核酸的生物合成

1、第九章 核酸的生物合成 一、知識(shí)要點(diǎn) 在細(xì)胞分裂過程中通過DNA的復(fù)制把遺傳信息由親代傳遞給子代，在子代的個(gè)體發(fā)育過程中遺傳信息由DNA傳遞到RNA，最后翻譯成特異的蛋白質(zhì)；在RNA病毒中RNA具有自我復(fù)制的能力，并同時(shí)作為mRNA，指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的生物合成；在致癌RNA病毒中，RNA還以逆轉(zhuǎn)錄的方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。這種遺傳信息的流向稱為中心法則。復(fù)制是指以原來DNA分子為模板，合成出相同DNA分子的過程；轉(zhuǎn)錄是在DNA（或RNA）分子上合成出與其核苷酸順序相對應(yīng)的RNA（或DNA）的過程；翻譯是在以rRNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白體上，以mRNA為模板，根據(jù)每

2、三個(gè)相鄰核苷酸決定一種氨基酸的三聯(lián)體密碼規(guī)則，由tRNA運(yùn)送氨基酸，合成出具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)肽鏈的過程。（一） DNA的生物合成在DNA復(fù)制時(shí)，親代DNA的雙螺旋先行解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，在這兩條鏈上各形成一條互補(bǔ)鏈，這樣從親代DNA的分子可以精確地復(fù)制成2個(gè)子代DNA分子。每個(gè)子代DNA分子中，有一條鏈?zhǔn)菑挠H代DNA來的，另一條則是新形成的，這叫做半保留復(fù)制。通過14N和15N標(biāo)記大腸桿菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)了半保留復(fù)制。1復(fù)制的起始點(diǎn)與方向DNA分子復(fù)制時(shí)，在親代分子一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)雙鏈打開，隨之以兩股鏈為模板復(fù)制生成兩個(gè)子代DNA雙鏈分子。開始時(shí)復(fù)制起始點(diǎn)呈現(xiàn)一叉形

3、（或Y形），稱之為復(fù)制叉。DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此特定部位稱為復(fù)制起始點(diǎn)（origin of replication），可以用ori表示。在原核生物中復(fù)制起始點(diǎn)常位于染色體的一個(gè)特定部位，即只有一個(gè)起始點(diǎn)。真核生物的染色體是在幾個(gè)特定部位上進(jìn)行DNA復(fù)制的，有幾個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)的。酵母基因組與真核生物基因組相同，具有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。復(fù)制的方向可以有三種不同的機(jī)制。其一是從兩個(gè)起始點(diǎn)開始，各以相反的單一方向生長出一條新鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉。其二是從一個(gè)起始點(diǎn)開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉。其三是從一個(gè)起始點(diǎn)開始，沿兩個(gè)相反的方向各生長出兩條鏈，形成兩個(gè)復(fù)制叉。2DNA聚

4、合反應(yīng)有關(guān)的酶及相關(guān)蛋白因子DNA的合成是以四種三磷酸脫氧核糖核苷為底物的聚合反應(yīng)，該過程除了需要酶的催化之外，還需要適量的DNA為模板，RNA（或DNA）為引物和鎂離子的參與。催化這個(gè)反應(yīng)的酶也有多種：DNA聚合酶、RNA引物合成酶（即引發(fā)酶）、DNA連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、解螺旋酶及多種蛋白質(zhì)因子參與。3DNA的復(fù)制過程DNA的復(fù)制按一定的規(guī)律進(jìn)行，雙螺旋的DNA是邊解開邊合成新鏈的。復(fù)制從特定位點(diǎn)開始，可以單向或雙向進(jìn)行，但是以雙向復(fù)制為主。由于DNA雙鏈的合成延伸均為53的方向，因此復(fù)制是以半不連續(xù)的方式進(jìn)行，即其中一條鏈相對地連續(xù)合成，稱之為領(lǐng)頭鏈，另一條鏈的合成是不連續(xù)的，稱為隨后鏈。

