抗生素類藥物雜質(zhì)的研究與檢測

1、抗生素的質(zhì)量分析抗生素的質(zhì)量分析與研究與研究上海市食品藥品檢驗所劉浩目錄目錄 抗生素（微生物藥物）的定義和組成抗生素（微生物藥物）的定義和組成 抗生素結(jié)構(gòu)的特點抗生素結(jié)構(gòu)的特點 抗生素質(zhì)量的宏觀分析抗生素質(zhì)量的宏觀分析 抗生素質(zhì)量的微觀分析抗生素質(zhì)量的微觀分析 抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 抗生素質(zhì)量的綜合分析抗生素質(zhì)量的綜合分析 抗生素質(zhì)量分析的分類介紹抗生素質(zhì)量分析的分類介紹 抗生素質(zhì)量分析的展望抗生素質(zhì)量分析的展望抗生素（微生物藥物）的定義和組成抗生素（微生物藥物）的定義和組成 抗生素（antibiotic）（1944年）：微生物在其代謝過程中所產(chǎn)生的具有抑制其他種類微生物生

2、長及活動甚至殺滅其他種類微生物的化學(xué)物質(zhì) 1950s：抗菌素；青霉素類，鏈霉素類，四環(huán)素類 1980s：在低微濃度下有選擇地抑制或影響其他種類生物機(jī)能并在微生物生命過程中產(chǎn)生的具有生理活性的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物。抗腫瘤類；抗寄生蟲類；磺胺類，酮康唑類；芬凈類，磷霉素類，氯霉素類，單環(huán)類（氨曲南）和碳青霉烯類（硫霉素）抗生素（微生物藥物）的定義和組成抗生素（微生物藥物）的定義和組成 1990s：微生物藥物（microbial medicine）：由微生物在其生命活動過程中產(chǎn)生的在低微濃度下具有生理活性的次級代謝產(chǎn)物及其衍生物 具有抗微生物感染、抗腫瘤和抗病毒作用的傳統(tǒng)抗生素 具有調(diào)節(jié)原核生物和

3、真核生物生長和復(fù)制等生理功能的免疫調(diào)節(jié)劑、受體拮抗劑或激動劑、抗氧化劑、特異性酶抑制劑如部分他汀類調(diào)節(jié)血脂藥：洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀抗生素結(jié)構(gòu)的特點抗生素結(jié)構(gòu)的特點 純度一般較化學(xué)藥品低：同系物多、異構(gòu)體多、多組分、多晶型、降解產(chǎn)物多 發(fā)酵工藝中可變性較大，可控性較低：生產(chǎn)菌種不同，代謝產(chǎn)物差異，活性組分易發(fā)生變異，提取工藝不同 活性組分易發(fā)生變異，穩(wěn)定性一般較化學(xué)藥品差：分子結(jié)構(gòu)中通常含有較活潑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)為抗生素的活性基團(tuán)并易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生變化 雜質(zhì)譜復(fù)雜且難以預(yù)測抗生素的耐藥和研發(fā)抗生素的耐藥和研發(fā) “限抗令限抗令”：50種（三級），種（三級），35種（二級

4、）；細(xì)種（二級）；細(xì)菌耐藥菌耐藥“模式模式”的改變和的改變和“加劇加劇” 2011.4.7：WHO“世界衛(wèi)生日世界衛(wèi)生日”主題：細(xì)菌耐藥性主題：細(xì)菌耐藥性 20012011：FDA：3/12；達(dá)托霉素（脂肽類）、；達(dá)托霉素（脂肽類）、 瑞他帕林瑞他帕林（截短側(cè)耳素類）、菲達(dá)霉素（新型大截短側(cè)耳素類）、菲達(dá)霉素（新型大環(huán)類）環(huán)類） 近近30個候選藥物：個候選藥物：針對多藥耐藥革蘭陰性菌者少針對多藥耐藥革蘭陰性菌者少 抗菌藥的生命周期短，利潤低，研發(fā)難度大抗菌藥的生命周期短，利潤低，研發(fā)難度大 抗生素的研發(fā)：國外：受市場驅(qū)動，僅抗生素的研發(fā)：國外：受市場驅(qū)動，僅GSK和和AstraZeneca；國

