基因組DNA的提取

1、第六章 基因組DNA的提取第一節(jié) 概 述基因組DNA的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern雜交(包括RFLP)及PCR分離基因等。利用基因組DNA較長(zhǎng)的特性,可以將其與細(xì)胞器或質(zhì)粒等小分子DNA分離。加入一定量的異丙醇或乙醇，基因組的大分子DNA即沉淀形成纖維狀絮團(tuán)飄浮其中,可用玻棒將其取出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附于壁上及底部,從而達(dá)到提取的目的。在提取過程中,染色體會(huì)發(fā)生機(jī)械斷裂,產(chǎn)生大小不同的片段,因此分離基因組DNA時(shí)應(yīng)盡量在溫和的條件下操作,如盡量減少酚/氯仿抽提、混勻過程要輕緩,以保證得到較長(zhǎng)的DNA。一般來說,構(gòu)建基因組文庫(kù), 初始DNA長(zhǎng)度必須在100kb以上

2、,否則酶切后兩邊都帶合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析,DNA長(zhǎng)度可短至50kb,在該長(zhǎng)度以上,可保證酶切后產(chǎn)生RFLP片段(20kb以下),并可保證包含PCR所擴(kuò)增的片段(一般2kb以下)。不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA的提取方法有所不同;不同種類或同一種類的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。在提取某種特殊組織的DNA時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法,以獲得可用的DNA大分子。尤其是組織中的多糖和酶類物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類物質(zhì)的材料提取基因組DNA時(shí),應(yīng)考慮除去多糖和酚類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)以水稻幼苗(

3、禾本科)、李(蘋果)葉子、動(dòng)物肌肉組織和大腸桿菌培養(yǎng)物為材料,學(xué)習(xí)基因組DNA提取的一般方法。第二節(jié) 從植物組織提取基因組DNA一、材料水稻幼苗或其它禾本科植物，李（蘋果）幼嫩葉子。二、設(shè)備移液器，冷凍高速離心機(jī)，臺(tái)式高速離心機(jī)，水浴鍋，陶瓷研缽，50ml離心管（有蓋）及5ml和1.5ml離心管，彎成鉤狀的小玻棒。三、試劑1、提取緩沖液：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5%SDS。2、提取緩沖液：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸鈉，6.0gPVP，240ul巰基乙醇，加水至300ml。3、

4、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇4、 RnaseA母液：配方見第一章。5、其它試劑：液氮、異丙醇、TE緩沖液，無水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。四、操作步驟：（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因組DNA提取1. 在50ml離心管中加入20ml提取緩沖液,60水浴預(yù)熱。2. 水稻幼苗或葉子5-10g, 剪碎, 在研缽中加液氮磨成粉狀后立即倒入預(yù)熱的離心管中, 劇烈搖動(dòng)混勻,60水浴保溫30-60分鐘(時(shí)間長(zhǎng),DNA產(chǎn)量高), 不時(shí)搖動(dòng)。3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 顛倒混勻(需帶手套,防止損傷皮膚)，室溫下靜置5-10分鐘, 使水相和有機(jī)相分層(必要時(shí)可重新混勻)。4. 室

5、溫下5000rpm離心5分鐘。5.仔細(xì)移取上清液至另一50ml離心管,加入1倍體積異丙醇,混勻,室溫下放置片刻即出現(xiàn)絮狀DNA沉淀。6. 在1.5mleppendorf中加入1ml TE。用鉤狀玻璃棒撈出DNA絮團(tuán),在干凈吸水紙上吸干,轉(zhuǎn)入含TE的離心管中,DNA很快溶解于TE。7.如DNA不形成絮狀沉淀,則可用5000rpm離心5分鐘, 再將沉淀移入TE管中。這樣收集的沉淀,往往難溶解于TE,可在60水浴放置15分鐘以上，以幫助溶解。8. 將DNA溶液3000rpm離心5分鐘, 上清液倒入干凈的5ml離心管。9. 加入5l RNaseA(10g/l), 3710分鐘, 除去RNA(RNA對(duì)D

6、NA的操作、分析一般無影響，可省略該步驟）。10. 加入1/10體積的3mol/LNaAc及2×體積的冰乙醇,混勻,-20放置20分鐘左右,DNA形成絮狀沉淀。11.用玻棒撈出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干凈吸水紙上吸干。12. 將DNA重溶解于1ml TE, -20貯存。13. 取2lDNA樣品在0.7% Agarose膠上電泳, 檢測(cè)DNA的分子大小。同時(shí)取15l稀釋20倍, 測(cè)定OD260/OD280,檢測(cè)DNA含量及質(zhì)量。注意 5g樣品可保證獲得500g DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。（二）.從李(蘋果)葉子提取基因組DNA1. 取3-5克嫩葉, 液氮磨成粉狀