5、在DNA復(fù)制叉上進(jìn)行的基本活動(dòng)包括雙鏈的解開；RNA引物的合成；DNA鏈的延長；切除RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的DNA片段。（二）逆向轉(zhuǎn)錄在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反，故稱為逆向轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄酶需要以RNA（或DNA）為模板，以四種dNTP為原料，要求短鏈RNA（或DNA）作為引物，此外還需要適當(dāng)濃度的二價(jià)陽離子Mg2+和Mn2+，沿53方向合成DNA，形成RNA-DNA雜交分子（或DNA雙鏈分子）。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，它除了具有以RNA為模板的DNA聚合酶和以DNA為模板的DNA聚合酶活性外

6、還兼有RNaseH、DNA內(nèi)切酶、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA解鏈酶和tRNA結(jié)合的活性。幾乎所有真核生物的mRNA分子的3末端都有一段多聚腺苷酸。當(dāng)加入寡聚dT作引物時(shí)，mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶的模板，在體外合成與其互補(bǔ)的DNA，稱為cDNA。（三）DNA突變DNA突變 是指DNA的堿基順序發(fā)生突然而永久性地變化，從而影響DNA的復(fù)制，并使DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯也跟著改變，表現(xiàn)出異常的遺傳特征。DNA的突變可以有幾種形式：（1）一個(gè)或幾個(gè)堿基對被置換；（2）插入一個(gè)或幾個(gè)堿基對；（3）一個(gè)或多個(gè)堿基對缺失。置換和插入的變化是可逆的，缺失則是不可逆的。最常見的突變形式是堿基對的置換。嘌呤堿之間或嘧啶

7、堿之間的置換稱為轉(zhuǎn)換，嘌呤和嘧啶之間的置換稱為顛換。突變有自發(fā)突變和誘發(fā)突變。在DNA的合成中，自發(fā)突變的機(jī)率很低，大約每109個(gè)堿基對發(fā)生一次突變；各種RNA腫瘤病毒具有很高的自發(fā)突變頻率。誘發(fā)突變可以由物理因素或化學(xué)因素引起，物理因素如電離輻射和紫外光等均可以誘發(fā)突變?；瘜W(xué)因素的誘變，如脫氨劑和烷化試劑均可誘發(fā)突變。亞硝酸為強(qiáng)脫氨劑，可使腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤，鳥嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)辄S嘌呤，胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而?dǎo)致堿基配對錯(cuò)誤。烷化劑如硫酸二甲酯（DMS）可使鳥嘌呤的N7位氮原子甲基化，使之成為帶一個(gè)正電荷的季銨基團(tuán)，減弱N9位上的N-糖苷鍵，至使脫氧核糖苷鍵不穩(wěn)定，發(fā)生水解而丟失嘌呤堿，以后可被其

8、它堿基取代，或引起DNA的鏈斷裂。（四）DNA損傷與修復(fù)某些物理化學(xué)因子，如紫外線、電離輻射和化學(xué)誘變劑等，都能引起生物突變和致死。因?yàn)樗鼈兙茏饔糜贒NA，造成其結(jié)構(gòu)和功能的破壞。但細(xì)胞內(nèi)具有一系列起修復(fù)作用的酶系統(tǒng)，可以除去DNA上的損傷，恢復(fù)DNA的正常雙螺旋結(jié)構(gòu)。目前已經(jīng)知道有四種修復(fù)系統(tǒng)：光復(fù)活，切除修復(fù)，重組修復(fù)和誘導(dǎo)修復(fù)。后三種機(jī)制不需要光照，因此又稱為暗修復(fù)。1光復(fù)活光復(fù)活的機(jī)制是可見光（最有效波長為400nm左右）激活了光復(fù)活酶，它能分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。光復(fù)活作用是一種高度專一的修復(fù)方式。2切除修復(fù)又稱為復(fù)制前修復(fù)。所謂切除修復(fù)，即是在一系列酶的作用下，將D

