檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間相互作用

1、檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)方法比較1 .生化方法免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。改法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白處于天然狀態(tài)，蛋白的相互作用可以在天然狀態(tài)下進(jìn)行，可以避免認(rèn)為影響；可以分離得到天然狀態(tài)下相互作用的蛋白復(fù)合體。缺點(diǎn)：免疫共沉淀同樣不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物時(shí)候?yàn)橹苯酉嗷プ饔玫膬煞N蛋白。另外靈敏度不如親和色譜高。Far-Western又叫做親和印記。將PAGE交上分離好的凡百樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后檢測(cè)哪種蛋白能與標(biāo)記了同位素的誘餌蛋白發(fā)生作用，最后顯影。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜前需要將蛋白復(fù)性。2 .等離子表面共振技術(shù)(Surfaceplas

2、monresonance)該技術(shù)是將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面，葡聚糖層固定于幾十納米厚的技術(shù)膜表面。當(dāng)有蛋白質(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，從而導(dǎo)致共振角度的改變。而共振角度的改變與該處的蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系，由此可以檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)不需要標(biāo)記物和染料，安全靈敏快速，還可定量分析。缺點(diǎn)：需要專門的等離子表面共振檢測(cè)儀器。3 .雙雜交技術(shù)原理基于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特殊性，這些轉(zhuǎn)錄因子通常需要兩個(gè)或以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成。分別使結(jié)合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細(xì)胞中表達(dá)，如果兩種蛋白可以發(fā)

3、生相互作用，則可使結(jié)合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報(bào)告基因。缺點(diǎn)：自身有轉(zhuǎn)錄功能的蛋白會(huì)造成假陽(yáng)性。融合蛋白會(huì)影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。不利于核外蛋白研究，會(huì)導(dǎo)致假隱性。5.熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)指兩個(gè)熒光法色基團(tuán)在足夠近（100埃）時(shí)，它們之間可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)可以研究分子內(nèi)部對(duì)某些刺激發(fā)生的構(gòu)象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測(cè)，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測(cè)大分子的構(gòu)象變化，能夠定性定量的檢測(cè)相互作用的強(qiáng)度。缺點(diǎn)此項(xiàng)技術(shù)要求發(fā)色基團(tuán)的距離小于100埃。另外設(shè)備昂貴，還需要融合GFP合蛋白標(biāo)記。此外還有交聯(lián)技術(shù)（cross-linKing）,蛋白

4、質(zhì)探針技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（Phagedisplay）以及生物信息學(xué)的方法來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用。1,酵母雙雜交1-5酵母雙雜交系統(tǒng)是將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL4?）的DNA吉合結(jié)構(gòu)域基因和轉(zhuǎn)錄激活因子（如GAL得）激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達(dá)載體，從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)酵母雙雜交的原理是，把報(bào)告基因HIS3和lacZ整合到酵母細(xì)胞基因組中，并受轉(zhuǎn)錄因子GAL4的調(diào)控表達(dá)。一旦GAL4蛋白結(jié)合到HIS3和lacZ調(diào)控序列相應(yīng)的位點(diǎn)，則啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)判斷陽(yáng)性或陰性。實(shí)際應(yīng)用中，把GAL4基因分成兩個(gè)部分

5、：DNA結(jié)合區(qū)(gal4DNAbindingdomain,GBD)和激活區(qū)(gal4activatingdomain,GAD)。分別把GBD和GAD構(gòu)建到兩個(gè)不同的載體上，并能表達(dá)相應(yīng)的兩個(gè)融合蛋白(GBD-X和GAD-Y。然后把GBD-X和GAD-Y兩種載體共轉(zhuǎn)染到帶有報(bào)告基因的酵母細(xì)胞中。當(dāng)GBD-X融合蛋白中X蛋白與GAD-Y融合蛋白中Y蛋白發(fā)生相互作用時(shí)(或結(jié)合在一起時(shí))，就使得原本分開(kāi)的GBD和GAD蛋白靠近并具有完整的GAL4蛋白的功能，從而能夠激活報(bào)告基因的表達(dá)。(1)篩選相互作用的蛋白酵母雙雜交技術(shù)能用于對(duì)cDNA文庫(kù)的篩選。把你要研究的蛋白亞克隆到GBD載體上，作為“誘餌”蛋