5、內(nèi)：；國內(nèi)： “十一五十一五”、“十二五十二五”“抗耐藥菌創(chuàng)新藥物研發(fā)抗耐藥菌創(chuàng)新藥物研發(fā)”專題專題抗生素質(zhì)量的宏觀分析抗生素質(zhì)量的宏觀分析 利用各種分離分析手段對各種抗生素的純度（主要活性成分及其有關(guān)組分）進(jìn)行全面剖析，以達(dá)到對它們的本質(zhì)有一個宏觀的了解 通過對純度和組分的控制防止由于生產(chǎn)菌種和生產(chǎn)工藝的不同照成品種的混淆或假冒現(xiàn)象的發(fā)生抗生素質(zhì)量的宏觀分析抗生素質(zhì)量的宏觀分析 去甲萬古霉素，萬古霉素：NMR鑒別 萬古霉素B：BP/ChP：93.0%；USP：85.0% 制霉素：制霉菌素A3+多真菌素B+制霉菌素A1；效價和穩(wěn)定性均較高 制霉菌素：制霉菌素A1 HPLC、UV、IR、NMR、

6、MS抗生素質(zhì)量的微觀分析抗生素質(zhì)量的微觀分析雜質(zhì)分析雜質(zhì)分析 雜質(zhì)的定義：任何影響藥物純度的物質(zhì)。藥物中所含有的沒有治療作用、可能影響藥物的穩(wěn)定性和療效，甚至是對人體健康有害的物質(zhì) 雜質(zhì)研究的內(nèi)容：具體工藝及產(chǎn)品特點，雜質(zhì)的來源及結(jié)構(gòu)；合適的分析方法；綜合藥學(xué)、藥理毒理及臨床研究結(jié)果，確定合理的雜質(zhì)限度 抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 利用生物學(xué)、物理學(xué)、藥理學(xué)和化學(xué)等相關(guān)學(xué)科的經(jīng)典的或現(xiàn)代的技術(shù)和方法按照指定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行依法檢驗 性狀、鑒別、檢查和含量測定 性狀：粉末的顏色；晶型：氨曲南、利福平等 鑒別：紅外鑒別：多晶型，轉(zhuǎn)晶；手性構(gòu)型的鑒別；成鹽的酸根的鑒別（阿奇霉素鹽的種類的

7、選擇）；TLC法和HPLC法抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析熔點：多組分，熔距寬；紅霉素轉(zhuǎn)晶；氯霉素比旋度：組分控制：紅霉素A（-78），紅霉素C（-65-62），ChP：-78-71；手性異構(gòu)體純度的控制：磷霉素：異構(gòu)體無抗菌活性；磺芐西林：D()構(gòu)型的抗菌活性為L()構(gòu)型的抗菌活性的48倍（不同廠家產(chǎn)品的異構(gòu)體比例不同）抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 水分或干燥失重：游離水，結(jié)晶水 頭孢噻肟鈉：ChP：6.0%，國外藥典：3.0% 水活度的分析結(jié)合加速穩(wěn)定性實驗：水分含量低于3.0%時，可以基本消除水分對頭孢噻肟鈉穩(wěn)定性的影響 酸堿度（臨床、穩(wěn)定性、澄清度）抗生素質(zhì)量的常

8、規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 溶液的澄清度：酸中不溶性物質(zhì)（頭孢噻肟鈉）；膠塞等包材中的釋放物與藥物的相互作用 溶液的顏色：分離方法不能檢出的有色雜質(zhì)（頭孢呋辛鈉、頭孢曲松等） 熾灼殘渣和重金屬：無機(jī)雜質(zhì)；銅和鋅可促使-內(nèi)酰胺開環(huán) 雜質(zhì)吸光度：鹽酸多西環(huán)素（490nm）：檢查有色蛋白類雜質(zhì)、異構(gòu)體和降解物；兩性霉素A抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 抽針試驗：芐星青霉素（青霉素的二芐基乙二胺鹽）：混懸液，5號針頭（防止臨床使用時針頭被堵塞） 晶體的形狀及其粒徑與臨床用藥安全相關(guān)：肌注后由于顆粒太大引起局部組織紅腫等刺激性反應(yīng) 針頭堵塞的原因：晶粒的形狀、大小、分布不勻、晶粒之間的靜電引力

9、和凝聚等 制備過程中應(yīng)避免形成針狀結(jié)晶，以粉碎至平均粒徑約為150m的板狀結(jié)晶為佳殘留溶劑ICH：按照對人體和環(huán)境的危害程度分為四類并制定了限度標(biāo)準(zhǔn)中國藥典：在幾乎所有抗生素原料藥項下均按其生產(chǎn)工藝制定殘留溶劑檢查工藝不同，溶媒不同，同一品種可能有幾十種溶媒；以類別為單元，涵蓋同類藥品可能涉及的有機(jī)溶劑；ChP采用同一色譜條件頂空進(jìn)樣：標(biāo)準(zhǔn)加入法排除基質(zhì)干擾-內(nèi)酰胺類抗生素中2-乙基己酸的測定 加2-乙基己酸鈉（或碳酸氫鈉或醋酸鈉）成鹽、結(jié)晶 對人體和環(huán)境有潛在的毒害性 頭孢噻吩鈉、頭孢呋辛鈉、苯唑西林鈉等 GC法：13種人用-內(nèi)酰胺類抗生素和2種-內(nèi)酰胺酶抑制劑；限度規(guī)定為0.3%0.8%