9、NA分子中受損傷部分切除掉，并以完整的那一條鏈為模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)的過程。這是比較普遍的一種修復(fù)機(jī)制，它對多種損傷均能起修復(fù)作用。參與切除修復(fù)的酶主要有：特異的核酸內(nèi)切酶、外切酶、聚合酶和連接酶。3重組修復(fù)遺傳信息有缺損的子代DNA分子可通過遺傳重組而加以彌補(bǔ)，即從完整的母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，然后用再合成的序列來補(bǔ)上母鏈的空缺。此過程稱為重組修復(fù)，因?yàn)榘l(fā)生在復(fù)制之后，又稱為復(fù)制后修復(fù)。參與重組修復(fù)的酶系統(tǒng)包括與重組有關(guān)的主要酶類以及修復(fù)合成的酶類。重組基因rec A編碼的蛋白質(zhì)，具有交換DNA鏈的活力。rec A蛋白被認(rèn)為在DNA重組和重組修復(fù)

10、中均起著關(guān)鍵的作用。rec B和rec C基因分別編碼核酸外切酶V的兩個(gè)亞基，該酶亦為重組和重組修復(fù)所必需。修復(fù)合成時(shí)需要DNA聚合酶和連接酶。4誘導(dǎo)修復(fù)許多能造成DNA損傷或抑制復(fù)制的處理均能引起一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS response）。SOS反應(yīng)包括誘導(dǎo)出現(xiàn)的DNA損傷修復(fù)效應(yīng)、誘變效應(yīng)、細(xì)胞分裂的抑制以及溶原性細(xì)菌釋放噬菌體等等。（五）RNA的生物合成以DNA的一條鏈為模板在RNA聚合酶催化下，以四種核糖核苷磷酸為底物按照堿基配對原則，形成35磷酸二酯鍵，合成一條與DNA鏈的一定區(qū)段互補(bǔ)的RNA鏈的過程稱為轉(zhuǎn)錄。RNA的轉(zhuǎn)錄起始于DNA模板的一個(gè)特定位點(diǎn)，并在另一位

11、點(diǎn)處終止。在生物體內(nèi)，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，這稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。用作模板的鏈稱為反義鏈，另一條鏈稱為有義鏈，因?yàn)橛辛x鏈的脫氧核苷酸序列正好與轉(zhuǎn)錄出的RNA的核苷酸序列相同（只是T與U的區(qū)別），所以也稱編碼鏈。但各個(gè)基因的有義鏈不一定位于同一條DNA鏈。RNA的合成沿53方向進(jìn)行（DNA模板鏈方向?yàn)?5），5未端為核糖核苷三磷酸，即5位保留PPP。在真核生物細(xì)胞里，轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行的。合成的RNA包括mRNA、rRNA和tRNA的前體。rRNA的合成發(fā)生在核仁內(nèi)，而合成mRNA和tRNA的酶則定位在核質(zhì)中。另外葉綠體和線粒體也進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。原核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄酶類存在于細(xì)胞液中

12、。1RNA聚合酶原核細(xì)胞大腸桿菌的RNA聚合酶研究的較深入。這個(gè)酶的全酶由5種亞基（2）組成，還含有2個(gè)Zn原子。在RNA合成起始之后，因子便與全酶分離。不含因子的酶仍有催化活性，稱為核心酶。亞基具有與啟動(dòng)子結(jié)合的功能，亞基催化效率很低，而且可以利用別的DNA的任何部位作模板合成RNA。加入因子后，則具有了選擇起始部位的作用，因子可能與核心酶結(jié)合，改變其構(gòu)象，從而使它能特異地識(shí)別DNA模板鏈上的起始信號(hào)。真核細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有RNA聚合酶I、II和III，通常由46種亞基組成，并含有Zn2+。RNA聚合酶I存在于核仁中，主要催化rRNA前體的轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶和存在于核質(zhì)中，分別催化mRNA前體

