實(shí)驗(yàn)一細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1

1、實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一一、定義、定義細(xì)胞培養(yǎng)（細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）是指將動(dòng)物組織或細(xì)胞分）是指將動(dòng)物組織或細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，在模擬機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境下使其繼散成單個(gè)細(xì)胞，在模擬機(jī)體內(nèi)的生長(zhǎng)環(huán)境下使其繼續(xù)生長(zhǎng)增殖的過程。續(xù)生長(zhǎng)增殖的過程。一般一般體外培養(yǎng)的細(xì)胞不會(huì)發(fā)生分化成為組織，在體體外培養(yǎng)的細(xì)胞不會(huì)發(fā)生分化成為組織，在體外培養(yǎng)的條件下可以觀察細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律，此外外培養(yǎng)的條件下可以觀察細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律，此外收獲細(xì)胞本身的同時(shí)也可以收獲細(xì)胞的產(chǎn)物。收獲細(xì)胞本身的同時(shí)也可以收獲細(xì)胞的產(chǎn)物。1、美國生物學(xué)家哈里森于、美國生物學(xué)家哈里森于1907年采用蓋片覆蓋凹窩玻

2、璃懸滴培年采用蓋片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周，開創(chuàng)了養(yǎng)法將蛙胚的神經(jīng)組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周，開創(chuàng)了細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)。2、1923年，卡瑞爾發(fā)明了卡士瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了培養(yǎng)組織的生年，卡瑞爾發(fā)明了卡士瓶培養(yǎng)法，擴(kuò)大了培養(yǎng)組織的生存空間。存空間。3、1951年，厄爾利開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，動(dòng)物細(xì)年，厄爾利開發(fā)了動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)開始形成。胞培養(yǎng)技術(shù)開始形成。4、20世紀(jì)世紀(jì)70年代，大規(guī)模微生物培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，幾乎代替了年代，大規(guī)模微生物培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，幾乎代替了動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)，但在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了許多生物活性蛋白動(dòng)

3、物的細(xì)胞培養(yǎng)，但在生產(chǎn)過程中，出現(xiàn)了許多生物活性蛋白質(zhì)只能在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，因?yàn)樵思?xì)胞缺乏蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修質(zhì)只能在動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，因?yàn)樵思?xì)胞缺乏蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄后修飾能力，也不能將蛋白質(zhì)產(chǎn)物自動(dòng)分泌到細(xì)胞外。飾能力，也不能將蛋白質(zhì)產(chǎn)物自動(dòng)分泌到細(xì)胞外。5、20世紀(jì)世紀(jì)80年代：基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)迅速發(fā)展，能年代：基因工程技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)迅速發(fā)展，能把特定的外源基因轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表把特定的外源基因轉(zhuǎn)染到動(dòng)物細(xì)胞體內(nèi)，使其得到高質(zhì)量的表達(dá)。達(dá)。二、發(fā)展的歷史二、發(fā)展的歷史包括包括病毒疫苗，非抗體免疫調(diào)節(jié)劑，多肽生病毒疫苗，非抗體免疫調(diào)節(jié)劑，多肽生長(zhǎng)因子，酶類，激素，腫瘤

4、特異性抗原，單長(zhǎng)因子，酶類，激素，腫瘤特異性抗原，單克隆抗體，病毒殺蟲劑等?？寺】贵w，病毒殺蟲劑等。三、動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品三、動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品1.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式貼附生長(zhǎng)：貼附生長(zhǎng)： 必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。體瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng)：懸浮生長(zhǎng)： 于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。表面。見于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性四、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性2.每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期游離期貼壁期貼

5、壁期潛伏期潛伏期對(duì)數(shù)期對(duì)數(shù)期平臺(tái)期平臺(tái)期衰退期衰退期2.每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程游離期：游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)也稱懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。一般維持懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。一般維持10分鐘至分鐘至4小時(shí)。小時(shí)。貼壁期：貼壁期：細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株細(xì)胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在平均在10分鐘至分鐘至4小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑小時(shí)貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細(xì)胞等。料、其它細(xì)胞等。潛伏期：潛伏期：貼壁后并不馬上分裂而是有一個(gè)潛伏期，貼壁后并不馬上分裂而是有

