蔗糖酶的分離提純

1、專業(yè)資料word 完美格式蔗糖酶的分離提純【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解蔗糖酶分離提純的方法。2掌握離心技術(shù)、電泳技術(shù)、層析技術(shù)、膜分離技術(shù)和分光光度法?！緦?shí)驗(yàn)原理】蔗糖酶Ec 3.2.1.26習(xí)慣命名B-D-Fructofuranosidase系統(tǒng)命名:B-DFructofuranosideffructonydrolase。蔗糖酶是一種水解酶，能使蔗糖水解為果糖和葡萄糖。它所催化的反應(yīng)是：蔗糖酶的分布相當(dāng)廣，在微生物、植物及動(dòng)物中都有它的存在。在微生物中，酵 母中的含量很豐富。在研究中用的最多的是面包酵母和啤酒酵母。研究表明采用菌體自溶法破碎酵母細(xì)胞，采用乙醇分級(jí)和DEAE-纖維素柱層析兩步分離提純步驟

2、，就可制備純度較高的蔗糖酶制劑， 而且收率也較好。從 酵母中制備蔗糖酶，材料來源十分方便，而且以自己提純的酶制劑進(jìn)行蔗糖酶的 性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)研究也十分方便?！緦?shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑】1.實(shí)驗(yàn)材料和試劑(1)0.2%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；(2)3，5-二硝基水楊酸試劑；(3)新鮮啤酒酵母；甲苯；(5)乙酸鈉； 稀乙酸溶液；95%乙醇；(8)DEAE-纖維素；(9)0.5mol/L NaOH(10)0.5mol/L HCl；(11)0.005mol/L，pH6.0的磷酸 鈉緩沖液；(12)含O.15mol/LNaCl的O.005mol/L，pH6.0的磷酸鈉緩沖液；蔗糖酶- CHzOHOOH H蔗糖H OH葡

3、萄糖果糖專業(yè)資料word 完美格式(13)5%蔗糖；(14)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度試劑；(15)聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑2儀器(1)恒溫水??；(2)燒杯、量筒、移液管、容量瓶、玻棒；(3)冰鹽??；離心機(jī)；(5)721型分光光度計(jì)； 柱層析裝置；(7)天平；(8)pH計(jì);(9)滴管、試管和血糖管；(10)秒表【方法】一、葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1取10支血糖管，按下表加入0.2%葡萄糖溶液、水及3,5一二硝基水楊 酸試劑：N0含糖量(mg)0. 2 %葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(mL)水(mL)3,5-二硝基水楊酸試劑(mL)OD401002320.40.21.8330.80.41.6341.20.61.4351.60

4、.81.2362.01.01.0372.41.20.8382.81.40.6393.21.60.43103.61.80.23上述試劑混勻后，在沸水浴中加熱5min,取出立即冷卻，以蒸餾水稀釋至25mL搖勻，于540nm測(cè)光密度。2.以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以光密度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。二、蔗糖酶的分離提純1.蔗糖酶粗品的制備(1)自溶稱取10克干酵母，放在200mL的燒杯中，加30mL蒸餾水?dāng)嚦珊隣?，再加?.5克乙酸鈉。然后在35E水浴中攪拌30min,此時(shí)會(huì)觀察到菌體自溶的現(xiàn)象。(2)提取及粗酶的制備往上述自溶液中加60mL蒸餾水，將燒杯用表面皿或玻璃紙蓋好，于35C保 溫過夜。第

5、二天，將自溶液于4500r/min離心20min。取出離心管，小心將上 清液倒入燒杯中，棄沉淀。得到的上清液就是無細(xì)胞抽提液，即粗酶液(E1)。量出粗酶液體積，記錄。取2mL作為待測(cè)活力和蛋白濃度的樣品(4C保存)。2.乙醇分級(jí)將粗酶液用稀醋酸調(diào)pH至4.5。(1)32%乙醇飽和度專業(yè)資料word 完美格式按下面的公式算出使粗酶液的乙醇濃度達(dá)32%時(shí)所需乙醇體積。X/(V+X)=0.32式中Xi為所需乙醇體積，V為粗酶液的體積。然后再按Xi/0.95換算出使乙醇 濃度(按體積)達(dá)32%時(shí)所需95%乙醇的體積。把粗酶液和量好體積的95%乙醇在冰鹽浴中預(yù)冷(02C)。小心緩慢滴加 乙醇，同時(shí)不斷攪