13、和小分子量RNA的轉(zhuǎn)錄。此外線粒體和葉綠體也含有RNA聚合酶，其特性類似原核細(xì)胞的RNA聚合酶。2RNA的轉(zhuǎn)錄過程RNA轉(zhuǎn)錄過程為起始位點(diǎn)的識(shí)別、起始、延伸、終止。起始位點(diǎn)的識(shí)別：RNA聚合酶先與DNA模板上的特殊啟動(dòng)子部位結(jié)合，因子起著識(shí)別DNA分子上的起始信號(hào)的作用。在亞基作用下幫助全酶迅速找到啟動(dòng)子，并與之結(jié)合生成較松弛的封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物。這時(shí)酶與DNA外部結(jié)合，識(shí)別部位大約在啟動(dòng)子的-35位點(diǎn)處。接著是DNA構(gòu)象改變活化，得到開放型的啟動(dòng)子復(fù)合物，此時(shí)酶與啟動(dòng)子緊密結(jié)合，在-10位點(diǎn)處解開DNA雙鏈，識(shí)別其中的模板鏈。由于該部位富含A-T堿基對，故有利于DNA解鏈。開放型復(fù)合物一旦形

14、成，DNA就繼續(xù)解鏈，酶移動(dòng)到起始位點(diǎn)。3起始：在起始位點(diǎn)的全酶結(jié)合第一個(gè)核苷三磷酸。第一個(gè)核苷三磷酸常是GTP或ATP。形成的啟動(dòng)子、全酶和核苷三磷酸復(fù)合物稱為三元起始復(fù)合物，第一個(gè)核苷酸摻入的位置稱為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。這時(shí)亞基被釋放脫離核心酶。4延伸：從起始到延伸的轉(zhuǎn)變過程，包括因子由締合向解離的轉(zhuǎn)變。DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的變化，核心酶與DNA的結(jié)合松弛，核心酶可沿模板移動(dòng)，并按模板序列選擇下一個(gè)核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉(zhuǎn)錄延伸方向是沿DNA模板鏈的35方向按堿基酸對原則生成53的RNA產(chǎn)物。RNA鏈延伸時(shí)，RNA聚合酶繼續(xù)解開一段DNA雙鏈

15、，長度約17個(gè)堿基對，使模板鏈暴露出來。新合成的RNA鏈與模板形成RNA-DNA的雜交區(qū)，當(dāng)新生的RNA鏈離開模板DNA后，兩條DNA鏈則重新形成雙股螺旋結(jié)構(gòu)。4終止 在DNA分子上有終止轉(zhuǎn)錄的特殊堿基順序稱為終止子（terminators），它具有使RNA聚合酶停止合成RNA和釋放RNA鏈的作用。這些終止信號(hào)有的能被RNA聚合酶自身識(shí)別，而有的則需要有因子的幫助。因子是一個(gè)四聚體蛋白質(zhì)，它能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶的組分。它的作用是阻RNA聚合酶向前移動(dòng)，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成的RNA鏈。對于不依賴于因子的終止子序列的分析，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)明顯的特征：即在DNA上有一個(gè)1520個(gè)核苷酸

16、的二重對稱區(qū)，位于RNA鏈結(jié)束之前，形成富含G-C的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。接著有一串大約6個(gè)A的堿基序列它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串的U。寡聚U可能提供信號(hào)使RNA聚合酶脫離模板。在真核細(xì)胞內(nèi)，RNA的合成要比原核細(xì)胞中的復(fù)雜得多。（六）轉(zhuǎn)錄后加工在轉(zhuǎn)錄中新合成的RNA往往是較大的前體分子，需要經(jīng)過進(jìn)一步的加工修飾，才轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩飳W(xué)活性的、成熟的RNA分子，這一過程稱為轉(zhuǎn)錄后加工。主要包括剪接、剪切和化學(xué)修飾。1mRNA的加工 在原核生物中轉(zhuǎn)錄翻譯相隨進(jìn)行，多基因的mRNA生成后，絕大部分直接作為模板去翻譯各個(gè)基因所編碼的蛋白質(zhì)，不再需要加工。但真核生物里轉(zhuǎn)錄和翻譯的時(shí)間和空間都不相同，mRNA的合

