改變是細胞癌變的重要特征之一，因此，細胞DNA甲基化的變化可以作為癌癥早期診斷的重要依據(jù)。甲基化生物標記的不斷發(fā)現(xiàn)使這一技術在臨床的應用成為可能。 甲基化特異的PCR技術(methylation-specific PCR MSP)的出現(xiàn)，使得細胞DNA甲基化水平的檢測變得十分方便。DNA甲基化檢測穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測且其異常程度常與癌癥的進展相關.因此，相對于傳統(tǒng)的基因突變檢測有很大的優(yōu)勢。在許多癌癥中都己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了癌癥相關基因甲基化水平的改變，如外周血細胞的DNA低甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關，隨著全基因組甲基化圖譜的繪制，相信會有更多的甲基化生物標記投入到臨床癌癥的診斷中。與基因的突變不同，表觀遺傳學的改變大都是可逆的，因此，利用藥物來改變細胞的表觀遺傳學狀態(tài)可能是治療癌癥的一條新途徑。目前的甲基化酶抑制劑主要有zebularine和 5-ADC 。 5-ADC在試驗中顯示了對骨髓增生癥、白血病和實體腫瘤都有明顯的療效。Zeb