蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù)

1、蛋白質(zhì)常規(guī)層析技術(shù) 純化組趙波 2010.3v一、層析概述一、層析概述v二、常用層析技術(shù)二、常用層析技術(shù)v三、純化策略三、純化策略一、層析概述一、層析概述v 層析法也稱色譜法層析法也稱色譜法(chromatography)是是1906年俄國植物學(xué)家年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開，由此得名為由此得名為“色譜法色譜法”。1.層析的原理層析的原理v 層析技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱

2、。層析技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱。v 當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于各組份的由于各組份的理化性質(zhì)存在差異理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)，與兩相發(fā)生相互作用（生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合吸附、溶解、結(jié)合等）的能力等）的能力不同，在不同，在兩相中的分配（含量對比）不同兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組份不斷地在兩而且隨流動(dòng)相向前移動(dòng)，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配，從而達(dá)到將各組份分離的相中進(jìn)行再分配，從而達(dá)到將各組份分離的目的。目的。2.層析的分類層析的分類v 按固定相基質(zhì)的形式：按固定相基質(zhì)的形式： 柱層析、紙層析和薄層層析

3、柱層析、紙層析和薄層層析 v根據(jù)流動(dòng)相的形式：根據(jù)流動(dòng)相的形式： 液相層析、氣相層析液相層析、氣相層析2.層析的分類層析的分類2.層析的分類層析的分類二、常用層析技術(shù)二、常用層析技術(shù)v親和層析親和層析v離子交換層析離子交換層析v疏水層析疏水層析v凝膠過濾層析凝膠過濾層析親和層析親和層析原理：原理： 親和層析是利用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將親和層析是利用生物高分子與配基可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價(jià)鍵結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。配基通過共價(jià)鍵結(jié)合于載體上而制得的層析系統(tǒng)。這種可逆這種可逆結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結(jié)構(gòu)的識結(jié)合的作用主要是靠生物高分子對它的配基的空間結(jié)構(gòu)

4、的識別。別。 常用的生物親和關(guān)系有酶常用的生物親和關(guān)系有酶- -底物、抗體底物、抗體- -抗原、外源凝集抗原、外源凝集素素- -糖蛋白等。糖蛋白等。 Affinity.swf填料選擇：填料選擇：v重點(diǎn)：選擇合適的配基重點(diǎn)：選擇合適的配基v應(yīng)用：應(yīng)用：原理：原理： 以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離。行分離。 通過靜電相互作用而使帶正電荷的樣品結(jié)合到陽離子交通過靜電相互作用而使帶正電荷的樣品結(jié)合到陽離子交換介質(zhì)上，而帶負(fù)電荷的

5、介質(zhì)則可結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)上，換介質(zhì)上，而帶負(fù)電荷的介質(zhì)則可結(jié)合到陰離子交換介質(zhì)上，再采用改變鹽濃度或者緩沖液的再采用改變鹽濃度或者緩沖液的pHpH值的方法進(jìn)行洗脫。值的方法進(jìn)行洗脫。 Ion Ion Exchange.swfExchange.swf離子交換層析離子交換層析 影響因素：影響因素：v緩沖液的鹽濃度和緩沖液的鹽濃度和pH pH 值。值。v在進(jìn)行在進(jìn)行pHpH梯度洗脫時(shí)，盡量避免跨越蛋白質(zhì)梯度洗脫時(shí)，盡量避免跨越蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。的等電點(diǎn)。洗脫策略：洗脫策略：v洗脫模式：流穿模式、結(jié)合模式。洗脫模式：流穿模式、結(jié)合模式。v洗脫方法：分步洗脫法、梯度洗脫法。洗脫方法：分步洗脫法、梯度洗

