聚丙烯酰胺凝膠分離白蛋白

1、聚丙烯酰胺凝膠分離白蛋白聚丙烯酰胺凝膠分離白蛋白實(shí)驗?zāi)康膶?shí)驗?zāi)康膌 (1) 學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。l (2) 掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)。實(shí)驗原理實(shí)驗原理l聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區(qū)帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺（Acr）和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質(zhì)。l Acr和Bis單獨(dú)存在或混合在一起時是穩(wěn)定的，但在具有自由基團(tuán)體系時就能聚合。引發(fā)自由基團(tuán)的方法有化學(xué)法和光化學(xué)法兩種。化學(xué)法的引發(fā)劑是過硫酸胺（Ap），催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學(xué)法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺，在紫外光照射下引發(fā)自

2、由基團(tuán)。實(shí)驗原理實(shí)驗原理l采用不同濃度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，產(chǎn)生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質(zhì)的大小，形狀來選擇凝膠濃度。l在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移率取決于它所帶的凈電荷的多少、分子的大小和形狀。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸（縮寫SDS）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原，并且1g蛋白質(zhì)可定量結(jié)合1.4g SDS，亞基的構(gòu)象呈長橢圓棒狀。由于與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負(fù)電荷，其數(shù)值大大超過蛋白質(zhì)原有的電荷密度，掩蓋了不同亞基間原有的電荷差異。各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物具有相同的電荷密度，電泳時

3、純粹靠凝膠的分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。實(shí)驗材料與試劑實(shí)驗材料與試劑1、材料 標(biāo)準(zhǔn)樣和BSA（小牛血清白蛋白）2、試劑 1）30%丙烯酰胺(Acr)/0.8%N,N-甲叉雙丙烯酰胺（BIS） 2）5SDS/電泳緩沖液,稀釋成1 3）Tris-HCl/SDS,pH 6.8 4）Tris-HCl/SDS,pH 8.8 5）10%過硫酸銨(AP) 6）TEMED 商品試劑實(shí)驗步驟實(shí)驗步驟l裝配制膠用的玻璃板l制分離膠：按所需的濃度配制12.5分離膠分離膠。30%Acr-BisTris-HClPh8.8H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120l20l 灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面

4、），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）l3、制濃縮膠濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.8 H2O10%APTEMED400 l750 l1800 l50 l7.5 l l5加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣7.5L。l6電泳：先恒壓80V，待樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓為120V（恒壓）。當(dāng)溴酚藍(lán)移動到離底部約0.5cm時，停止電泳。l7翹開玻璃板，將濃縮膠切掉, 剝下凝膠，準(zhǔn)備染 色。l8 凝膠染色：使用考馬斯亮藍(lán)R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。注意事項注意事項l(1) Acr和Bis均為神經(jīng)毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應(yīng)戴手套和口罩。l (2) 玻璃板表面應(yīng)光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產(chǎn)生氣泡。l (3) 樣品槽模板梳齒應(yīng)平整光滑。l (4) 灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。l (5) 切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電