6、白。把文庫(kù)蛋白基因亞克隆到GAD載體上。然后就可以在文庫(kù)中尋找那些能夠與“誘餌”蛋白可以相互作用的蛋白。也許你能夠篩選到多株陽(yáng)性克隆。雖然酵母雙雜交技術(shù)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但正如任何其它技術(shù)一樣，酵母雙雜交技術(shù)也有一定的局限性。酵母雙雜交技術(shù)最大的弱點(diǎn)就是假陽(yáng)性出現(xiàn)率。所以篩選到的陽(yáng)性克隆需要進(jìn)一步的鑒定和功能數(shù)據(jù)支持。（2）確定參與結(jié)合作用的結(jié)構(gòu)域或motif當(dāng)你確定了兩個(gè)蛋白質(zhì)分子之間有相互作用后，利用酵母雙雜交技術(shù)可以精細(xì)研究蛋白質(zhì)分子中那些結(jié)構(gòu)起結(jié)合調(diào)節(jié)作用。你可以先把一個(gè)蛋白進(jìn)行隨機(jī)缺失，制備一系列缺失體，然后來(lái)檢測(cè)這些缺失體與另一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合力的大小，直到發(fā)現(xiàn)在蛋白質(zhì)兩兩分子間起決

7、定作用的氨基酸序列（稱為結(jié)構(gòu)域或motif）。如果一個(gè)蛋白分子中具有已知的結(jié)構(gòu)域或motif,也一樣進(jìn)行缺失，看是否這些已知的結(jié)構(gòu)域或motif參與結(jié)合調(diào)節(jié)作用。有的情況下蛋白質(zhì)相互作用可能與蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)有關(guān)。這時(shí)就需要對(duì)可能的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，檢測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)是否參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的結(jié)合作用。2, GS砧淀實(shí)驗(yàn)（GST-pulldown實(shí)驗(yàn)）（細(xì)胞外蛋白質(zhì)相互作用）5-11上面提到，用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進(jìn)一步的鑒定。鑒定方法之一就是GST沉淀實(shí)驗(yàn)。GST沉淀實(shí)驗(yàn)主要是用來(lái)證明蛋白質(zhì)胞外的相互作用。蛋白質(zhì)在胞外的相互作用排除了酵母細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜體系的干擾，比較直接地檢驗(yàn)蛋白質(zhì)

8、分子之間存在的物理的相互作用。同酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)一樣，運(yùn)用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調(diào)節(jié)作用的結(jié)構(gòu)域或motifGST沉淀實(shí)驗(yàn)原理就是，把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)基因的原核表達(dá)載體中，并在細(xì)菌中表達(dá)GST融合蛋白(GST-X)。把GST融合蛋白掛到帶有GST地物的Sepharosebeads上，然后把另一種蛋(Y)白加入其中。由于蛋白質(zhì)之間的結(jié)合作用，形成了這樣的復(fù)合物：GST-X-Y。這一復(fù)合物與固體支持物(Sepharosebeads)又結(jié)合在一起，可以被沉淀下來(lái)。此法又有在不同情況下的具體應(yīng)用，以下一一作介紹。(1) GST融合蛋白與重組蛋白

9、的相互作用GST融合蛋白是在原核表達(dá)的，所以沒(méi)有經(jīng)過(guò)過(guò)多的象真核細(xì)胞內(nèi)具有的蛋白修飾作用。所以另一種用來(lái)檢驗(yàn)相互作用的蛋白也可以用原核表達(dá)出來(lái)，也就是所謂的重組蛋白。當(dāng)GST融合蛋白把重組蛋白沉淀下來(lái)，然后用重組蛋白的抗體作Westernblotting檢測(cè)。(2) GST融合蛋白與體外TNT系統(tǒng)合成的多肽或蛋白的相互作用用來(lái)檢驗(yàn)與GSTB合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進(jìn)行合成，并且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便于檢測(cè)的標(biāo)簽。GST融合蛋白沉淀下來(lái)的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標(biāo)簽抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)。如果蛋白之間結(jié)合力非常弱