6、脫法。v分步洗脫一般應(yīng)用于在其中某一種鹽濃度收集一種分步洗脫一般應(yīng)用于在其中某一種鹽濃度收集一種目標(biāo)蛋白質(zhì)，因此也一般應(yīng)用于已知樣品。目標(biāo)蛋白質(zhì)，因此也一般應(yīng)用于已知樣品。v梯度洗脫是按一定的濃度梯度連續(xù)改變鹽濃度進(jìn)行梯度洗脫是按一定的濃度梯度連續(xù)改變鹽濃度進(jìn)行洗脫，梯度越平緩，分辨率越高，但同時(shí)樣品越稀。洗脫，梯度越平緩，分辨率越高，但同時(shí)樣品越稀。去除內(nèi)毒素和去除內(nèi)毒素和DNA：v核酸帶強(qiáng)負(fù)電荷，在純化樣品時(shí)可以利用陽離子交核酸帶強(qiáng)負(fù)電荷，在純化樣品時(shí)可以利用陽離子交換介質(zhì)（如換介質(zhì)（如SP SFFSP SFF）結(jié)合目的蛋白而使核酸流穿；）結(jié)合目的蛋白而使核酸流穿；或者采用陰離子交換介質(zhì)（

7、或者采用陰離子交換介質(zhì)（Q SFFQ SFF），使樣品流穿），使樣品流穿而結(jié)合核酸。而結(jié)合核酸。v內(nèi)毒素是也帶負(fù)電荷的復(fù)合大分子，能與陰離子交內(nèi)毒素是也帶負(fù)電荷的復(fù)合大分子，能與陰離子交換介質(zhì)較強(qiáng)結(jié)合而在陽離子交換介質(zhì)上流穿。換介質(zhì)較強(qiáng)結(jié)合而在陽離子交換介質(zhì)上流穿。填料選擇：填料選擇：v重點(diǎn)：在于選擇合適的分辨率重點(diǎn)：在于選擇合適的分辨率 原理：原理： 根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種方法。等生物大分子的一種方法。 蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團(tuán)，稱為疏水補(bǔ)丁，疏水

8、補(bǔ)丁可以與一些疏水性基團(tuán)，稱為疏水補(bǔ)丁，疏水補(bǔ)丁可以與疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。疏水性層析介質(zhì)發(fā)生疏水性相互作用而結(jié)合。 溶液中高離子強(qiáng)度可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)和多肽等生溶液中高離子強(qiáng)度可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。物大分子與疏水性層析介質(zhì)之間的疏水作用。 Hydrophobic Interaction.swf疏水層析疏水層析影響因素：影響因素：v鹽類，鹽可增加水相的極性，提高界面的表面張力，同時(shí)可鹽類，鹽可增加水相的極性，提高界面的表面張力，同時(shí)可使蛋白質(zhì)暴露出臨近界面的非極性基團(tuán)，容易形成疏水作用。使蛋白質(zhì)暴露出臨近界面的非極性基團(tuán)，容易形成疏水作用

9、。所以鹽濃度越高，促疏水作用越強(qiáng)。所以鹽濃度越高，促疏水作用越強(qiáng)。 v有機(jī)溶劑，同鹽作用相反，減少疏水作用。有機(jī)溶劑，同鹽作用相反，減少疏水作用。 v表面活性劑也能減少疏水作用。表面活性劑也能減少疏水作用。 v不同鹽增強(qiáng)疏水配基和蛋白質(zhì)之間的相互作用不同鹽增強(qiáng)疏水配基和蛋白質(zhì)之間的相互作用洗脫策略：洗脫策略：v在吸附時(shí)應(yīng)適當(dāng)增強(qiáng)鹽濃度以增強(qiáng)蛋白質(zhì)與層析劑在吸附時(shí)應(yīng)適當(dāng)增強(qiáng)鹽濃度以增強(qiáng)蛋白質(zhì)與層析劑之間的疏水作用力，洗脫可采用低濃度的鹽溶液洗之間的疏水作用力，洗脫可采用低濃度的鹽溶液洗脫。脫。v對于結(jié)合較強(qiáng)的蛋白質(zhì)可以在洗脫劑中添加一些溫對于結(jié)合較強(qiáng)的蛋白質(zhì)可以在洗脫劑中添加一些溫和的有機(jī)溶劑如