7、。2. 加入提取緩沖液10ml,再研磨至溶漿狀。10000rpm, 10min。3. 去上清液,沉淀加提取液20ml, 混勻。65, 30-60min, 常搖動(dòng)。4. 同本節(jié)（一）中步驟3-13操作。第三節(jié) 從動(dòng)物組織提取基因組DNA一、材料哺乳動(dòng)物新鮮組織。二、設(shè)備移液管、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋。三、試劑1、分離緩沖液：10mmol/LTris·Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。2、其它試劑：10% SDS，蛋白酶 K(20mg/ml或粉劑)，乙醚，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaC

8、l，3mol/L NaAc，TE。四、操作步驟:1. 切取組織5g左右,剔除結(jié)締組織,吸水紙吸干血液,剪碎放入研缽(越細(xì)越好)。2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分離緩沖液。3. 加1ml 10% SDS, 混勻,此時(shí)樣品變得很粘稠。4. 加50ul或1mg蛋白酶 K, 37保溫1-2小時(shí), 直到組織完全解體。5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混勻,5000rpm離心數(shù)秒鐘。6.取上清液于新離心管，用等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提。待分層后,3000rpm離心 5分鐘。7.取上層水相至干凈離心管, 加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。8. 移去上層乙醚,保留下層水相。

9、9. 加1/10體積3mol/L NaAc, 及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。室溫下靜止10-20分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。10.用玻棒鉤出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水紙上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。11.如果DNA溶液中有不溶解顆粒,可在5000rpm短暫離心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5l RNaseA(10g/l), 37保溫30分鐘,用酚抽提后, 按步驟9-10重沉淀DNA。第四節(jié) 細(xì)菌基因組DNA的制備一、材料細(xì)菌培養(yǎng)物。二、設(shè)備移液管, 高速冷凍離心機(jī), 臺(tái)式離心機(jī)，水浴鍋。三、試劑1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80

10、mlH2 O,緩慢加入10g CTAB,加水至100ml。2、其它試劑：氯仿:異戊醇(24:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，異丙醇，70%乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉劑)，5mol/L NaCl。四、操作步驟：1. 100ml細(xì)菌過夜培養(yǎng)液, 5000rpm離心10分鐘, 去上清液。2. 加9.5ml TE懸浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50l20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混勻, 37保溫1小時(shí)。3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混勻。4.加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混勻, 65保溫20分鐘。5. 用

11、等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提,5000rpm離心10分鐘, 將上清液移至干凈離心管。6. 用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干凈管中。7.加1倍體積異丙醇, 顛倒混合, 室溫下靜止10分鐘，沉淀DNA。8. 用玻棒撈出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE,-20保存。如DNA沉淀無法撈出,可5000rpm離心, 使DNA沉淀。9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三節(jié)中操作步驟處理。第五節(jié) 基因組DNA的檢測(cè)上述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA產(chǎn)量及質(zhì)量均不同,有時(shí)

12、DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì),會(huì)影響酶切和PCR的效果。所以獲得基因組DNA后,均需檢測(cè)DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。1.DNA溶液稀釋20-30倍后,測(cè)定OD260 /OD280 比值, 明確DNA的含量和質(zhì)量。2. 取2-5l 在0.7%agarose膠上電泳, 檢測(cè)DNA的分子大小。3. 取2g DNA, 用10單位(U)Hind酶切過夜, 0.7% agarose膠上電泳,檢測(cè)能否完全酶解(做RFLP, DNA必須完全酶解)。如果DNA中所含雜質(zhì)多, 不能完全酶切, 或小分子DNA多,影響接續(xù)的分析和操作,可以用下列方法處理：（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類的含量。（2） 酚:氯仿抽提, 去

13、除蛋白質(zhì)和多糖。（3）Sepharose柱過濾, 去除酚類、多糖和小分子DNA。（4）CsCl梯度離心, 去除雜質(zhì),分離大片段DNA(可用作文庫(kù)構(gòu)建)。第七章 RFLP和RAPD技術(shù)第一節(jié) 概述DNA分子水平上的多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。RFLP是根據(jù)不同品種（個(gè)體）基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，或酶切位點(diǎn)之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導(dǎo)致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進(jìn)行檢