17、成是在細(xì)胞核內(nèi)，而蛋白質(zhì)的翻譯是在胞質(zhì)中進(jìn)行，而且許多真核生物的基因是不連續(xù)的。不連續(xù)基因中的插入序列，稱為內(nèi)含子；被內(nèi)含子隔開的基因序列稱為外顯子。一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子都轉(zhuǎn)錄在一條很大的原初轉(zhuǎn)錄本RNA分子中,故稱為核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）。它們首先降解為分子較小的RNA，再經(jīng)其它修飾轉(zhuǎn)化為mRNA。真核細(xì)胞mRNA的加工包括：（1）hnRNA被剪接，除去由內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄來的序列，將外顯子的轉(zhuǎn)錄序列連接起來。（2）在3末端連接上一段約有20200個(gè)腺苷酸的多聚腺苷酸（poly A）的“尾巴”結(jié)構(gòu)。不同mRNA的長度有很大差異。（3）在5末端連接上一個(gè)“帽子”結(jié)構(gòu)m7GpppmNP。（4

18、）在內(nèi)部少數(shù)腺苷酸的腺嘌呤6位氨基發(fā)生甲基化（m6A）.2tRNA的加工 原核生物的tRNA基因的轉(zhuǎn)錄單元大多數(shù)是多基因的。不但相同或不同的tRNA的幾個(gè)基因可轉(zhuǎn)錄在一條RNA中，有的tRNA還與rRNA組成轉(zhuǎn)錄單元，因此tRNA前體的加工過程包括剪切、剪接，在3-末端添加CCAOH、以及核苷酸修飾轉(zhuǎn)化為成熟的tRNA。tRNA中含有許多稀有堿基，所有這些堿基均是在轉(zhuǎn)錄后由四種常見堿基經(jīng)修飾酶催化，發(fā)生脫氨、甲基化、羥基化等化學(xué)修飾而生成的。3rRNA的加工 原核細(xì)胞首先生成的是30S前體rRNA，經(jīng)核糖核酸酶作用，逐步裂解為16S、23S和5S的rRNA，其裂解過程可歸納如下： 17.5S

19、16S rRNA 30S25S 23S rRNA小碎片5S rRNA原核生物16S rRNA和23S rRNA含有較多的甲基化修飾成分，特別是2-甲基核糖。一般5S rRNA中無修飾成分。在真核細(xì)胞中rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工與原核細(xì)胞類似，但更為復(fù)雜。rRNA在核仁中合成，生成一個(gè)更大3545S前體rRNA。前體分裂而轉(zhuǎn)變?yōu)?8S、18S和5.8S的rRNA分子。真核生物5S rRNA前體是由獨(dú)立于上述三種rRNA之外的基因轉(zhuǎn)錄的。真核生物rRNA中與含有較多的甲基化成分。有關(guān)RNA剪接、剪切機(jī)制的研究不僅發(fā)現(xiàn)了RNA分子本身具有催化功能，這種具有剪接功能的RNA催化劑命名為核酶。目前已發(fā)現(xiàn)的具有

20、催化功能的RNA有磷酸二酯酶（核糖核酸酶）、磷酸單酯酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶、RNA限制性內(nèi)切酶、 tRNA 5端成熟酶、-1,4-葡聚糖分支酶和肽基轉(zhuǎn)移酶等。目前研究表明核酶催化rRNA、tRNA、mRNA的剪接機(jī)理是不相同的。RNA內(nèi)含子有四種類型，即型自我拼接內(nèi)含子、型自我拼接內(nèi)含子、核mRNA內(nèi)含子和核tRNA內(nèi)含子。（七）RNA的復(fù)制大多數(shù)生物的遺傳信息貯藏的DNA中，遺傳信息按中心法則由DNA 轉(zhuǎn)錄成RNA， 再由RNA翻譯成蛋白質(zhì)的。對RNA病毒的研究表明，某些RNA病毒是以RNA作模板復(fù)制出病毒RNA分子。Q噬菌體RNA的復(fù)制可分為兩個(gè)階段：（1）當(dāng)Q噬菌體侵染大腸桿菌細(xì)胞