10、，用Westernblotting檢測(cè)方法難以檢測(cè)到，你可以在TNT體外合成時(shí)給蛋白進(jìn)行同位素(S32)標(biāo)記。這樣沉淀下來(lái)的蛋白進(jìn)行放射自顯影，檢測(cè)靈敏度將極大提高。(3) GST融合蛋白與細(xì)胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)的相互作用GST融合蛋白還可以把細(xì)胞提取物中有相互作用的內(nèi)源性蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)。如果內(nèi)源性蛋92白含量低或結(jié)合力弱，可以采用脈沖法使細(xì)胞在某一段時(shí)間內(nèi)合成的所有蛋白都標(biāo)記上放射性同位素(S32),然后提取細(xì)胞總蛋白與GST融合蛋白溫育。GST融合蛋白沉淀下的帶有放射性標(biāo)記的蛋白跑電泳，進(jìn)行放射自顯影。(4) GST融合蛋白與細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用當(dāng)內(nèi)源性蛋白質(zhì)含量低，并且有可能影響蛋

11、白質(zhì)的相互作用，也可以把該蛋白的基因轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行過(guò)表達(dá)，然后檢驗(yàn)蛋白質(zhì)相互作用。(5) GST融合蛋白與待測(cè)蛋白的相互作用有可能與待測(cè)蛋白的磷酸化狀態(tài)有關(guān)在進(jìn)行GST沉淀實(shí)驗(yàn)時(shí)，有時(shí)也會(huì)遇到比較復(fù)雜的情況，具體情況具體分析，分別對(duì)待。比如，兩個(gè)蛋白質(zhì)之間發(fā)生相互作用時(shí)有可能與蛋白磷酸化狀態(tài)有關(guān)。或者蛋白首先被磷酸化后方能產(chǎn)生相互作用，或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化后才能產(chǎn)生相互作用。如果你確實(shí)在你的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了其中一種情況，這將是一個(gè)非常有意義的結(jié)果。3, 免疫共沉淀(co-immunoprecip讓ation)(細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用）9-16免疫共沉淀技術(shù)用來(lái)證明蛋白質(zhì)在胞內(nèi)是否有相互作

12、用。一般來(lái)說(shuō)，兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時(shí)會(huì)形成兩種蛋白的復(fù)合物，這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復(fù)合物沉淀下來(lái)，然后用另一種蛋白的抗體進(jìn)行Westernblotting檢測(cè)，看兩種蛋白之間是否確實(shí)形成免疫復(fù)合物，并能與proteinA/Gagarose一起沉淀下來(lái)。免疫共沉淀原理簡(jiǎn)單，但技術(shù)極為復(fù)雜。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)蛋白種類繁多，制約因素多。如果兩種蛋白之間可以發(fā)生相互作用，并不是這兩種蛋白所有分子都參與結(jié)合作用，也可能只有極少部分蛋白分子結(jié)合在一起（足以滿足細(xì)胞功能需要）。在提取細(xì)胞蛋白時(shí)，如果條件不當(dāng)就會(huì)破壞兩種相互作用蛋白形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性使得免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)失敗。如果兩種蛋白在細(xì)胞內(nèi)的

13、結(jié)合力確實(shí)非常弱，那么免疫共沉淀也難以成功。如果知道發(fā)生相互作用的兩個(gè)蛋白都是胞核蛋白，那么可以通過(guò)提取核蛋白，再進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，這樣會(huì)大大減低背景的干擾。關(guān)于兩種蛋白質(zhì)之間胞內(nèi)的相互作用，有時(shí)確實(shí)無(wú)法用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明。（1）細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)蛋白的免疫共沉淀證明蛋白質(zhì)胞內(nèi)相互作用時(shí)，可以選擇一個(gè)高效瞬時(shí)過(guò)表達(dá)系統(tǒng)（至于這一系統(tǒng)是否有內(nèi)源性靶蛋白無(wú)關(guān)緊要）。一般采取COS細(xì)胞作為真核表達(dá)株。把兩種蛋白基因共轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。由于人為進(jìn)行大量表達(dá)，所以在胞內(nèi)兩種蛋白形成相互作用的復(fù)合物的量也相應(yīng)增多。如果你手頭沒(méi)有這兩種蛋白的抗體，可以把這兩種蛋白的一端分別加上標(biāo)簽以融合蛋白形式表達(dá)