10、33%鹽酸溶液溶解，環(huán)己烷提取，上層環(huán)己烷溶液進(jìn)樣分析 有些品種的樣品不能完全溶解-內(nèi)酰胺類抗生素中-萘酚的測定 頭孢菌素可選擇性的與-萘酚絡(luò)合并從水溶液中沉淀出來（頭孢菌素極少受到降解）；濾過分離；混懸液酸化，去絡(luò)合，有機(jī)溶劑萃?。唤Y(jié)晶 產(chǎn)品中-萘酚的殘留量差異較大 每天的允許攝入量為2mg/day，如成人每天服用抗生素的最高劑量為4g，則-萘酚的最大殘留量應(yīng)低于100 ppm ChP的HPLC法：頭孢克洛、頭孢拉定、頭孢氨芐、頭孢羥氨芐等抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 異常毒性：非藥品本身引起的毒性反應(yīng)；反映不同來源產(chǎn)品的質(zhì)量差異 USP1990不再收錄 熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素：劑量；

11、假陽性和假陰性 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的假陽性問題： 普通鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)是非特異性的，其凝集系統(tǒng)中存在著G因子反應(yīng)旁路，一些非內(nèi)毒素物質(zhì)可能含有可以活化鱟試劑G因子的成分，從而激活鱟試劑凝集系統(tǒng)中的G因子反應(yīng)旁路而發(fā)生凝集反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的假陽性抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 有關(guān)物質(zhì) 溶出度：與藥物生物利用度之間并無絕對的關(guān)系；制劑質(zhì)量控制的一種手段；反映不同產(chǎn)品主藥的晶型、粒度處方組成、輔料品種和性質(zhì)以及制劑工藝的差異 不溶性微粒和可見異物：光阻法：50m以下微粒 降壓物質(zhì) 無菌：微孔濾膜法；青霉素酶滅活法抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 裝量差異、片重差異等：可以

12、在一定程度上反映生產(chǎn)工藝的成熟性 含量測定：微生物檢定法和理化測定法 阿奇霉素片：含量分布呈明顯正態(tài)分布，含量均值為96；采用微生物檢定法的結(jié)果較HPLC法的結(jié)果約高為5 微生物檢定法：利用抗生素對細(xì)菌的殺死或抑制程度作為指標(biāo)來衡量抗生素的效力 管碟法和比濁法抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析抗生素質(zhì)量的常規(guī)分析 理化測定法： 滴定法（酸堿、氧化還原、電位） 紫外光或熒光吸收法 HPLC-UV法、HPLC-ELSD法（ChP氨基糖苷類） 、HPLC-柱后衍生化-UV法（異帕米星）、HPLC-ECD法（BP氨基糖苷類、USP阿奇霉素） GC法（BP大觀霉素， BP灰黃霉素， USP克林霉素棕櫚酸酯）抗生素中的

13、致敏性雜質(zhì)抗生素中的致敏性雜質(zhì) -內(nèi)酰胺類抗生素過敏反應(yīng)的研究：致敏性高分子雜質(zhì) 外源性雜質(zhì)：蛋白、多肽、多糖等，或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的結(jié)合物。如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等 內(nèi)源性雜質(zhì)：抗生素的自身聚合產(chǎn)物，即抗生素寡聚物和多聚物的總稱凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用 Sephadex G10凝膠色譜系統(tǒng)：色譜柱效低、分離效果差 不能有效分離不同聚合度的聚合物，易受開環(huán)物等小分子雜質(zhì)的干擾 受制劑中輔料的干擾 常用的-內(nèi)酰胺酶抑制劑與聚合物同時洗脫 無法應(yīng)用于水溶性差的-內(nèi)酰胺酯 不能分離碳青霉烯類中的聚合物高效凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用高效凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用 高效Superdex Pi