10、多元醇或表面活性劑來洗脫。和的有機(jī)溶劑如多元醇或表面活性劑來洗脫。去除內(nèi)毒素和去除內(nèi)毒素和DNA：v核酸在高鹽條件下會和蛋白解離核酸在高鹽條件下會和蛋白解離, ,利用疏水層析介利用疏水層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白, ,去除核酸。去除核酸。v熱原含脂肪熱原含脂肪A A、糖類和蛋白，其脂肪、糖類和蛋白，其脂肪A A部份有很強(qiáng)的部份有很強(qiáng)的疏水性，但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。因疏水性，但在高鹽下會凝集，無法上疏水層析。因此可利用疏水層析結(jié)合目標(biāo)蛋白而去除熱原。此可利用疏水層析結(jié)合目標(biāo)蛋白而去除熱原。填料選擇：填料選擇：v重點(diǎn)：選擇填料的疏水性強(qiáng)弱重點(diǎn)：選擇填料的疏水性強(qiáng)弱v配基的類型：配

11、基的類型：原理：原理： 凝膠過濾層析是根據(jù)被分離物分子大小和形狀凝膠過濾層析是根據(jù)被分離物分子大小和形狀的差異進(jìn)行分離。的差異進(jìn)行分離。 填料含有許多不同大小的孔，體積大的分子不填料含有許多不同大小的孔，體積大的分子不能進(jìn)入體積小的孔，而體積小的物質(zhì)可進(jìn)入大孔，能進(jìn)入體積小的孔，而體積小的物質(zhì)可進(jìn)入大孔，也可進(jìn)入小孔，因此在柱中保留的時(shí)間比體積大的也可進(jìn)入小孔，因此在柱中保留的時(shí)間比體積大的物質(zhì)長。整個(gè)樣品按分子量的大小順序分開，體積物質(zhì)長。整個(gè)樣品按分子量的大小順序分開，體積最大的物質(zhì)最先出峰，體積最小的物質(zhì)最后出峰。最大的物質(zhì)最先出峰，體積最小的物質(zhì)最后出峰。因此，凝膠過濾層析又被形象地稱

12、為分子篩層析。因此，凝膠過濾層析又被形象地稱為分子篩層析。 Gel Filtration.swfGel Filtration.swf凝膠過濾層析凝膠過濾層析影響因素與洗脫策略：影響因素與洗脫策略：v對于凝膠過濾層析，其主要影響因素有上樣體積和流動(dòng)相的對于凝膠過濾層析，其主要影響因素有上樣體積和流動(dòng)相的鹽濃度。鹽濃度過低，會引起生物分子和介質(zhì)之間的產(chǎn)生非鹽濃度。鹽濃度過低，會引起生物分子和介質(zhì)之間的產(chǎn)生非特異性結(jié)合，可以適量的提高流動(dòng)相的鹽濃度，一般大于特異性結(jié)合，可以適量的提高流動(dòng)相的鹽濃度，一般大于0.05mol/L0.05mol/L。 v脫鹽脫鹽/ /換液常用換液常用SephadexSep

13、hadex G-25 G-25，其最大上樣量為，其最大上樣量為30%30%。上樣。上樣體積太大，會導(dǎo)致樣品脫鹽體積太大，會導(dǎo)致樣品脫鹽/ /換液不徹底；換液不徹底； v除多聚體或降解產(chǎn)物，根據(jù)分子量不同常選擇除多聚體或降解產(chǎn)物，根據(jù)分子量不同常選擇SuperdexSuperdex 200 200或其他介質(zhì)，其最大上樣量僅為或其他介質(zhì)，其最大上樣量僅為2%2%。超過上樣量會降低分辨。超過上樣量會降低分辨率，導(dǎo)致目的蛋白和聚體等不能徹底分開。率，導(dǎo)致目的蛋白和聚體等不能徹底分開。 填料選擇：填料選擇：v重點(diǎn)：選擇分離范圍重點(diǎn)：選擇分離范圍v精度：分子量差別一倍以上精度：分子量差別一倍以上v類型：類