6、拌，一定注意不要使乙醇局部過濃，否則會(huì)引起酶變性失活。在滴加乙醇過程中，酶液漸漸變混濁，滴加結(jié)束后，于3000r/min離心5min。 上清轉(zhuǎn)移到另一燒杯中待用，棄去沉淀。(2)47.5%的乙醇飽和度按下式算出使酶液乙醇濃度達(dá)47.5%時(shí)所需乙醇的量X2/(V+X2)=0.475式中X2為所需乙醇體積，V為粗酶體積。再按X2/0.95算出需95%乙醇的體積。 按下式可算出使乙醇濃度達(dá)47.5%時(shí)所需補(bǔ)加的95%乙醇體積。X2/0.95- Xi/0.95=使乙醇濃度達(dá)47.5%時(shí)需補(bǔ)加的95%乙醇體積按前述方法，繼續(xù)補(bǔ)加乙醇，使乙醇濃度達(dá)47.5%于3000r/min離心3min, 棄去上清會(huì)得

7、少量沉淀。將沉淀用10mL pH6.0的0.005mol/L磷酸鈉緩沖液溶 解，并對(duì)該液透析過夜或酌情縮短時(shí)間，中間換一次透析液。離心，則得到進(jìn)一 步純化的酶。量出酶液體積，取出2mL，待測(cè)活力和蛋白濃度。其他酶液準(zhǔn)備上柱。3.DEAEH纖維素柱層析(1)DEAE纖維素處理在使用前，將市售的DEAL纖維素按下述方法處理：用去離子水浸泡過夜， 用浮選法除去過細(xì)部分，留下30min沉積部分，重復(fù)幾次。然后用0.5mol/L NaOH水，0.5mol/LHCl，水，0.5mol/L NaOH水，交替浸泡。其中NaOH浸泡24小時(shí)，HCI浸泡半小時(shí)，每次抽濾后用水洗至中性。最后用0.005mol/L，

8、pH6. 0的磷酸鈉起始緩沖液平衡。再生方法：用過的DEAE一纖維素可再生重復(fù)使用。但要先用0.5mol/LNaOH+0.5mc/LNaCI浸泡后再按常規(guī)處理。DEAE一纖維素離子型。水：R-N(CHa)2+H0=eF(CHH，OH+ - + -HCI:R N(CHB)2HO-+HCl=R-N(CHB)2HCI+H0NaOH:R-Nh(CH3)2H- Cl-+NaOH=N+(CH3)2H OH+N6裝柱本實(shí)驗(yàn)使用的層析柱規(guī)格為1.8cm(內(nèi)徑)x15cm(高)。把柱子垂直固定好，可用一千錘校正，按柱層析原理部分所述方法，把DEAE一纖維素裝柱。床高距柱頂23cm為宜。用起始緩沖液洗柱，平衡過夜

9、。注意 控制流速，專業(yè)資料word 完美格式防止柱流干。上樣乙醇分級(jí)的酶液，經(jīng)對(duì)起始緩沖液透析，離心后，按層析原理部分所述方法 上樣。（注意：流速要盡量慢，使目的酶和DE52充分吸附）樣品上完后，用起始緩沖液（130mL）洗柱。流出液流出速度為4ml/5min左 右。洗脫用含0.15mol/L NaCI的0.005mol/L pH6.0的磷酸鈉緩沖液洗脫。洗脫速 度4ml/5min。收集20管即可結(jié)束。（34ml/管）。每隔一管測(cè)定活力，確定酶活力峰位置，合并，量出體積。測(cè)合并后制劑的 活力和蛋白濃度。三、蔗糖酶的活力及蛋白濃度測(cè)定1蔗糖酶活力規(guī)定在本實(shí)驗(yàn)的條件下，每3min釋放Img還原糖所