14、ptide（葡聚糖交聯(lián)瓊脂糖）凝膠色譜系統(tǒng) 阿莫西林片中不同聚合度的聚合物 美羅培南中聚合物 青霉素V鉀顆粒中聚合物 高效TSK 2000SWXL（親水性多孔硅膠）凝膠色譜系統(tǒng) ChP:頭孢地嗪鈉高效凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用高效凝膠色譜系統(tǒng)的應(yīng)用 高效TSK2500 PWXL（乙烯共聚物）凝膠色譜系統(tǒng) 阿莫兩林鈉克拉維酸鉀片中阿莫西林聚合物的分析 高效TSK Gel G2500 HXL（苯乙烯-二乙烯苯共聚物）疏水凝膠色譜系統(tǒng) 鹽酸頭孢卡品酯（cefcapene prvoxil hydrochloride）中的聚合物 頭孢泊肟酯中的聚合物高效液相色譜系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng) 指針性雜質(zhì)：阿莫西林鈉、氨芐

15、西林鈉 阿莫西林/克拉維酸鉀制劑：阿莫西林閉環(huán)二聚體為最大雜質(zhì)且與雜質(zhì)總量呈一定的相關(guān)性 在溶液中，阿莫西林閉環(huán)二聚體和二酮哌嗪阿莫西林的含量與各類阿莫西林聚合物含量之和呈一定的相關(guān)性生產(chǎn)工藝對氨芐西林鈉質(zhì)量的影響生產(chǎn)工藝對氨芐西林鈉質(zhì)量的影響 生產(chǎn)工藝：溶媒結(jié)晶法（雜質(zhì)水平低，穩(wěn)定性高）、冷凍干燥法和噴霧干燥法 閉環(huán)二聚體雜質(zhì)：含量與變化與產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝有關(guān) 溶媒結(jié)晶工藝：閉環(huán)二聚體含量低且隨放置時間的增加增長緩慢 冷凍干燥工藝：閉環(huán)二聚體含量高且隨放置時間的增加增長迅速水活度的概念水活度的概念 固體中水分子的存在形式可分為自由水和結(jié)合水；只有自由水參與各類物理或化學(xué)反應(yīng)；其含量是影響樣品穩(wěn)

16、定性的主要因素 水活度（water activity）：反映的是固體中水與各種非水成分締合的強(qiáng)度，是樣品中所含有的自由水的度量值；反映了樣品中直接參與物理化學(xué)反應(yīng)的自由水的含量氨芐西林鈉產(chǎn)品的開環(huán)二聚體含量氨芐西林鈉產(chǎn)品的開環(huán)二聚體含量與水活度的關(guān)系與水活度的關(guān)系 開環(huán)二聚體：含量隨著樣品水活度的增加而增加并在溶媒結(jié)晶工藝產(chǎn)品中較高 溶媒結(jié)晶的產(chǎn)品：具有較高的自由水含量，易發(fā)生水解反應(yīng)；水活度較大，水解反應(yīng)易于發(fā)生，產(chǎn)生開環(huán)二聚體 冷凍干燥的產(chǎn)品：水活度低，不易產(chǎn)生開環(huán)二聚體 樣品中開環(huán)二聚體的含量可以間接反映其水活度的大小鹽酸頭孢吡肟中鹽酸頭孢吡肟中N-甲基吡咯烷的檢測甲基吡咯烷的檢測 具有

17、中度急性毒性和明顯的致畸變性 BP、USP、JP：非抑制型IC，磺酸基鍵合硅膠為填充劑 ChP：tITP-CZE和非抑制型IC（羧基鍵合硅膠為填充劑 ） IC：須配制含頭孢吡肟和NMP的混合溶液進(jìn)樣分析以便確認(rèn)供試品溶液色譜圖中的NMP+峰 鹽酸頭孢吡肟中鹽酸頭孢吡肟中N-甲基吡咯烷的甲基吡咯烷的IC檢測檢測 供試品溶液色譜圖中NMP + 峰的保留時間較其在NMP對照品溶液色譜圖中縮短約10% 供試品溶液進(jìn)樣后，大量強(qiáng)保留的荷正電離子占據(jù)了部分陽離子交換功能基 固定相在保留強(qiáng)保留的荷正電離子的同時釋放了等摩爾量的氫離子，后者對弱保留的荷正電離子起到一種微梯度洗脫的作用鹽酸頭孢吡肟中鹽酸頭孢吡肟

18、中N-甲基吡咯烷的甲基吡咯烷的tITP-CZE檢測檢測 前導(dǎo)離子：高濃度的探針離子（咪唑） 終結(jié)離子：質(zhì)子化的頭孢比肟和氫離子；質(zhì)子化的精氨酸 在毛細(xì)管前端構(gòu)建tITP體系：樣品自身堆積效應(yīng)富積NMP + ，可大體積進(jìn)樣并避免區(qū)帶的展寬 操作緩沖液的pH值（4.7）：處于47的安全區(qū)間；避免CZE過程中被測組分區(qū)帶的變形以及氫離子作為同離子對檢測靈敏度的降低 檢測限和定量限：分別相當(dāng)于頭孢比肟量的0.003%和0.01% MEKC和HPLC檢測頭孢噻吩鈉的雜質(zhì)譜 某些品牌填料的色譜柱：頭孢噻吩峰前端未知雜質(zhì)峰(ChP對照品)（雜質(zhì)A） 化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則：各種分離系統(tǒng)均具有一定的局