14、測(cè)，從而可比較不同品種（個(gè)體）的DNA水平的差異（即多態(tài)性），多個(gè)探針的比較可以確立生物的進(jìn)化和分類關(guān)系。所用的探針為來源于同種或不同種基因組DNA的克隆，位于染色體的不同位點(diǎn)，從而可以作為一種分子標(biāo)記(Mark)，構(gòu)建分子圖譜。當(dāng)某個(gè)性狀（基因）與某個(gè)（些）分子標(biāo)記協(xié)同分離時(shí)，表明這個(gè)性狀（基因）與分子標(biāo)記連鎖。分子標(biāo)記與性狀之間交換值的大小，即表示目標(biāo)基因與分子標(biāo)記之間的距離，從而可將基因定位于分子圖譜上。分子標(biāo)記克隆在質(zhì)粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA后，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內(nèi)切酶與分子標(biāo)記組成不同組合進(jìn)行研究。常用的限制性內(nèi)切酶一般是Hind，Bam

15、H,EcoR,EcoRV,Xba,而分子標(biāo)記則有幾個(gè)甚至上千個(gè)。分子標(biāo)記越多，則所構(gòu)建的圖譜就越飽和。構(gòu)建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標(biāo)之一。運(yùn)用隨機(jī)引物擴(kuò)增尋找多態(tài)性DNA片段可作為分子標(biāo)記。這種方法即為RAPD(Randomamplified polymorphic DNA ，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)。盡管RAPD技術(shù)誕生的時(shí)間很短,但由于其獨(dú)特的檢測(cè)DNA多態(tài)性的方式以及快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn),使這個(gè)技術(shù)已滲透于基因組研究的各個(gè)方面。該RAPD技術(shù)建立于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上,它是利用一系列(通常數(shù)百個(gè))不同的隨機(jī)排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對(duì)所研究基因組DNA進(jìn)行PCR

16、擴(kuò)增.聚丙烯酰胺或瓊脂糖電泳分離,經(jīng)EB染色或放射性自顯影來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性,這些擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性反映了基因組相應(yīng)區(qū)域的DNA多態(tài)性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對(duì)于任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結(jié)合位點(diǎn).這些特異的結(jié)合位點(diǎn)在基因組某些區(qū)域內(nèi)的分布如符合PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補(bǔ)位置,且引物3'端相距在一定的長(zhǎng)度范圍之內(nèi),就可擴(kuò)增出DNA片段.因此如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化,而使PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量的改變。通過對(duì)PCR產(chǎn)物

17、檢測(cè)即可檢出基因組DNA的多態(tài)性。分析時(shí)可用的引物數(shù)很大,雖然對(duì)每一個(gè)引物而言其檢測(cè)基因組DNA多態(tài)性的區(qū)域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測(cè)區(qū)域幾乎覆蓋整個(gè)基因組。因此RAPD可以對(duì)整個(gè)基因組DNA進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。另外，RAPD片段克隆后可作為RFLP的分子標(biāo)記進(jìn)行作圖分析。本實(shí)驗(yàn)將學(xué)習(xí)RFLP的酶切,電泳和膜的制作以及RAPD技術(shù)。探針標(biāo)記及雜交檢測(cè)方法請(qǐng)另詳見分子雜交技術(shù)。第二節(jié)RFLP技術(shù)一、 材料基因組DNA(大于50kb,分別來自不同的材料)。二、設(shè)備電泳儀及電泳槽，照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendo

18、rf管(0.5ml)若干。三、試劑：1、限制性內(nèi)切酶(BamH, EcoR, Hind, Xba)及10×酶切緩沖液。2、5×TBE電泳緩沖液：配方見第一章。3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。4、中和液：1mol/LTris·Cl,pH7.5/1.5mol/L NaCl 。5、10×SSC：配方見第九章。6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/LTris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。四. 操作步驟1.基因組D