21、后，其單鏈RNA充當(dāng)mRNA，利用宿主細(xì)胞中的核糖體合成噬菌體外殼蛋白質(zhì)和復(fù)制酶亞基；（2）當(dāng)復(fù)制酶的亞基和宿主細(xì)胞原有的、亞基自動(dòng)裝配成RNA復(fù)制酶以后，就進(jìn)行RNA復(fù)制。以侵染的噬菌體RNA作模板，通過RNA復(fù)制酶合成互補(bǔ)的RNA鏈。常把具有mRNA功能的鏈稱為正鏈，與它互補(bǔ)的鏈稱為負(fù)鏈。在噬菌體特異的復(fù)制酶裝配好后不久酶就吸附到正鏈RNA的3末端，以它為模板合成出負(fù)鏈，至合成結(jié)束，然后負(fù)鏈從正鏈模板上釋放出來。同一個(gè)酶又吸附到負(fù)鏈RNA的3末端，合成出病毒正鏈RNA，正鏈RNA與外殼蛋白裝配成噬菌體顆粒，所以正鏈和負(fù)鏈的合成方向都是由53。（八）基因工程的操作技術(shù)1目的基因體外操作DNA

22、的主要步驟之一是提取載體DNA和所需要的外源目的基因。在細(xì)胞中DNA并非以游離態(tài)分子存在，而是和RNA及蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成復(fù)合體。DNA純化的基本步驟是：（1）從破壞的細(xì)胞壁和膜里釋放出可溶性的DNA；（2）通過變性或蛋白質(zhì)分解，使DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體解離；（3）將DNA從其它大分子中分離出來；（4）DNA濃度和純度的光學(xué)測定。2載體外源DNA片段（目的基因）要進(jìn)入受體細(xì)胞，必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)倪\(yùn)載工具將帶入細(xì)胞內(nèi)，并載著外源DNA一起進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，這種運(yùn)載工具稱為載體。載體必須具備下列條件：（1）在受體細(xì)胞中，載體可以獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制。所以載體本身必須是一個(gè)復(fù)制單位，稱復(fù)制子（replico

23、n），具有復(fù)制起點(diǎn)。而且插入外源DNA后不會(huì)影響載體本身復(fù)制的能力。（2）易于鑒定、篩選。也就是說，容易將帶有外源DNA的重組體與不帶外源DNA的載體區(qū)別開來。（3）易于引入受體細(xì)胞。常用的載體主要有以下幾類：細(xì)菌和酵母的質(zhì)粒，噬菌體和M13以及病毒。3連接 外源DNA與載體DNA之間可以通過多種方式相連接，主要有以下幾種(1) 粘性末端連接；(2) 平頭末端連接；(3) 接頭連接等。4轉(zhuǎn)化 任何外源DNA重組到載體上，然后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞中復(fù)制繁殖，這一過程稱為DNA的克隆。外源DNA進(jìn)入受體細(xì)胞并使它獲得新遺傳特性的過程稱為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化作用是將外源DNA引入細(xì)胞的過程。5篩選 由于細(xì)胞轉(zhuǎn)化的頻率

24、較低，所以從大量的宿主細(xì)胞中篩選出帶有重組體的細(xì)胞并不是很容易的，當(dāng)前，在實(shí)驗(yàn)室中，常用的篩選手段有以下幾種：(1) 插入失活；(2) 菌落原位雜交；(3) 免疫學(xué)方法此外，對重組體轉(zhuǎn)化的鑒定還可以采用表現(xiàn)型的鑒定；對重組質(zhì)粒純化并重新轉(zhuǎn)化；限制性酶切圖譜的繪制；重組質(zhì)粒上的基因定位等更深入的方法。 二、習(xí) 題 （一）名詞解釋1半保留復(fù)制（semiconservative replication）2不對稱轉(zhuǎn)錄（asymmetric trancription）3逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）4岡崎片段（Okazaki fragment）5復(fù)制叉（repl

