（精心整理）脯氨酸含量的測(cè)定

1、脯氨酸含量的測(cè)定在逆境條件下，植物體內(nèi)脯氨酸（proline，Pro）的含量顯著增加。植物體內(nèi)脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此測(cè)定脯氨酸含量可以作為抗旱育種的生理指標(biāo)。另外，由于脯氨酸親水性極強(qiáng)，能穩(wěn)定原生質(zhì)膠體及組織內(nèi)的代謝過(guò)程，因而能降低凝固點(diǎn)，有防止細(xì)胞脫水的作用。在低溫條件下，植物組織中脯氨酸含量增加，可提高植物的抗寒性，因此，亦可作為抗寒育種的生理指標(biāo)。一、原理當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時(shí)，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即為紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中，色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低

2、。在520nm波長(zhǎng)下比色，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出（或用回歸方程計(jì)算）脯氨酸的含量。二、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料待測(cè)植物葉片（二）儀器設(shè)備1. 722型分光光度計(jì)；2.研缽；3.100ml小燒杯；4.容量瓶；5.大試管；6.普通試管；7.移液管；8.注射器；9.水浴鍋；10.漏斗；11.漏斗架；12.濾紙；13.剪刀。（三）試劑1.酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6mol/l 磷酸中，攪拌加熱（70）溶解，貯于冰箱中。2. 3%磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100ml。3.冰醋酸。4.甲苯。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（1）在分析天平上精確稱取2

3、5mg脯氨酸，倒入小燒杯中內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液中每毫升含脯氨酸100ug。（2）系列脯氨酸濃度的配置：取6個(gè)50ml容量瓶，分別加入脯氨酸原液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml及3.0ml，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1ug/ml、2ug/ml、3ug/ml、4ug/ml、5ug/ml及6ug/ml。（3）取6支試管，分別吸取2ml系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4ml甲苯，振蕩30s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)

4、至甲苯溶液。（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對(duì)照，于520nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸濃度（X）而變的回歸方程式，再按回歸方程式繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（ug/2ml）。2.樣品的測(cè)定（1）脯氨酸的提取：準(zhǔn)確稱取不同處理的待測(cè)植物葉片各0.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入3%的磺基水楊酸溶液5ml，在沸水浴中提取10min（提取過(guò)程中要經(jīng)常搖動(dòng)），冷卻后過(guò)濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮試劑，在沸

5、水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。（3）冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30s，靜置片刻，取上層液至10ml離心管中，在3000r/min下離心5min。（4）用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520nm波長(zhǎng)處比色，求得吸光度值。四、結(jié)果計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算出（或從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出）2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（X，ug/2ml），然后計(jì)算樣品中脯氨酸含量的百分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：?jiǎn)挝货r質(zhì)量樣品的脯氨酸含量（%）=X×VtW×Vs×106 x100式中：X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出的2ml測(cè)定液中脯氨酸的含量（ug/2ml）； Vt為提取

6、液體積（ml）； Vs為測(cè)定時(shí)取用的樣品體積（ml）； W為樣品質(zhì)量（g）。植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的測(cè)定硝酸還原酶（NR），是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，（NO3-NADHH+NRNO2-NAD+H2O）。產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酸（或?qū)?氨基苯磺酰胺）-萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般以u(píng)g氮/（g·h）為單位。NR的測(cè)定可分為活體法和離體法?；铙w法操作簡(jiǎn)單，適合快速、多組測(cè)定。離體法復(fù)雜，但重復(fù)性好。離體法一

7、、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料水稻、小麥葉片、幼穗等。（二）儀器設(shè)備1.冷凍離心機(jī) 2.分光光度計(jì)3.天平（感量0.1mg）4.冰箱5.恒溫水浴6.研缽 7.剪刀 8.離心管9.具塞試管10.移液管11.吸爾球。（三）試劑1.亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純NaNO2 0.9857g溶于去離子水后定容至1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即為含亞硝態(tài)氮1ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。2. 0.1mol/l pH7.5的磷酸緩沖液：30.0905g Na2HPO4·12 H2O與2.4965g NaH2PO4·2 H2O加去離子水溶解后定容至1000ml。3. 1%（質(zhì)

8、量濃度）磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100ml 3mol/l鹽酸中（25ml濃鹽酸加水定容至100ml即為3mol/l HCl）。4. 0.02%（質(zhì)量濃度）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去離子水中，貯于棕色瓶?jī)?nèi)。5. 0.1mol/l KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸緩沖液。6. 0.025mol/l pH8.7的磷酸緩沖液：8.8640g Na2HPO4·12 H2O，0.0570g K2HPO4·3H2O溶于1000ml去離子水中。7.提取緩沖液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g ED