19、NA的酶解(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實(shí)驗(yàn),要求提取的DNA分子量大于50kb, 沒有降解。(2)在50l反應(yīng)體系中,進(jìn)行酶切反應(yīng):5g基因組DNA5l 10×酶切緩沖液20單位（U）限制酶(任意一種)加ddH2 O, 至50l(3) 輕微振蕩,離心,37反應(yīng)過夜。(4) 取5l反應(yīng)液,0.8瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時(shí)不應(yīng)有大于30kb的明顯亮帶出現(xiàn)。注意未酶切的DNA要防止發(fā)生降解, 酶切反應(yīng)一定要徹底。2. Southern轉(zhuǎn)移（1）酶解的DNA經(jīng)0.8瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)后EB染色觀察。 （2） 將凝膠塊浸沒于0.25mol/L HCl中脫嘌呤

20、, 10分鐘。（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉(zhuǎn)至變性液變性45分鐘。經(jīng)蒸餾水漂洗后轉(zhuǎn)至中和液中和30分鐘。（4）預(yù)先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架于盆中鋪一層濾紙(橋)然后將膠塊反轉(zhuǎn)放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物,以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時(shí)。也可用電轉(zhuǎn)移或真空轉(zhuǎn)移。（5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒,迅速轉(zhuǎn)至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。（6） 將膜夾于2層濾紙內(nèi), 80真空干燥2小時(shí)。（7） 探針的制備和雜

21、交見第九章分子雜交部分。注意 1、 步驟（2）中脫嘌呤時(shí)間不能過長(zhǎng)。2、除步驟（1）、（4）、（5）外, 其余均在搖床上進(jìn)行操作。3、步驟（4）中,當(dāng)尼龍膜覆于膠上時(shí), 絕對(duì)防止膠與膜之間有氣泡發(fā)生,加蓋濾時(shí)也不應(yīng)有氣泡發(fā)生。4、有時(shí)用一種限制性內(nèi)切酶不能發(fā)現(xiàn)RFLP的差異，這時(shí)應(yīng)該試用另一種酶。第三節(jié) RAPD技術(shù)一、 材料不同來源的DNA(50ng/ul)。二、設(shè)備PCR儀，PCR管或硅化的0.5mleppendorf管，電泳裝置。三、試劑1、隨機(jī)引物(10mer) (5umol/L)：購(gòu)買成品。2、Taq酶：購(gòu)買成品。3、10xPCR 緩沖液：配方見第八章。4、MgCl2 ：25mmol

22、/L。5、dNTP：每種2.5mmol/L。四、操作步驟：1. 在25ul反應(yīng)體系中,加入模板DNA 1ul (50ng) 隨機(jī)引物 1ul (約5pmol)10xPCR Buffer 2.5ulMgCl2 2uldNTP 2ulTaq酶 1單位（U）加ddH2O 至 25ul混勻稍離心, 加一滴礦物油。2. 在加熱至90以上的PCR儀中預(yù)變性94 2分鐘, 然后循環(huán): 94 1分鐘， 36 1分鐘， 72 1分鐘，共40輪循環(huán)。3. 循環(huán)結(jié)束后, 72 10分鐘，4保存。4. 取PCR產(chǎn)物15ul加3ul上樣緩沖液(6x)于2% 瓊脂糖膠上電泳,穩(wěn)壓50-100（電壓低帶型整齊， 分辨率高）

23、。5. 電泳結(jié)束，觀察、拍照。注意 1、電泳時(shí)一般RAPD帶有5-15條,大小0.1-2.0kb。2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個(gè)新的分子標(biāo)記應(yīng)用。第八章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆第一節(jié) 概 述PCR(Polymerase ChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個(gè)基本步驟: (1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94下解鏈; (2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50mol/L。引物過多會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體,過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì), 可精確計(jì)算引物濃度, 在1cm光

24、程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個(gè)數(shù)。2.4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計(jì)測(cè)定其準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L。理論上4種 dNTP各20mol/L,足以在100l反應(yīng)中合成2.6g的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)

25、該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。3. Mg2+：Mg2+濃度對(duì)TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+濃度范圍為0.5-2mmol/L.對(duì)于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5mmol/L的遞增濃度的Mg2+進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+離子濃度的物質(zhì),以保證最適Mg2+ 濃度。4. 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子

26、,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個(gè)拷貝,對(duì)于單拷貝基因,這需要0.1g的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí),用量更少.靈敏的PCR可從一個(gè)細(xì)胞,一根頭發(fā),一個(gè)孢子或一個(gè)精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物.DNA中的雜質(zhì)也會(huì)影響PCR的效率。5.Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5 130min,95 40min, 975min.現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的

27、DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長(zhǎng)時(shí)間.TaqDNA聚合酶的酶活性單位定義為74下,30min,摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.TaqDNA聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率,一般PCR中出錯(cuò)率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100lPCR反應(yīng)中,1.5-2單位的TaqDNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會(huì)使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活TaqDNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚

28、合酶的方法有：(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3)99-100加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。6. 反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl(20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ .Tris·Cl在20時(shí)pH為8.3-8.8,但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加

29、入T4噬菌體的基因32蛋白則對(duì)擴(kuò)增較長(zhǎng)的DNA片段有利.各種TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。二、PCR反應(yīng)參數(shù)1.變性：在第一輪循環(huán)前,在94下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hotstart),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對(duì)的引物與模板復(fù)合物所造成的錯(cuò)誤。變性不完全,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為941min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取?duì)于富含GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.

30、但變性溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。2.退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5。一般當(dāng)引物中GC含量高,長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí),應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60和94)完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán),既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時(shí)間為37-55,1-2min。3.延伸：延伸反應(yīng)通常為72,接近于Taq DNA聚合酶的最

31、適反應(yīng)溫度75.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)門aqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20-85.延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,TaqDNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長(zhǎng)的DNA。延伸時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加.但對(duì)很低濃度的目的序列,則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物,這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后,循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會(huì)使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25

32、-30輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中TaqDNA聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增, 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增,這樣經(jīng)60輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010 。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:CC0 (1+P)n。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA量, P為增效率, n為循環(huán)次數(shù)。在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)

33、，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。三、PCR產(chǎn)物的克隆在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時(shí),所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。1.平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。2. 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制

34、酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。3.粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生

35、粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑一、材料不同來源的模板DNA。二、設(shè)備移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴(kuò)增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺(tái)式高速離心機(jī)。三、試劑：1、10×PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25下, pH9.0, 1.0 TritonX-100。2、MgCl2 ：25mmol/L。3、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。4、TaqDNA聚合酶5U/l。5、T4 D

36、NA連接酶及連接緩沖液：配方見第五章。6、經(jīng)Sma酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。7、其它試劑：礦物油（石蠟油），1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無水乙醇和70 乙醇。第三節(jié)操作步驟一、PCR反應(yīng)1. 依次混勻下列試劑35l H2 O5l 10×PCR反應(yīng)緩沖液4l 25mmol/L MgCl2 4l 4種dNTP0.5l 上游引物（引物）0.5l下游引物（引物）0.5l 模板DNA(約1ng)混勻后離心5秒。2.將混合物在94下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數(shù)秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入TaqDNA聚合酶（0.5l約2.5U），混勻后稍離心,加入一

37、滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。3. 用94變性1分鐘，45退火1分鐘,72延伸2分鐘, 循環(huán)35輪,進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。二、電泳按第二章所述,取10l擴(kuò)增產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。三、PCR產(chǎn)物的純化擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。（一）酚/氯仿法1.取反應(yīng)產(chǎn)物加100l TE.。2.加等體積氯仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中.這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。3.再用酚:氯仿:異戊醇抽

38、提二次,每次回收上層水相。4.在水相中加300l95乙醇,置-20下30min沉淀。5.在小離心機(jī)上10000rpm離心10min,吸凈上清液。加入1ml70乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。（二）Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測(cè)序、標(biāo)記、克隆等。該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50ml Wizard PCR DNA純化樹脂5ml直接提取緩沖液50支 Wizard微型柱1、吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5m

39、l eppendorf管中。2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。3、加1ml PCR DNA純化樹脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。4、取一次性注射器,取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。5、將注射器與微型柱分開,取出注塞,再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 80%異丙醇，對(duì)微型柱進(jìn)行清洗。6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。7、將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50lTE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。8、丟棄微型柱，eppendorf管中的溶

40、液即為純化DNA，存放于4或-20。注意1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。2、PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會(huì)影響提取DNA的 產(chǎn)量。四、載體加dT尾1.將1g pUC19用Sma全酶切。2.在小管中按上述PCR反應(yīng),加入各種混合物,除將4l 4種dNTP改為4l 25mMdTTP。3.加入1l(5U)的Taq DNA聚合酶在72下加熱2h。4.按前面三中所述,用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。5.加入2倍體積 95乙醇,在-20下沉淀1hr。6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接1、在7ml PCR產(chǎn)物中加1ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。

