bio-coures-2

1、蛋白質(zhì)（多肽）的合成蛋白質(zhì)（多肽）的合成蛋白質(zhì)的合成化學合成生物合成由不同氨基酸按一定順序的控制合成蛋白質(zhì)（多肽）的化學合成由一種或幾種氨基酸聚合或共聚合液相合成法：液相合成法：在有機溶劑中進行的均相反應固相合成法：固相合成法：以不溶性高聚物為載體，盡可能以統(tǒng)一的自動化方法在短時間內(nèi)合成意義和基本步驟意義和基本步驟 多肽的全合成可驗證新的多肽結(jié)構(gòu)設計新的多肽，用于研究結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系 為多肽生物合成反應機理提供重要信息 建立模型酶 合成新的多肽藥物 氨基、羧基和側(cè)鏈基團的保護 羧基的活化和形成酰胺鍵的縮合反應 重復上述反應以形成更多的酰胺鍵 脫除保護基團，得到最終產(chǎn)物目標多肽氨基酸之間反應的復

2、雜性氨基酸之間反應的復雜性DCC：N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（N,N-dicyclohexylcarbodiimide）對暫時勿需參與反應的活性基團的保護和對參與形成酰胺鍵的羧基進行活化，是成功合成具有特定氨基酸順序的多肽的兩個基本條件。保護基團的原則保護基團的原則能與被保護基團結(jié)合除去時不影響肽鏈氨基的保護氨基的保護氨基的親核性很強，其經(jīng)?；?，親核性消失。因此對游離氨基實施?；潜Ｗo氨基的基本方法1. 叔丁氧基羰基(tert-butoxycarbonyl group, 簡稱t-Boc)t-Boc基團可以在溫和的酸性條件下被除去，產(chǎn)物容易分離氨基的保護氨基的保護2. 芐氧羰基(carbob

3、enzoxy group, 簡稱CBz)CBz基在弱酸性條件下比較穩(wěn)定，在催化氫解時可被除去，產(chǎn)物也容易分離常用的氨基保護基團常用的氨基保護基團保護基保護基縮寫名稱縮寫名稱在以下條件穩(wěn)定在以下條件穩(wěn)定除去條件除去條件t-BocH2/Pd 或堿或堿HBr+CH3COOH 或或CF3COOHCBzCF3COOH 或堿或堿HBr+CH3COOH或或 H2/PdBPoc堿堿CH3COOH+HCOOH,CF3COOH 或或 HBrNa-NH3, H2/Pd, HCl或或 HBr+CH3COOHNH2NH2-H2O常用的氨基保護基團常用的氨基保護基團保護基保護基縮寫名稱縮寫名稱在以下條件穩(wěn)定在以下條件穩(wěn)定

4、除去條件除去條件TosylHBr+CH3COOH 或堿或堿Na-NH3Trityl堿堿H2/Pd 或或CH3COOH(80%)H2/Pd 或或 Na-NH3NH2NH2+醇醇+酸酸溫和堿性條件溫和堿性條件羧基的保護羧基的保護氨基酸中的羧基一般是以成鹽（鉀鹽、鈉鹽、三乙胺鹽等，臨時性）或成酯的方式被保護。氨基酸甲酯和乙酯是將氨基酸與甲醇或乙醇在鹽酸存在下反應制得。氨基酸苯甲醇酯（benzyl ester, 芐酯）：先生成氯亞硫酸酯羧基的保護羧基的保護叔丁醇酯（t-butyl ester）的制備一般采用酯交換法保保護護基基縮縮寫寫名名稱稱在在以以下下條條件件穩(wěn)穩(wěn)定定除除去去條條件件BzlCF3CO

5、OHH2/Pd或或堿堿（有有副副反反應應）t-BuH2/PdCF3COOHH2/Pd或或酸酸NH2NH2-H2O或或堿堿（有有副副反反應應，易易消消旋旋和和肽肽鍵鍵斷斷裂裂）側(cè)基的保護側(cè)基的保護,-COOH of Glu, AspGlu(OMe)Glu(OBut)Glu(OBzl), Asp(OBzl)-OH of Ser, ThrSer(Bzl)Ser(But)Thr(Bzl)His的咪唑基：His(CBz), His(Tos, 對甲苯磺酸基)保護至最后-NH2 of Lys：Tos；在Na-NH3中除去，在催化氫化或HBr/HAc除-NH2的保護基CBz時不受影響-SH of Cys：Bz