14、型：SephadexSephadex、SuperdexSuperdex、SephacrylSephacryl、SepharoseSepharose、SuperoseSuperose介質(zhì)介質(zhì)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)小顆小顆粒粒分離效果好分離效果好流速慢流速慢 分離時(shí)間長分離時(shí)間長大顆大顆粒粒流速快流速快區(qū)帶擴(kuò)散區(qū)帶擴(kuò)散 洗脫峰平而寬洗脫峰平而寬三、純化策略三、純化策略v基因工程制藥的特點(diǎn)基因工程制藥的特點(diǎn)v策略策略v應(yīng)用應(yīng)用基因工程藥物制備的特點(diǎn)基因工程藥物制備的特點(diǎn)v表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)液中含量較低；表達(dá)產(chǎn)物在培養(yǎng)液中含量較低；v含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；v表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性

15、；表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差，易失活變性；v表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；v對其質(zhì)量要求純度高、無菌、無熱原。對其質(zhì)量要求純度高、無菌、無熱原。策略策略1: 純化三步法純化三步法(粗、中、精粗、中、精)純化工藝的基本結(jié)構(gòu)純化工藝的基本結(jié)構(gòu)v1、粗純：濃、粗純：濃縮，穩(wěn)定蛋縮，穩(wěn)定蛋白（去除蛋白（去除蛋白酶）白酶）v關(guān)注點(diǎn)：純關(guān)注點(diǎn)：純化速度和膠化速度和膠載量關(guān)系載量關(guān)系v2、中度純、中度純化：去除主化：去除主要雜質(zhì)要雜質(zhì)v關(guān)注點(diǎn)：載關(guān)注點(diǎn)：載量與分辨率量與分辨率的關(guān)系的關(guān)系v3、精純：、精純：最終去除痕最終去除痕量雜質(zhì)（結(jié)量雜質(zhì)（結(jié)構(gòu)變體）構(gòu)變體）v關(guān)注

16、點(diǎn)：分關(guān)注點(diǎn)：分辨率與收率辨率與收率關(guān)系關(guān)系純化技術(shù)在三步純化策略中的應(yīng)用純化技術(shù)在三步純化策略中的應(yīng)用技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)特點(diǎn)粗純粗純中度中度精純精純離子交換離子交換 高分辨率、高高分辨率、高流速、高速度流速、高速度 疏水疏水分辨率好、容分辨率好、容量好、高速度量好、高速度 親和親和高分辨率、高高分辨率、高容量、高速度容量、高速度 凝膠過濾凝膠過濾高分辨率高分辨率（SurpedexSurpedex） 策略策略2：步驟越少，收率越高：步驟越少，收率越高總收率總收率每步收率每步收率( () ) 第一步第一步第二步第二步第三步第三步第四步第四步第五步第五步9999999998989797969695959

17、5959595909085.585.581.581.577.477.490909090818172.972.965.565.5595980808080646451.251.240.140.132.832.870707070494934.334.324.024.016.816.8策略策略3：交替運(yùn)用互補(bǔ)技術(shù)，合理串聯(lián)：交替運(yùn)用互補(bǔ)技術(shù)，合理串聯(lián)v將分離機(jī)制互補(bǔ)的技術(shù)進(jìn)行組合，交替運(yùn)用將分離機(jī)制互補(bǔ)的技術(shù)進(jìn)行組合，交替運(yùn)用不同的層析方法不同的層析方法v綜合考慮起始和結(jié)束條件串聯(lián)，減少不同層綜合考慮起始和結(jié)束條件串聯(lián)，減少不同層析技術(shù)間的樣品處理（濃縮；置換緩沖液）析技術(shù)間的樣品處理（濃縮；置換緩沖液）v設(shè)計(jì)合理純化路線，盡量簡單設(shè)計(jì)合理純化路線，盡量簡單策略策略4：線性放大：線性放大需固定條件：需固定條件：v相同填料相同填料v相同緩沖液相同緩沖液v相同線速度、相同柱高相同線速度、相同柱高v相同樣品濃度與緩沖條件相同樣品濃度與緩沖條件v