1熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理如果兩個(gè)熒光團(tuán)相距在1~10nm之間,且一個(gè)

1、1.熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理如果兩個(gè)熒光團(tuán)相距在 PIO nm 之間，且一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光 團(tuán)的吸收光譜有重疊，當(dāng)供體被入射光激發(fā)時(shí)，可通過(guò)偶極-偶極耦合作用將其能量 以非輻射方式傳遞給受體分子,供體分子衰變到基態(tài)而不發(fā)射熒光，受體分子由基態(tài) 躍遷到激發(fā)態(tài)，再衰變到基態(tài)同時(shí)發(fā)射熒光。這一過(guò)程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescenceresonance energy transfer, FRET)。優(yōu)點(diǎn)1. 適用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的各類分子，2. 靈敬度和分辨率高，并能清晰成像，3. 準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便4. 最直觀地提供蛋口質(zhì)相互作用的定位和定量信息，缺點(diǎn)首先,FRET 對(duì)空間構(gòu)

2、想改變十分敬感,其測(cè)量范圍在 P10 nm,但如果待測(cè)蛋口 原本就相當(dāng)接近，F(xiàn)RET 信號(hào)已經(jīng)達(dá)到最大值，此時(shí)一些刺激引起的微小的構(gòu)想改變 就可能無(wú)法引起 FRET 信號(hào)的很大改變；其次，存在光漂口作用，F(xiàn)RET 需要起始激發(fā)光激發(fā) D,這時(shí)就很難避免對(duì) A 的 間接激發(fā)，這樣的交義激發(fā)降低了分析的靈墩性；第三,存在其他一些本底熒光的干 擾；另外，起始激發(fā)光可能會(huì)破壞一些光敏的組織和細(xì)胞，產(chǎn)生光毒性。這些缺點(diǎn) 很大程度上限制了 FRET 的進(jìn)一步發(fā)展。2. 蛋口質(zhì)雙雜交技術(shù)原理以與調(diào)控 SUC2 基因有關(guān)的兩個(gè)蛋口質(zhì) Snfl 和 Snf2 為模型，將前者與 Gal4 的 DB結(jié)構(gòu)域融合，另外

3、一個(gè)與 G&14 的 AD 結(jié)構(gòu)域的酸性區(qū)域融合。山 DB 和 AD 形 成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌” (bait)和“獵物”或靶蛋白(prey or target protein)。如果在 Snfl 和 Snf2 之間存在相互作用，那么分別位于這兩個(gè) 融合蛋口上的 DB 和 AD 就能重新形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，從而激活相應(yīng)基因的 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這個(gè)被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報(bào) 道基因(reporter gene)。通過(guò)對(duì)報(bào)道基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)，反過(guò)來(lái)可判別作為誘餌”和“獵物”的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)及局限雙雜交系統(tǒng)

4、的另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞，酵母細(xì)胞作為報(bào)道 株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn)：1易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。2具 有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同 來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋口結(jié)合。 一般編碼一個(gè)蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 的 DA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd, LexA-bd);另一個(gè)基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如 GAL4-ad, VP16)o 激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系 中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報(bào)道基因表達(dá)

5、(如 lacZ),從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交系統(tǒng)在分析蛋口一蛋口間相互作時(shí)的優(yōu)點(diǎn)：(1) 檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)悄況。(2) 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省 去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。(3) 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋口質(zhì)之 間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。(4) 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類型和分化時(shí)期材料構(gòu)建 cDNA文庫(kù)，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋口等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋 白。(5) 分析新基因的生物學(xué)功能，用未知功能的基因去篩選文庫(kù)，然后根據(jù)釣到的 已知基

6、因的功能推測(cè)新基因的功能。缺點(diǎn)(1) 雙雜交系統(tǒng)分析蛋口間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋口間的相互 作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。(2) 酵母雙雜交系統(tǒng)的“假陰性”(3) 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問(wèn)題是“假陽(yáng)性”。3. 噬菌體展示技術(shù)原理噬菌體展示技術(shù)是利用基因工程手段將合成的一組一定長(zhǎng)度的隨機(jī)序列寡核昔酸片段克隆到特定表達(dá)載體中，使其表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋口的 形式呈現(xiàn)在絲狀噬菌體表面。進(jìn)而通過(guò)親和富集法篩選表達(dá)有特異肽或蛋口質(zhì)的噬 菌體。優(yōu)點(diǎn)不受樣品量限制，可人工擴(kuò)增，類似 PCR 對(duì) DNA 的擴(kuò)增融合 U 的蛋口的噬菌體被分泌出胞外，免去了細(xì)胞

7、破碎、提純等物理化學(xué)步驟, 保持了蛋白的天然構(gòu)象可進(jìn)行反復(fù)篩選，對(duì) U 的蛋口進(jìn)行春花和富集缺點(diǎn)山于受大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率的限制，一般肽庫(kù)的容量只有 109,所以高于這一 限制的基因?qū)㈦y以表達(dá)。從建庫(kù)開始，密碼子的選擇與寡核昔酸的合成，即編碼肽的基因就帶有一定 的偏愛性，這就從先天決定了肽庫(kù)復(fù)雜度即多樣性的局限性。作為噬菌體的宿主，大腸桿菌的生物合成系統(tǒng)有本身的表達(dá)限制，如不能進(jìn) 行氨基酸的修飾。4. 蛋口質(zhì)的親和色譜原理色譜乂叫層析。親和層析屬于吸附層析的范疇，根據(jù)不同物質(zhì)在同一吸附劑上 的吸附能力不同進(jìn)行分離，將樣品放入基質(zhì)中，經(jīng)展開，吸附能力差的遷移快,吸附能 力強(qiáng)的遷移慢，達(dá)到分離的 U 的。優(yōu)點(diǎn)利用它從粗提液中經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單的處理便可得到所需的高純度的活性物質(zhì)，不 但能可以用來(lái)分離一些含量極微的物質(zhì)，而且可以分離那些性質(zhì)十分相似的生化物 質(zhì)。缺點(diǎn)載體(如瓊脂糖)價(jià)格昂貴,機(jī)械強(qiáng)度低;配基制備困難，有的配基本身需要分離 純化，步驟繁瑣。5. 親和印跡原理印跡法(bloting)是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,而后利用相