10、需的酶量定義為一個(gè)活力單位。2操作樣品的稀釋取0.2mL無細(xì)胞抽提液（Ei）用pH4.6,0.2mol/L NaAc緩沖液稀釋40倍；取0.2mL乙醇分級(jí)酶液（E2）用上述緩沖液稀釋80倍；DEAE-纖維素柱層析酶液（E3）根據(jù)情況稀釋。反應(yīng)取兩支試管分別加入2mL稀釋的酶液。一支做對(duì)照，加0.5mL 1mo/L NaOH搖勻，使酶失活；另一支做測(cè)定管。然后把兩支試管和5%的蔗糖溶液放在35C水浴中預(yù)熱恒溫。分別取2mL5%的蔗糖加入上述兩試管中，并正確計(jì)算時(shí)間，3min于測(cè)定管 中加入0.5mL1mol/L NaOH搖勻，終止反應(yīng)。從反應(yīng)混合物中取出0.5mL溶液放入血糖管中，加入3mL 3

11、,5一二硝基水 楊酸試劑和1.5mL水，搖勻。于沸水浴中煮沸5min后立即用冷水冷卻，加蒸餾 水稀釋到25mL刻度，搖勻，于540nm測(cè)光密度。在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到所測(cè)光密度對(duì)應(yīng)的葡萄糖含量，然后按下面活力計(jì) 算公式計(jì)算酶活力。3酶活力計(jì)算公式蔗糖酶活力單位：葡萄糖毫克數(shù)X9X酶的稀釋倍數(shù)式中9=4.5/0.5，因酶反應(yīng)液的總體積是4.5mL,而用3,5一二硝基水楊酸試 劑顯色時(shí)僅取0.5mL。4蛋白濃度測(cè)定E1稀釋20倍；E?稀釋4倍；Es不稀釋。專業(yè)資料word 完美格式Bradford法測(cè)蛋白濃度（見附注1）四、酶純度鑒定聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定 日、E2和E3的純度【結(jié)果的處理】樣品

12、樣品總體積ml總活力蛋白濃度mg/ml總蛋白量mg比活u/mg提純倍數(shù)無細(xì)胞抽提液(Ei)乙醇分級(jí)Ea)DEA 一纖維素柱層析(Es)專業(yè)資料word 完美格式附實(shí)驗(yàn) 1Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆湛捡R斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在蛋白質(zhì)的分離、純化過程中，往往需要有一種快速、靈敏的方法對(duì)蛋白質(zhì) 進(jìn)行定量測(cè)定。近年來被廣為采用的Bradford法滿足了人們的需要。本方法采用考馬斯亮藍(lán)G250(Coomassilebrilliantblue，G25Q簡稱CBG250)作為染色物質(zhì)。依其存在形式不同可表現(xiàn)為紅色和藍(lán)色，當(dāng)CBB-G250單獨(dú)存在時(shí)為紅

13、色；當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其顏色變?yōu)樗{(lán)色。藍(lán)色的深淺與溶液中的蛋白質(zhì)含量(01000卩g/mL)成正比，故可用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量。該方法快速、重復(fù)性好、干擾因素少，CBB-G250在2分鐘內(nèi)即可完全與蛋 白結(jié)合，并在l小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，該反應(yīng)幾乎不受鈉、鉀等陽離子干擾，更不受 蔗糖等碳水化合物的于擾。但較高濃度的十二烷基硫酸鈉，Triton x一100等對(duì)其有干擾，此影響可通過選擇適當(dāng)?shù)膶?duì)照來消除?！緦?shí)驗(yàn)儀器與試劑】1儀器(1)臺(tái)稱721分光光度計(jì)容量瓶(4)刻度試管和吸量管2試劑(1)考馬斯亮藍(lán)G250溶液：稱取CBB一G250 lOOmg溶于50mL 95%的乙醇溶 液中，然后加入100mL 8