25、ication fork）6領(lǐng)頭鏈（leading strand）7隨后鏈（lagging strand）8有意義鏈（sense strand）9光復(fù)活（photoreactivation）10重組修復(fù)（recombination repair）11內(nèi)含子（intron）12外顯子（exon）13基因載體（genonic vector） 14質(zhì)粒（plasmid） （二）填空題1DNA復(fù)制是定點(diǎn)雙向進(jìn)行的， 股的合成是 ，并且合成方向和復(fù)制叉移動(dòng)方向相同； 股的合成是 的，合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)的方向相反。每個(gè)岡崎片段是借助于連在它的 末端上的一小段 而合成的；所有岡崎片段鏈的增長都是

26、按 方向進(jìn)行。2DNA連接酶催化的連接反應(yīng)需要能量，大腸桿菌由 供能，動(dòng)物細(xì)胞由 供能。3大腸桿菌RNA聚合酶全酶由 組成；核心酶的組成是 。參與識(shí)別起始信號(hào)的是 因子。4基因有兩條鏈，作為模板指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的那條鏈稱 鏈。5以RNA為模板合成DNA稱 ，由 酶催化。6DNA或UpGpCpA分別經(jīng)0.3NKOHR、NaseT1和牛胰RNaseI處理所得結(jié)果：DNA: 0.3NKOH： ；RNaseT1： ；RNase I： ;UpGpCpA：0.3NKOH： ；RNaseT1： ；RNase I ： 。7基因突變形式分為： ， ， 和 四類。8亞硝酸是一個(gè)非常有效的誘變劑，因?yàn)樗芍苯幼饔糜贒NA，

27、使堿基中 基氧化成 基，造成堿基對的 。9所有岡崎片段的延伸都是按 方向進(jìn)行的。10前導(dǎo)鏈的合成是 的，其合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向 ；隨后鏈的合成是 的，其合成方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向 。11引物酶與轉(zhuǎn)錄中的RNA聚合酶之間的差別在于它對 不敏感，并可以 作為底物。12DNA聚合酶I的催化功能有 、 、 、 和 。13DNA回旋酶又叫 ，它的功能是 。14細(xì)菌的環(huán)狀DNA通常在一個(gè) 開始復(fù)制，而真核生物染色體中的線形DNA可以在 起始復(fù)制。15大腸桿菌DNA聚合酶的 活性使之具有 功能，極大地提高了DNA復(fù)制的保真度。16大腸桿菌中已發(fā)現(xiàn) 種DNA聚合酶，其中 負(fù)責(zé)DNA復(fù)制， 負(fù)責(zé)DNA損傷修復(fù)

28、。17DNA切除修復(fù)需要的酶有 、 、 和 。18在DNA復(fù)制中， 可防止單鏈模板重新締合和核酸酶的攻擊。19DNA合成時(shí)，先由引物酶合成 ，再由 在其3 端合成DNA鏈，然后由 切除引物并填補(bǔ)空隙，最后由 連接成完整的鏈。20原核細(xì)胞中各種RNA是 催化生成的，而真核細(xì)胞核基因的轉(zhuǎn)錄分別由 種RNA聚合酶催化，其中rRNA基因由 轉(zhuǎn)錄，hnRNA基因由 轉(zhuǎn)錄，各類小分子量RAN則是 的產(chǎn)物。21一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位一般應(yīng)包括 序列、 序列和 順序。22真核細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)的基因多為 。編碼的序列還保留在成熟mRNA中的是 ，編碼的序列在前體分子轉(zhuǎn)錄后加工中被切除的是 。在基因中 被 分隔，而在成熟的