6、l (Na-NH3中除去); MBzl(對甲氧芐基，HF、0C、30min除去); Trt(三苯甲基) 羧基的活化羧基的活化正常條件下，氨基酸的羧基和氨基之間不會自發(fā)形成肽鍵，故兩者必須有一轉(zhuǎn)變?yōu)楦顫姷男问?。由于活化氨基的反應激烈，且常常產(chǎn)生消旋化，通常將羧基活化。其共同的驅(qū)動力為碳原子親電性的加強：由于活化取代基X的負誘導效應，被活化基團中原來的低電子密度進一步降低，形成的親電中心允許親核的非離子化氨基對它進行攻擊。合成肽的常規(guī)方法是從C端向N端進行肽鍵的形成肽鍵的形成1. 羧基活化法酰氯法實際中很少應用，因為容易引起氨基酸消旋化酸酐法由于有兩個親電中心，形成肽鍵時有等量的副產(chǎn)物解決方法：

7、仍有氨基酸消旋化的問題酰基疊氮法優(yōu)點是不易引起氨基酸的消旋化?；B氮在使用和儲存時易分解活性酯法另一種重要的活性酯活性酯與氨基反應形成的酰胺鍵偶聯(lián)劑和肽鍵的形成偶聯(lián)劑和肽鍵的形成偶聯(lián)劑：偶聯(lián)劑：一種能幫助羧基和氨基之間脫水和縮合的試劑碳二亞胺(carbodiimides)：一類偶聯(lián)劑的總稱，結(jié)構(gòu)通式為分子的中心碳原子具有親電性，容易受親核試劑進攻，因而碳二亞胺可與各種弱酸加成類似酸酐結(jié)構(gòu)類似酸酐結(jié)構(gòu)碳二亞胺與羧基反應，形成不穩(wěn)定的類酸酐中間產(chǎn)物，可進一步發(fā)生三種類型的反應碳二亞胺與羧基反應，形成不穩(wěn)定的類酸酐中間產(chǎn)物，可進一步發(fā)生三種類型的反應由第二分子酸由第二分子酸進攻形成酸酐進攻形成酸酐（

8、脲）與胺直接反應形成酰胺鍵與胺直接反應形成酰胺鍵最常用的是N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC):DCC作為偶聯(lián)劑合成二肽的反應過程在溫和反應條件在溫和反應條件(0 C)下，第二分子氨基酸下，第二分子氨基酸(羧基已被保護羧基已被保護)與與DCC不發(fā)生作用，但可以不發(fā)生作用，但可以與類酸酐中間產(chǎn)物反應，生成肽鍵。與類酸酐中間產(chǎn)物反應，生成肽鍵。DCU不溶于大多數(shù)有機溶劑，易與多肽產(chǎn)物分離。不溶于大多數(shù)有機溶劑，易與多肽產(chǎn)物分離。Woodward試劑：本身是一種脫水劑。先在堿的作用下開環(huán)，形成一類似于碳二亞胺的活性碳原子：Woodward 試劑的應用范圍比DCC小。優(yōu)點是方法簡便，產(chǎn)率高；缺點是容易產(chǎn)

9、生消旋化。多肽合成的策略多肽合成的策略 肽肽鏈鏈逐逐漸漸增增加加法法 片片段段組組合合法法 g-h a-b c-d e-f g-h f-g-h a-b-c-d e-f-g-h e-f-g-h, , a-b-c-d-e-f-g-h a-b-c-d-e-f-g-h 產(chǎn)產(chǎn)率率： 7（81） （8 為多肽中氨基酸殘基數(shù)； 為偶聯(lián)反應的平均產(chǎn)率） 3（log28） 保保護護基基團團去去除除 每加入一個新氨基酸殘基前須除去一個氨基保護基 兩個肽段縮合前，須除去一個肽段的氨基和另一肽段的羧基保護基 消消旋旋化化 可能性較小，可用各種偶聯(lián)劑 可能性較大，必須選擇 DCC 等不易引起消旋化的偶聯(lián)劑 對對偶偶聯(lián)聯(lián)