14、5%的磷酸，最后加蒸餾水定容至1000mL(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100卩g/mL):精確稱取100mg牛血清白蛋白，用0.9%氯 化鈉溶液定容至1000mL(3)生理鹽水【實(shí)驗(yàn)操作】專業(yè)資料word 完美格式1制作標(biāo)準(zhǔn)曲線專業(yè)資料word 完美格式取6支試管，按下表操作試別空白12345標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(mL)0.20.40.60.81.0生理鹽水(mL)1.0 0.80.60.40.2CBB-G250溶液(mL)5.05.05.05.05 05.0混勻，放置2min,于595nm處比色，記錄光密度值(0D值)。以蛋白質(zhì)含量為橫 坐標(biāo)，光密度值(0D值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.樣品測(cè)定取2只

15、試管，按下表操作：管別樣品管空白管稀釋的未知樣品(mL)1.0生理鹽水(mL)1.0CBB-C250溶液(ml)5.05.O混勻，放置2min，于595nm處比色，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得蛋白質(zhì)含量注：樣品用生理鹽水稀釋專業(yè)資料word 完美格式附實(shí)驗(yàn) 2聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定酶的純度【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆沾怪卑逍途郾０纺z電泳的操作方法和原理?！緦?shí)驗(yàn)原理】聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化 劑作用下，聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度加以調(diào)節(jié)。因此用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物時(shí)，被分離物質(zhì)由于所載電荷及其分子大小和形狀的差異，在電

16、場(chǎng)作用下以及凝膠網(wǎng)孔的“分子篩”作用 下產(chǎn)生不同的移動(dòng)速度而互相分離。所以此方法具有電荷效應(yīng)和“分子篩”效應(yīng) 的雙重特性。因?yàn)檫@一方法具有設(shè)備簡單、操作方便、時(shí)間短、樣品用量少、不 易擴(kuò)散等優(yōu)點(diǎn)，所以它是鑒定酶和分離蛋白質(zhì)的有力工具?！緦?shí)驗(yàn)儀器與試劑】1儀器(1) SCR型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(2)垂直板電泳槽及附件10mL注射器、100卩L、10卩L移液器(4)微量注射器、燒杯、移液管(5)真空泵2試劑(1) pH8.9 Tris-HCI緩沖液(1號(hào))：稱取Tris 36.6g，lmol/L HCl 48 mL，TEMED 0.23mL加重蒸餾水定容至100mL(2)凝膠貯液(2號(hào))：稱取丙烯酰胺

17、30g，甲叉雙丙烯酰胺0.8g，加重蒸餾水分別溶解，定容至100mL過濾，棕色瓶4C貯存可使用2周。0.14%過硫酸銨(3號(hào)):稱取(NH)2S060.14g，加重蒸餾水定容至100mL現(xiàn) 用現(xiàn)配)pH6.7 Tris-HCl緩沖液(4號(hào))： 稱取Tris 5.98g，lmol/L HCl 48 mL，TEMED 0.46mL加重蒸餾水定容至100mL電極緩沖液(pH8.3):稱取甘氨酸28.8g，Tris 6.0g，加重蒸餾水定容至1000mL pH為8.3(使用時(shí)稀釋10倍)。(6) 0.1%溴酚藍(lán)指示劑：染色液：考馬斯亮藍(lán)R2500.25g，甲醇227mL冰乙酸46 mL，加蒸餾水定容至