29、mRNA序列被拼接起來。23染色質(zhì)中的 蛋白和 蛋白對轉(zhuǎn)錄均有調(diào)節(jié)作用，其中 的調(diào)節(jié)作用具有組織特異性。 （三）選擇題1DNA按半保留方式復(fù)制。如果一個(gè)完全放射標(biāo)記的雙鏈DNA分子，放在不含有放射標(biāo)記物的溶液中，進(jìn)行兩輪復(fù)制，所產(chǎn)生的四個(gè)DNA分子的放射活性將會(huì)怎樣：A半數(shù)分子沒有放射性 B所有分子均有放射性C半數(shù)分子的兩條鏈均有放射性 D一個(gè)分子的兩條鏈均有放射性E四個(gè)分子均無放射性2參加DNA復(fù)制的酶類包括：（1）DNA聚合酶；（2）解鏈酶；（3）DNA聚合酶；（4）RNA聚合酶（引物酶）；（5）DNA連接酶。其作用順序是：A（4）、（3）、（1）、（2）、（5） B（2）、（3

30、）、（4）、（1）、（5）C（4）、（2）、（1）、（5）、（3） D（4）、（2）、（1）、（3）、（5）E（2）、（4）、（1）、（3）、（5）3如果15N標(biāo)記的大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N培養(yǎng)基中生長了三代，其各種狀況的DNA分子比例應(yīng)是下列哪一項(xiàng)：純15N 15N14N 純14NDNA 雜種DNA DNAA 1/8 1/8 6/8B 1/8 0 7/8C 0 1/8 7/8D 0 2/8 6/8E 0 4/8 4/84下列關(guān)于DNA復(fù)制特點(diǎn)的敘述哪一項(xiàng)錯(cuò)誤的：ARNA與DNA鏈共價(jià)相連 B新生DNA鏈沿53方向合成CDNA鏈的合成是不連續(xù)的 D復(fù)制總是定點(diǎn)雙向進(jìn)行的EDNA在一條母鏈上沿53方向

31、合成，而在另一條母鏈上則沿35方向合成 5DNA復(fù)制時(shí)， 5TpApGpAp3序列產(chǎn)生的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)是下列哪一種：A5TpCpTpAp3 B5ApTpCpTp3C5UpCpUpAp3 D5GpCpGpAp3 E3 TpCpTpAp56下列關(guān)于DNA聚合酶I的敘述哪一項(xiàng)是正確的：A它起DNA修復(fù)酶的作用但不參加DNA復(fù)制過程B它催化dNTP聚合時(shí)需要模板和引物C在DNA復(fù)制時(shí)把岡崎片段連接成完整的隨從鏈D它催化產(chǎn)生的岡崎片段與RNA引物鏈相連E有些細(xì)菌突變體其正常生長不需要它7下列關(guān)于真核細(xì)胞DNA聚合酶活性的敘述哪一項(xiàng)是正確的：A它僅有一種 B它不具有核酸酶活性C它的底物是二磷酸脫氧核苷 D它不需要引物E它按3-5方向合成新生鏈8從正在進(jìn)行DNA復(fù)制的細(xì)胞分離出的短鏈核酸岡崎片段，具有下列哪項(xiàng)特性：A它們是雙鏈的 B它們是一組短的單鏈DNA片段C它們是DNARNA雜化雙鏈 D它們被核酸酶活性切除E它們產(chǎn)生于親代DNA鏈的糖-磷酸骨架的缺口處9切除修復(fù)可以糾正下列哪一項(xiàng)引起的DNA損傷：A堿基缺失 B堿基插入 C堿基甲基化D胸腺嘧啶二聚體形成 E堿基烷基化10大腸桿菌DNA連接酶需要下列哪一種輔助因子？AFAD作為電子受體 BNADP+作為磷酸供體CNAD+形成活性腺苷酰酶 DNAD+作為電子受體E以上都不是11下列關(guān)于RNA和DNA聚合酶的敘述哪一項(xiàng)是正確