9、TA溶于100ml 0.025mol/l pH8.7的磷酸緩沖液中。8. 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸緩沖液中（臨用前配制）。二、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按下表順序加入試劑，配成02.0ug的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25下保溫30min，然后在540nm下比色測(cè)定。以亞硝態(tài)氮（ug）為橫坐標(biāo)（X），吸光度值為縱坐標(biāo)（Y）建立回歸方程。配置標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)各物質(zhì)加入量試劑/ml 管 號(hào) 1 2 3 4 5 6 7亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸餾水 2.0 1.8

10、1.6 1.2 0.8 0.4 01%磺胺 4 4 4 4 4 4 40.02%萘基乙烯胺 4 4 4 4 4 4 4每管含亞硝態(tài)氮/ug 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0（二）樣品中硝酸還原酶活力測(cè)定1.酶的提?。悍Q取0.5g鮮樣，剪碎于研缽中置于低溫冰箱冰凍30min，取出置于冰浴中加少量石英砂及4ml提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)入離心管在4、4000r/min下離心15min，上清液即為粗酶提取液。2.酶的反應(yīng)：取粗酶液0.4ml于10ml試管中，加入1.2ml 0.1mol/l KNO3磷酸緩沖液和0.4ml NADH溶液，混勻，在25水浴中保溫30min，對(duì)照不加NAD

11、H溶液，而以0.4ml 0.1mol/l pH7.5的磷酸緩沖液代替。3.終止反應(yīng)和比色測(cè)定：保溫結(jié)束后立即加入1ml磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加1ml萘基乙烯胺溶液，顯色15min后于4000r/min下離心15min，取上清液在540nm下比色測(cè)定。根據(jù)回歸方程計(jì)算出反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（ug）。三、結(jié)果計(jì)算樣品中硝酸還原酶活性u(píng)g/（gh）xVs×VTW×t其中：x為反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量（ug）； VT為提取酶時(shí)加入的緩沖液體積（ml）； Vs為酶反應(yīng)時(shí)取用的粗酶液體積（ml）； W為樣品鮮質(zhì)量（g）； t 為反應(yīng)時(shí)間（h）。根系活力的測(cè)定（TTC法）植

12、物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長(zhǎng)情況和活力水平直接影響地上部分的生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)狀況及產(chǎn)量水平。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為80mV的氧化還原色素，溶于水中成為無(wú)色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲腙。生成的三苯甲腙比較穩(wěn)定，不會(huì)被空氣中的氧自動(dòng)氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗(yàn)的氫受體，植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、蘋(píng)果酸得到增強(qiáng)，而被丙二醛、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料、設(shè)備儀器及試劑（一）材料水培或沙培小麥、玉米等植物根系。（二）儀器設(shè)備1.分光光度計(jì)2.分析天平（感量0

13、.1mg）3.電子頂載天平（感量0.1g）4.溫箱5.研缽6.50ml三角瓶7.漏斗8.100ml量筒9.10ml吸量管10.10ml刻度試管11.試管架12.10ml容量瓶13.藥勺14.石英砂適量15.10ml、1000ml燒杯。（三）試劑1.乙酸乙酯（分析純）2.次硫酸鈉（Na2S2O4），分析純，粉末。3. 1%TTC溶液：準(zhǔn)確稱取TTC1.0g，溶于少量水中，定容至100ml。用時(shí)稀釋至所需要的各種濃度。4.磷酸緩沖液（1/15mol/l pH7）：準(zhǔn)確稱取9.067g磷酸二氫鉀（KH2PO4），加1mol/l NaOH溶液38.8ml，并加水定容至1000ml（或者1/15mol/

14、l的磷酸氫二鈉：稱取Na2HPO4·12 H2O 23.88g蒸餾水定容至1000ml；1/15mol/l的磷酸二氫鉀：稱取分析純KH2PO4 9.07g，用純水定容至1000ml。pH7的磷酸緩沖液即為取1/15mol/l的磷酸氫二鈉12ml，1/15mol/l的磷酸二氫鉀8ml，兩者混合即可。）5. 1mol/l硫酸：用量筒取相對(duì)質(zhì)量1.84的濃硫酸55ml，邊攪拌邊加入盛有500ml蒸餾水的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。三、實(shí)驗(yàn)步驟定量測(cè)定（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取0.4%TTC溶液0.25ml放入10ml試管中，加少許Na2S2O4粉末搖勻后立即產(chǎn)生紅色的甲腙。再用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置于10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲腙25ug、50ug、100ug、150ug、200ug的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線