18、500mL專業(yè)資料word 完美格式(8)脫色液：甲醇50mL冰乙酸75 mL,加蒸餾水定容至1000mL【實(shí)驗(yàn)操作】1分離膠的制備(7.5%):1號(hào)貯液：2號(hào)貯液：蒸餾水：3號(hào)貯液按I:2:1:4配制(TEMED 20I)將1、2及水按比例混好后置于三角瓶中，再放在真空干燥器中，同時(shí)將3液也放在真空干燥器中減壓排溶液中的氣泡。抽氣后立即按比例加入3號(hào)液，用玻璃棒輕輕攪拌使之混合。用滴管將其沿管壁注入到已用瓊脂封好的垂直板凝膠 模具兩玻璃夾層中，注意要緩慢，避免產(chǎn)生氣泡。當(dāng)凝膠溶液頂部距玻璃板上端4cm時(shí)為止，然后在凝膠溶液頂部輕輕加約0.5cm厚的蒸餾水層，當(dāng)夾層中的凝 膠與水層之間出現(xiàn)清晰

19、的界面時(shí)，表明凝膠聚合作用已完成，通常需0.5-1ho2濃縮膠制備(3%:4號(hào)貯液(1.25mL), 2號(hào)貯液(1.0mL), 3號(hào)貯液(8mL) (TEMED 15卩L)混勻，將分離膠頂部的水層吸出，把配好的濃縮膠加到分離膠上面， 再將梳板 插到濃縮膠層，靜置，待凝膠聚合后，于室溫放置半小時(shí)以上方可使用。3加樣小心取出梳板，用濾紙條吸去槽內(nèi)水分，于兩電極槽內(nèi)加入電極緩沖液，用微量加樣器加樣，每孔各加20卩I左右，最多可加100卩Io注：E1、E2、E3各100卩L加200卩L 40%蔗糖，再加50卩L溴酚藍(lán)混勻上樣20卩LoE3若含量低可200卩Lo4.電泳加樣后，打開電源開關(guān)，將電流調(diào)50

20、mA當(dāng)染料進(jìn)入濃縮膠與分離膠界面時(shí) 將電流調(diào)至75mA電壓100-200V，待染料遷移至距凝膠下端約1cm時(shí)，停止電 泳。電泳時(shí)間約4-4.5ho5.染色和脫色將凝膠放入染色液中，過夜。次日，倒出染色液，用蒸餾水洗凝膠數(shù)次后，放 入脫色液中，更換脫色液，直至背景清晰。專業(yè)資料word 完美格式附實(shí)驗(yàn) 3 蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私獾孜餄舛扰c酶反應(yīng)速度之間的關(guān)系，學(xué)習(xí)求蔗糖酶米氏常數(shù)的方法。【實(shí)驗(yàn)原理】測(cè)定米氏常數(shù)最常用的方法是雙倒數(shù)作圖法：S實(shí)驗(yàn)時(shí)，選擇不同的S，測(cè)定相應(yīng)的V，求出兩者的倒數(shù)，以1/s為橫坐 標(biāo)，以1/u為縱坐標(biāo)作圖，繪出一條直線(圖1)，外推至橫軸相交，橫軸截距即為

21、-1/Km。此法由于方便而應(yīng)用最廣，但亦有缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)過分集中于直線的左 端，因而作圖不易十分準(zhǔn)確。1/u斜率=Km/V.,1/Vmax-1/Km1/s【實(shí)驗(yàn)儀器與試劑】1儀器(1)721分光光度計(jì)；恒溫水??；(3)試管、吸量管、秒表、坐標(biāo)紙、血糖管2試劑(1)0.1 mol/L蔗糖溶液；(2)0.2 mol/L NaAc緩沖溶液(pH4.6)(3) 1mol/L NaOH溶液，2mol/L NaOH溶液(4) 3，5一二硝基水楊酸試劑稱取10g 3，5一二硝基水楊酸溶于200mL 2mo/L NaOH中，加入300g酒 石酸鉀鈉4H0,再用去離子水稀釋至2000mL【實(shí)驗(yàn)操作】1取試管10支，按110編號(hào)，1號(hào)為空白。2按下表將蔗糖溶液， 醋酸緩沖液分別加入10支試管中， 于35C水浴中保 溫10mi n。3.取約25mL酶液，放入同一水浴中