10、反反應應的的要要求求 每一步偶聯(lián)反應較易進行，但要求高產(chǎn)率 片段多肽之間偶聯(lián)較難進行，但對每一步反應產(chǎn)率要求不高 對合成相對分子質(zhì)量不大的多肽，兩種方法均可采用；而若合成相對分子質(zhì)量大的多肽，一般采用片段組合法：合成含有32個氨基酸殘基的多肽，若要求總產(chǎn)率為30%，對于片段組合法和逐步增長法，其每一步的產(chǎn)率分別要求為78%和96%左右。多肽固相合成法多肽固相合成法Merrifield合成法：合成法：所要合成的目標多肽的C端氨基酸的羧基（氨基被保護）以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連；脫除氨基保護基后，以此氨基酸的氨基為多肽合成的起點，同其它氨基酸（氨基被保護）已活化的羧基作用形成肽鍵。不

11、斷重復此過程，即可得目標多肽產(chǎn)物。優(yōu)點反應時間短易實現(xiàn)自動化蛋白質(zhì)自動合成儀無需溶解（選擇溶劑）和精制中間體缺點適合于合成1520肽；當合成肽較大時，純度不高。常選擇PS為載體，在樹脂的苯基上引入氯甲基，將目標多肽的C端羧基與芐氯作用形成芐酯，第二個氨基酸的氨基用叔丁氧羰基保護后，以DCC為縮合劑而形成肽鍵。重復此程序。合成的最后一步，是將樹脂懸浮在無水三氟乙酸中，通入干燥HBr，即可將多肽從樹脂上解脫，同時殘存的保護基也被去掉。多肽固相合成和液相合成的比較多肽固相合成和液相合成的比較羧基遞增方式羧基遞增方式：把氨基酸N端的氨基以共價鍵連于固相載體，活化其羧基與下一個氨基酸的氨基縮合。將側(cè)鏈功

12、能基團連于固相載體：將側(cè)鏈功能基團連于固相載體：i.e.二硝基苯為橋?qū)⒔M氨酸的咪唑基連于固相載體。此法既可以雙向伸長肽鏈，又有利于肽的環(huán)化（二硫鍵的生成），同時也可在溫和條件下從載體上裂下肽段。組合合成法合成多肽組合合成法合成多肽組合合成法：組合合成法：由于多肽及蛋白質(zhì)在生命過程中的特殊作用，特別是在藥物化學和分子生物學等領域的研究中，需要獲得大量的不同結(jié)構(gòu)的多肽，以便進行結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究和生物活性的篩選。因此，合成單一產(chǎn)物的傳統(tǒng)合成方法已經(jīng)不能滿足要求。近十年來，化學家們在多肽固相合成法基礎上，發(fā)展成一種新的多膚組合合成法建立肽庫。組合合成法合成多肽主要有兩條途徑：并行合成法并行合成法(p

13、arallel synthesis)和均分合成法均分合成法(split synthesis)。前者合成速度較慢，合成容量小，現(xiàn)在已經(jīng)很少應用。均分合成法的基本原理基本原理是：每一個合成步驟分別合成出x組中間體，混合均勻后再平均分成x份，分別延長一個結(jié)構(gòu)單元。反應產(chǎn)物再混合均分成x份，再延長一個結(jié)構(gòu)單元，直至完成全部合成。合成目標：合成目標：C-端為Ala，其他三個氨基酸組成為G1u，Phe和Lys的四肽。這種類型的四肽庫共有異構(gòu)體數(shù)目應為3327個。近年來，均分法合成多肽的技術(shù)發(fā)展很快?，F(xiàn)在已經(jīng)可以應用該技術(shù)同步合成上百萬個多肽分子，并同時進行生物活性篩選。例如應用改進的均分法成功地合成了五肽庫。首先將19種氨基酸(由于Cys容易氧化形成交聯(lián)二硫鍵，在該合成中未采用)分別連接在樹脂上，得到19個樹脂-氨基酸。將其混合均勻并脫除保護基后，均分成19份，分別與19種氨基酸(氨基和側(cè)鏈必須保護)進行縮合反應，可以得到1919=361個樹脂-二肽。重復上述步驟三次(混合、脫保護基、均分和與19種氨基酸縮合)，即可合成出195=2,476,099個樹脂-五肽。在脫除保護基后，多肽不必從樹脂上分離，即可直接進行生物活性篩選與受體分子反應。其中與受體分子作用的樹脂-