探針的標(biāo)記及產(chǎn)物的純化

1、探針的標(biāo)記和標(biāo)記產(chǎn)物的純化探針的標(biāo)記和標(biāo)記產(chǎn)物的純化三種標(biāo)記方法三種標(biāo)記方法 PCR標(biāo)記標(biāo)記 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 隨機(jī)引物標(biāo)記隨機(jī)引物標(biāo)記兩種純化方法兩種純化方法 Microcon30filter法法 直接沉淀法直接沉淀法 PCR PCR標(biāo)記標(biāo)記 1 1 將將2g2g待標(biāo)記的樣品待標(biāo)記的樣品DNADNA加入到加入到 PCR PCR 反應(yīng)反應(yīng)管中管中 2 2 在冰上，加：在冰上，加： 反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液 5l 25 mM MgCl 2 4l 10 mM dATPdGTPdTTP 1l 1 mM dTTP 1l 10 M 引物混合物引物混合物 1l1l 雙蒸水雙蒸水 36.5l 0.1 mM

2、CY5-dUTP 1l Taq DNA 聚合酶聚合酶 0.5l PCRPCR標(biāo)記標(biāo)記 3.混勻上述試劑后，將混勻上述試劑后，將PCR反應(yīng)管置于反應(yīng)管置于PCR儀中，按下列程序進(jìn)行儀中，按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：反應(yīng)：951.5min950.5min550.5min720.5mingotofor39cycles725min4foreverEND 4.取出取出PCR反應(yīng)管，反應(yīng)管，-20避光保存待避光保存待雜交雜交反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 1.將待標(biāo)記的樣品將待標(biāo)記的樣品mRNA（約（約2-3g）加到）加到RNase-free1.5ml離離心管中，加適量雙蒸水，使體積為心管中，加適量雙蒸水，使體積為6

3、0l 2.向離心管中加入向離心管中加入3l10m的的OligodT183.混勻上述試劑后，于混勻上述試劑后，于72變性變性5min反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 4.變性后的離心管立即置于冰變性后的離心管立即置于冰上冷卻，再加入下列試劑：上冷卻，再加入下列試劑：5First Strand Buffer 20l 0.1M DTT 10l 10 mM dATP dGTP dTTP 2l 1 mM dTTP 2l SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 1.5l 1 mM CY-dUTP 2l反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 5.混勻上述試劑后，于混勻上述試劑后，于37保溫保溫5min或或26保溫保溫10min

4、6.42保溫保溫60min 7.補(bǔ)加反轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)加反轉(zhuǎn)錄酶0.75l，然后繼續(xù)，然后繼續(xù)于于42保溫保溫30min 8.取出取出PCR反應(yīng)管，反應(yīng)管，-20避光保避光保存待雜交存待雜交反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 9.用雙蒸水調(diào)整探針混合物，使體用雙蒸水調(diào)整探針混合物，使體積為積為12l，然后加入，然后加入2.55l20SSC（使終濃度為（使終濃度為3.4）和）和0.45l10%SDS（使終濃度為（使終濃度為0.3%） 10.將雜交混合物將雜交混合物95變性變性1.5min37溫浴溫浴30hr（Cot-1預(yù)退火）預(yù)退火）和微矩陣雜交和微矩陣雜交隨機(jī)引物標(biāo)記隨機(jī)引物標(biāo)記 比較基因組雜交中基因組比較基因組雜

5、交中基因組DNA可用可用Gibco/BRL的的BioPrimeDNA標(biāo)記試劑盒標(biāo)記試劑盒中簡(jiǎn)單的隨機(jī)引物標(biāo)記中簡(jiǎn)單的隨機(jī)引物標(biāo)記 1.將將2g待標(biāo)記的樣品待標(biāo)記的樣品DNA加入一離心管加入一離心管中中 2.加適量雙蒸水或加適量雙蒸水或TEbuffer（pH8.0），），使總體積為使總體積為21l，再加，再加20l2.5隨機(jī)引隨機(jī)引物和反應(yīng)緩沖液的混合物，煮沸物和反應(yīng)緩沖液的混合物，煮沸5min后置后置于冰上于冰上隨機(jī)引物標(biāo)記隨機(jī)引物標(biāo)記 3.加加5l10dNTP混合物混合物10dNTP混合物混合物:1.2mMdATPdGTPdTTP0.6mMdCTP10mMTris（pH8.0）1mMEDTA

6、隨機(jī)引物標(biāo)記隨機(jī)引物標(biāo)記 4.加加3lCY5-dCTP或或CY3-dCTP（Amersham，濃度為，濃度為1mM）；）； 5.加加1l大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I大片大片段；段； 6.37溫浴溫浴1-2hr，然后加，然后加5l0.5MEDTA（pH8.0）來(lái)終止反應(yīng)）來(lái)終止反應(yīng)Microcon30filter純化純化（Amicon/Millipore） 1.向已終止的標(biāo)記體系中加入向已終止的標(biāo)記體系中加入450l（pH7.4）TE 2.放在放在microcon30filter中，以中，以8000g旋渦旋渦10min（或在微量離心（或在微量離心機(jī)中以機(jī)中以10000r/min離心）離心） 3.以以8000g旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)1min，回收純化，回收純化的探針于一新管（約的探針于一新管（約2040l）直接沉淀