19、限性，應(yīng)注意不同原理的分離系統(tǒng)間的相互補(bǔ)充與驗證 HPLC與TLC、HPLC與CE、反相HPLC與正相HPLC、反相HPLC與HILIC等 各國藥典：TLC或GC 還原型谷胱甘肽：CE(EP/BP)NSOONaOCH3OONHSOH H慶大霉素慶大霉素慶大霉素的RP-IP-HPLC-PED圖譜慶大霉素的RP-IP-HPLC-ELSD圖譜Analysis of underivatized gentamicin by CE-UV detection卡那霉素的EMMA-CZE圖（上）和precapillary-derivatization-CZE圖（下）卡那霉素的CZE-C4D電泳圖磷霉素：磷霉素：

20、1969年自弗氏鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)年自弗氏鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)磷霉素氨丁三醇的HPLC圖 b d a fosfomycin c e 以山梨酸為探針試劑的tITP-CZE-間接UV法檢測淌度小于磷霉素的雜質(zhì)min99.51010.51111.512Norm.-40-35-30-25-20-15-10-5 DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO00000005.D) DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO00000009.D) DAD1 C, Sig=235,4 Ref=off (LIUHAO00000012.D)以鄰苯二甲酸為探針試劑的CZE-間接UV法

21、檢測淌度大于磷霉素的雜質(zhì)min81012141618Norm.-200-150-100-50050100150 DAD1 A, Sig=225,4 Ref=off (LIUHAO00000499.D) DAD1 A, Sig=225,4 Ref=off (LIUHAO00000500.D)復(fù)方藥物各成分之間的相互作用復(fù)方藥物各成分之間的相互作用利福霉素類復(fù)方藥物：異煙肼利福霉素腙制劑輔料與藥物的相容性研究制劑輔料與藥物的相容性研究 乳糖：半縮醛羥基醛式，可與含有伯胺類結(jié)構(gòu)的化合物發(fā)生縮和反應(yīng)，生成腙與糖脎等衍生物 利福霉素類復(fù)方藥物：異煙肼與乳糖膠塞與抗生素的相容性研究膠塞與抗生素的相容性研究

22、 注射用抗生素粉針劑溶液的澄清度 五水頭孢唑林鈉/頭孢唑林鈉水合物 無定形頭孢唑林鈉：不溶于水的復(fù)合物 瓶間差異，接觸時間，大規(guī)格 膠塞：材質(zhì)（覆膜膠塞：四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯，溴化丁基膠塞）；硅油（壓蓋時的滑動性，跳塞）殘留量；清洗方式、水溫、水質(zhì)注射用頭孢拉定致血尿不良反應(yīng)的注射用頭孢拉定致血尿不良反應(yīng)的藥理學(xué)研究藥理學(xué)研究 結(jié)論：大劑量（高濃度）藥物會在腎臟中積聚形成結(jié)晶，對腎臟產(chǎn)生一定的化學(xué)毒性和物理性損傷；低劑量時，大量不溶性微粒可能引發(fā)血尿不良反應(yīng)；日齡較小的動物更易引發(fā)血尿不良反應(yīng) 濃度越高，不溶性微粒數(shù)目就越多 藥品的溶解方式宜振蕩溶解抗生素質(zhì)量分析的展望抗生素質(zhì)量分析的展望 質(zhì)量源于設(shè)計（QbD）的理念：產(chǎn)品的特性和生產(chǎn)工藝參數(shù)均是為達(dá)到特定的治療目標(biāo)科學(xué)設(shè)計的，而不是對其經(jīng)驗數(shù)據(jù)的簡單總結(jié) 根據(jù)先進(jìn)工藝的特點理性地確定工藝異常時各項指標(biāo)的的限度，并據(jù)此阻止采用落后生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品上市抗生素質(zhì)量分析的展望抗生素質(zhì)量分析的展望 雜質(zhì)檢查：對不同來源的雜質(zhì)設(shè)定不同的限度，控制起始原料的質(zhì)量、合成工藝的優(yōu)劣和生產(chǎn)過程 特定雜質(zhì)：如安全性沒有進(jìn)行過評估，其限度均按通則的要求（ICH）確定 僅從安全性的角度考慮雜質(zhì)的限度：不