6、一個(gè)潛伏期，該期長(zhǎng)短與接種量、細(xì)胞種類有關(guān)，一般為該期長(zhǎng)短與接種量、細(xì)胞種類有關(guān)，一般為6至至24小小時(shí)。時(shí)。2.每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂旺盛，可持續(xù)細(xì)胞分裂旺盛，可持續(xù)35天，天，細(xì)胞接觸匯合成片，腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞接觸匯合成片，腫瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞堆積，正常細(xì)胞無此現(xiàn)象。細(xì)胞堆積，正常細(xì)胞無此現(xiàn)象。穩(wěn)定期（平臺(tái)期）：穩(wěn)定期（平臺(tái)期）：細(xì)胞達(dá)一定數(shù)量后，由于細(xì)胞達(dá)一定數(shù)量后，由于培養(yǎng)空間與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物積累培養(yǎng)空間與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，特別是代謝廢物積累的不利條件下，細(xì)胞進(jìn)入新生的細(xì)胞數(shù)等于死亡的不利條件下

7、，細(xì)胞進(jìn)入新生的細(xì)胞數(shù)等于死亡細(xì)胞數(shù)的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)間。細(xì)胞數(shù)的動(dòng)態(tài)平衡時(shí)間。衰亡期：衰亡期：營(yíng)養(yǎng)物的耗盡和有害物質(zhì)的作用，細(xì)營(yíng)養(yǎng)物的耗盡和有害物質(zhì)的作用，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期，活細(xì)胞減少，死細(xì)胞增多。胞進(jìn)入衰亡期，活細(xì)胞減少，死細(xì)胞增多。3.細(xì)胞的生長(zhǎng)條件細(xì)胞的生長(zhǎng)條件恒定的溫度：恒定的溫度：37，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱恒定的濕度恒定的濕度:培養(yǎng)箱中有水盤培養(yǎng)箱中有水盤等滲環(huán)境：培養(yǎng)液提供等滲環(huán)境：培養(yǎng)液提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：培養(yǎng)液提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：培養(yǎng)液提供無污染：包括微生物的污染和雜質(zhì)的污染無污染：包括微生物的污染和雜質(zhì)的污染 要求使用純水，并對(duì)所有和細(xì)胞接觸的物品都要清洗要求使用純水，并對(duì)所有和細(xì)胞接觸的物

8、品都要清洗干凈并滅菌，培養(yǎng)液中還要加入青鏈霉素，操作在無干凈并滅菌，培養(yǎng)液中還要加入青鏈霉素，操作在無菌環(huán)境下進(jìn)行菌環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)用器皿：培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶等培養(yǎng)用器皿：培養(yǎng)皿，培養(yǎng)瓶等氣體：培養(yǎng)器皿并非完全密閉的，細(xì)菌不能通過，氣氣體：培養(yǎng)器皿并非完全密閉的，細(xì)菌不能通過，氣體可以體可以盡量恒定的盡量恒定的pH值：值：NaHCO3與與CO2形成緩沖對(duì)。形成緩沖對(duì)。5% CO2 。各種操作液：如胰酶，各種操作液：如胰酶，EDTA，PBS等。等。此外還要對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察和監(jiān)測(cè)（倒置顯微鏡）。此外還要對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行觀察和監(jiān)測(cè)（倒置顯微鏡）。五、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作五、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作1.實(shí)驗(yàn)器具及設(shè)備：實(shí)驗(yàn)器具

9、及設(shè)備：v超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾超凈工作臺(tái)，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸器，酸缸vCO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱v倒置顯微鏡倒置顯微鏡v液氮罐液氮罐v自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀自動(dòng)雙重純水蒸餾器，純水儀v耗材：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞凍存管耗材：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞凍存管超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)的工作原理超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣遁過高效濾器除去空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒和細(xì)菌，中的塵埃顆粒和細(xì)菌，使空氣得到凈化。凈化使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺(tái)面，空氣徐徐通過工作臺(tái)面，使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)使工作臺(tái)內(nèi)構(gòu)成

