流式細胞術(shù)及其應(yīng)用

1、 第 一 部 分流式細胞術(shù)的一般介紹FACSCaliburBD LSRFACS Vantage DiVa BD Biosciences ：10,000cells/second or more FACSAriaFACSCalibur細胞結(jié)構(gòu)細胞功能激光光源氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍光488nm的譜線最強，約占總光強的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見光部分，以633nm較強。免疫學上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長在550nm以上，可使用染料激光器。將有機染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhoda

2、mine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率最高，約可占到一半。Longpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片 光收集系統(tǒng)：光電倍增管（光收集系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）熒光染色的細胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光一般由光電倍增管（PMT）檢測。PMT的響應(yīng)時間短，僅為ns數(shù)量級；光譜響應(yīng)特性好，在200900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從103到108可連續(xù)調(diào)節(jié)，因此對弱光測量十分有利。FACSCalibur 光路圖液流系統(tǒng)：流動

3、室、液流驅(qū)動系統(tǒng)液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個細胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度10m/s。由于鞘液的作用，被檢測細胞被限制在液流的軸線上。細胞分選系統(tǒng)488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector細胞分選系統(tǒng)

4、不同分選系統(tǒng)信號檢測u 液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射后,我們可以接收到兩種光信號第一種 散射光 受到激光照射會向立體角為2的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān).u 第二種 熒光熒光染料在激光的激發(fā)下,發(fā)熒光可顯示出研究對象的相關(guān)信息.熒光信號主要包括兩部分：自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。小角散

5、射又稱前向角散射光光它反應(yīng)細胞的相對大小和截面積的大小,一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系 ；側(cè)向角散射又稱90度角散射光代表細胞的顆粒度和精細結(jié)構(gòu)的變化.FSC熒光Laser自發(fā)熒光特異熒光特異熒光能量級激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失單參數(shù)直方圖（Histogram）二維等高圖和密度圖Pseudo 3D Plot3D Plot Dot Plot便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計不同的細胞群可以用不同的顏色標記主要表達方式光譜交叉Emission wavelength (nm) 530 580 630

6、 680 730 780FITCPEPE-TRPE-CY54 colors - simultaneous collection兩色以上熒光分析存在 光譜交叉熒光補償熒光補償方法方法所有補償調(diào)為“0”調(diào)節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調(diào)節(jié)熒光補償 樣品培養(yǎng)細胞新鮮組織石蠟包埋單細胞 懸液 標記熒光抗體檢測表型測定細胞分選流式細胞術(shù)操作流程統(tǒng)計學 分析繼續(xù)培養(yǎng) 細 胞 周 期 分 析上機去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用去甲斑蟊素對肝癌細胞周期的作用 圈門去除細胞碎片，分析細胞凋亡圈門去除粘連體，分析細胞周期細胞凋亡分析 H2O2誘導成神經(jīng)瘤細胞的凋亡照片，藍色為細胞核，

7、綠色是凋亡細胞。 A.K. Stout and J.T. Greenamyre, Emory University 細胞凋亡u首先出現(xiàn)的是染色質(zhì)的濃縮, 導致致密的、分離的、邊界清晰的半月形的染色質(zhì)顆粒集中于核膜邊緣;u隨后染色質(zhì)濃縮過程伴隨有核膜及細胞膜的內(nèi)陷, 接著核碎裂成分離的片段, 胞漿濃縮, 細胞支架斷裂,這些片段被細胞膜包裹;u 跟著出現(xiàn)的是凋亡細胞斷裂成若干個有完整包膜包裹的凋亡小體(apoptosis body) , 小體的大小及其內(nèi)容差異甚大, 大部分含有若干核片段, 少數(shù)可能沒有核片段。細胞核染色體局部凝聚細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻染色體局部凝聚引自 http:/ 缺乏IL3誘

8、導的細胞凋亡Michael G. Ormerod Journal of Immunological Methods 265 (2002) 73 80雙陰：活細胞 Annexin V-PE單陽：早期凋亡細胞雙陽：晚期凋亡細胞 7-AADd單陽：壞死細胞檢測淋巴細胞引起的細胞毒作用檢測淋巴細胞引起的細胞毒作用細胞毒性淋巴細胞（包括細胞毒性T細胞CTL和自然殺傷細胞NKC）能釋放包含穿孔素蛋白和顆粒酶的顆?；蛲ㄟ^Fas-Fas連接作用于靶細胞，引起靶細胞內(nèi)Caspase酶激增，導致細胞死亡包括凋亡。具有重大研究和應(yīng)用價值。通常測定淋巴細胞介導的細胞毒性作用，用同位素51Cr，操作復(fù)雜危險而且不利于單

9、細胞分析。流式細胞術(shù)測定細胞毒作用(FCC)，利用Caspase專一性熒光底物測定受害細胞的細胞毒作用強度。準確簡便迅速。 The FCC assay provides rapid and sensitive detection of NK cell cytotoxicity. TFL2-labeled Jurkat cells were incubated with the NK cell line NK92 at an E/T ratio of 51 for the time indicated in the presence of the caspase 6 substrate. Sig

10、nificant cytotoxicity(50%) was detected as early as 20 min.From: Methods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJ The detection of NK92-mediated killing of breast carcinoma target cell lineMDA-MB-468 cells using b

11、oth flow cytometry (A,B) and confocal microscopy (C,D).Target cells were labeled with TFL2 and incubated without (A,C) or with (B,D) NK92cells for 2 h in the presence of caspase 6 substrate. Nonapoptotic target cells are red; apoptotic target cells have both red and green fluorescence signalsand the

12、refore appear yellow.u部分書籍及雜志部分書籍及雜志：uMethods in Molecular Bology : Flow Cytometry ProtocolsEdited by M J Jaroszeskl and R Heller 63 Humana Press Inc , Totowa, NJuMethods in Molecular Biology: Flow Cytometry Protocols, 2nd ed.Edited by: T. S. Hawley and R. G. Hawley . Humana Press Inc., Totowa, NJuC

13、ytometry International Society for Analytical Cytology u部分流式細胞術(shù)研究中心部分流式細胞術(shù)研究中心：uADARC core facilities Peter Lopez uARUP (Associated Regional and University Pathologists)Laboratories, Utah Carl Wittwer uBowling Green State University center for Algal Microscopy and Image Digitization uCenter for Platelet Function Studies Alan D.Michelson uCooper Hospital / UMC (New Jersey) Phil McCoy - Roy Overton uCornell University