14、，然后用商業(yè)化的抗標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫共沉淀和Westernblotting檢測(cè)。(2)細(xì)胞內(nèi)源性蛋白的免疫共沉淀把兩種蛋白共轉(zhuǎn)染到COS細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行過(guò)表達(dá)，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，相對(duì)容易成功，但是這一結(jié)果畢竟具有人工性，不能代表生理?xiàng)l件下真實(shí)的蛋白質(zhì)相互作用。要想克服這一弱點(diǎn)，可以做內(nèi)源性的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。這一技術(shù)要求極高，難度極大，但也最有說(shuō)服力。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)內(nèi)源性蛋白含量低，結(jié)合在一起形成復(fù)合物的量更低，難以檢測(cè)。首先要證明所選擇的細(xì)胞93系是否具有這兩種內(nèi)源性的蛋白。另外，用于免疫沉淀和Westernblotting檢測(cè)的體要好。細(xì)胞裂解、收集以及免疫沉淀時(shí)時(shí)條件要溫和，以保持蛋白復(fù)合物的天然結(jié)

15、構(gòu)。(3)組織內(nèi)蛋白的免疫共沉淀在體外可以大量培養(yǎng)細(xì)胞，然后制備細(xì)胞提取物，做內(nèi)源性免疫共沉淀。由此可以推廣到做組織內(nèi)免疫共沉淀。取動(dòng)物組織(腦、肝、脾等)，切碎，勻漿，提取組織蛋白，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。這一結(jié)果代表活體中蛋白質(zhì)相互作用。4,蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn)17-22另一種經(jīng)常用來(lái)檢驗(yàn)蛋白質(zhì)相互作用的方法是蛋白質(zhì)細(xì)胞內(nèi)定位技術(shù)。此法較為直觀，可以看到兩種有相互作用的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細(xì)胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內(nèi)共定位等等）。有時(shí)相互作用的蛋白由于細(xì)胞內(nèi)某種功能的需要結(jié)合在一起時(shí)，使得兩種蛋白的分布發(fā)生變化。比如，某種蛋白也許在

16、核內(nèi)，當(dāng)它與另一種具有穿梭功能的蛋白結(jié)合時(shí)，有可能被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿中。這種情況的共定位則較為典型。在進(jìn)行蛋白質(zhì)共定位（1）利用有色熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行蛋白定位研究此法也可稱為活細(xì)胞定位。把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光熒光顯微鏡直接觀測(cè)。在進(jìn)行精確細(xì)胞定位或共定位時(shí)，必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)楣簿劢篃晒怙@微鏡（相當(dāng)于醫(yī)院給病人診斷的CT）觀測(cè)的是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)切面上的顏色。如果在一個(gè)切面上在同一區(qū)域看到兩種顏色，就提示這兩種蛋白在該區(qū)域內(nèi)有相互作用。普通熒光顯微鏡看到的是一個(gè)立體圖象，無(wú)法確定蛋白質(zhì)共定位現(xiàn)象。在進(jìn)行定位或共定位同時(shí)，也可以對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。這樣，在細(xì)胞中就有三種顏色。細(xì)胞核的顯色幫助你確定共定位發(fā)生的位置。上面介紹的活細(xì)胞定位，具優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)的熒光蛋白熒光強(qiáng)，沒(méi)有背景，觀測(cè)方便。但缺點(diǎn)是相互作用的蛋白由于標(biāo)上熒光蛋白，實(shí)際上是兩個(gè)融合蛋白。融合蛋白的定位結(jié)果或共定位結(jié)果是否與天然蛋白分布一致，有待于進(jìn)一步確定。而利用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)可以避免這一缺點(diǎn)。（2）利用雙色或多色染色的免疫熒光技術(shù)進(jìn)行蛋白定位研究免疫