10、無菌環(huán)境。境。 壓力蒸汽消毒器壓力蒸汽消毒器高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋濕熱消毒，用途廣。濕熱消毒，用途廣。電熱干燥箱電熱干燥箱干熱消毒干熱消毒180 ，作用作用2小時(shí)至小時(shí)至4小小時(shí)。主要用于玻時(shí)。主要用于玻璃器皿的消毒璃器皿的消毒 。濾器及濾膜濾器及濾膜過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、過濾除菌：大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過法除菌血清、酶液等均采用濾過法除菌 。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37，5CO2。使用。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問題：注意的問題：用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，需將瓶用螺旋口瓶培養(yǎng)

11、細(xì)胞時(shí)，需將瓶蓋微松，以保證通氣。蓋微松，以保證通氣。保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒。毒。箱內(nèi)蒸餾水槽中應(yīng)放置滅菌蒸餾箱內(nèi)蒸餾水槽中應(yīng)放置滅菌蒸餾水水3000毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免毫升以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。培養(yǎng)液蒸發(fā)。倒置顯微鏡倒置顯微鏡液氮罐液氮罐自動(dòng)雙重純水蒸餾器自動(dòng)雙重純水蒸餾器 純水儀純水儀細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶離心管離心管凍存管凍存管2.常用器皿清洗常用器皿清洗v玻璃器皿用自來水浸泡、洗滌劑刷洗、烘干、玻璃器皿用自來水浸泡、洗滌劑刷洗、烘干、浸酸（浸酸（24小時(shí)）。小時(shí)）。v流動(dòng)的自來水洗流動(dòng)的自來水洗10遍，蒸溜水沖洗遍，蒸

12、溜水沖洗3次，三次，三蒸水或純凈水洗蒸水或純凈水洗1次，次，180干熱滅菌干熱滅菌4h-6h。v塑料及橡膠制品等，超聲波清洗塑料及橡膠制品等，超聲波清洗3次，次，121高壓濕熱滅菌高壓濕熱滅菌15min,烘干備用。烘干備用。3.細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮的三蒸水或去離子水水：新鮮的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml消化液消化液v胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，胰蛋白酶作用于與賴氨酸或

13、精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞分離。而使細(xì)胞分離。 v胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。度會(huì)損傷細(xì)胞。v胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25。用濾器過濾除菌。用濾器過濾除菌。v胰蛋白酶液消化時(shí)間：胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。分鐘。v用含血清培養(yǎng)液可以終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。用含血清培養(yǎng)液可以終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。培養(yǎng)基培

14、養(yǎng)基A. 天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基v天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。和牛胚浸液）。v優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好v缺點(diǎn)：來源受限。缺點(diǎn)：來源受限。v成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。的分析。v易發(fā)生支原體污染。易發(fā)生支原體污染。 培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。B. 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基v合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的

15、種類和數(shù)量，合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基，如基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DF12等。等。v合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。物、無機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。v優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。優(yōu)點(diǎn)：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。成本低。 v缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)缺點(diǎn)：缺少某些成分，不能完全滿足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。需要。 v在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)

16、常加適量抗菌素，以抑在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。制可能存在的細(xì)菌的生長(zhǎng)。v青霉素抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁合成。青霉素抑制細(xì)菌的細(xì)胞壁合成。v鏈霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。v通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。抗菌素的使用抗菌素的使用六、細(xì)胞的培養(yǎng)方法六、細(xì)胞的培養(yǎng)方法v主要包括兩種主要包括兩種 1.原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次將機(jī)體取出的組織或細(xì)胞進(jìn)行初次培養(yǎng)的過程。培養(yǎng)的過程。 2.傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。從原代培養(yǎng)的細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代方法1.棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。棄掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。2.加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn)），靜置瓶底為準(zhǔn)），靜置2-10min（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。（顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。4.用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)用吸管吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