41、2、加1mlT4DNA連接酶，1ml 10×連接緩中液，混勻，16連接過夜。3、取5ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接1.在50ml的PCR產(chǎn)物中,直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混勻。2. 37反應(yīng)10分鐘后,70滅活10分鐘。3.用酚:氯仿抽提2次。4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。5. 質(zhì)粒用Smal 切開后，7015分鐘滅活酶，取1ml （約0.1mg）加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1ml ，連接緩沖液1ml 。6. 取5ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。注意

42、1.PCR非常靈敏, 操作應(yīng)盡可能在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行。2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌,每次吸頭用畢應(yīng)更換, 不要互相污染試劑。3.加試劑前, 應(yīng)短促離心10秒鐘, 然后再打開管蓋,以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4.應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對(duì)照。第九章 分子雜交技術(shù)互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對(duì)形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子DNA分子的過程稱為雜交。雜交過程是高度特異性的,可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。雜交的雙方是所使用探針和要檢測(cè)的核酸。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA,也可以是細(xì)胞總DNA或總RNA。根據(jù)使用的方法被檢測(cè)的核酸可以是

43、提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交,即細(xì)胞原位雜交。探針必須經(jīng)過標(biāo)記，以便示蹤和檢測(cè)。使用最普遍的探針標(biāo)記物是同位素,但由于同位素的安全性，近年來發(fā)展了許多非同位素標(biāo)記探針的方法。核酸分子雜交具有很高的靈敏度和高度的特異性,因而該技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域中已廣泛地使用于克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和疾病的診斷等方面。因而它不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用,而且在臨床診斷上的應(yīng)用也日趨增多。第一節(jié) 核酸探針標(biāo)記的方法核酸探針根據(jù)核酸的性質(zhì)，可分為DNA和RNA探針;根據(jù)是否使用放射性標(biāo)記物的與否,可分為放射性標(biāo)記探針和非放射性標(biāo)記探針;根據(jù)是否存在互補(bǔ)鏈,可分為單

44、鏈和雙鏈探針;根據(jù)放射性標(biāo)記物摻入情況,可分為均勻標(biāo)記和末端標(biāo)記探針。下面將介紹各種類型的探針及標(biāo)記方法。一、雙鏈DNA探針及其標(biāo)記方法分子生物研究中，最常用的探針即為雙鏈DNA探針，它廣泛應(yīng)用于基因的鑒定、臨床診斷等方面。雙鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種:切口平移法和隨機(jī)引物合成法。1. 切口平移法(nick translation)當(dāng)雙鏈DNA分子的一條鏈上產(chǎn)生切口時(shí),E.coliDNA聚合酶就可將核苷酸連接到切口的3'羥基末端。同時(shí)該酶具有從5'3'的核酸外切酶活性,能從切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時(shí)又在切口的3'端補(bǔ)上核苷酸

45、,從而使切口沿著DNA鏈移動(dòng),用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素?fù)饺氲胶铣尚骆溨?。最合適的切口平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。切口平移反應(yīng)受幾種因素的影響:產(chǎn)物的比活性取決于-32PdNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度。DNA酶的用量和E.coli DNA聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性,故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的DNA。材料： 待標(biāo)記的DNA。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)10×切口平移緩沖液:0.5mol/L Tris·Cl (pH7.2); 0.1mol/L MgSO4 ; 10mm

46、ol/L DTT;100g/ml BSA。(2)未標(biāo)記的dNTP原液:除同位素標(biāo)記的脫氧三磷酸核苷酸外,其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)溶液中,濃度為0.3mmol/L。(3)-32 P dCTP或-32 PdATP:400 Ci/mmol,10Ci/l。(4) E.coli DNA聚合酶(4單位/ l):溶于50 g/ml BSA, 1mmol/L DTT,50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。(5)DNA酶:1mg/ml。EDTA :200mmol/L (pH8.0)。(7)10mol/L NH4Ac。操作步驟:(

47、1) 按下列配比混合:未標(biāo)記的dNTP 10l 10×切口平移緩沖液 5l待標(biāo)記的DNA 1g-32 PdCTP或dATP(70Ci) 7l E.coli DNA聚合酶 4單位DAN酶 I 1l加水至終體積 50l(2)置于15水浴60分鐘。(3) 加入5l EDTA終止反應(yīng)。(4) 反應(yīng)液中加入醋酸銨,使終濃度為0.5mol/L,加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。注意 1、3H，32P及35S標(biāo)記的dNTP都可使用于探針標(biāo)記，但通常使用-32P-dNTP。2、DNA酶的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶活性高，則所得探針比活性高，但長(zhǎng)度比較短。2. 隨機(jī)引物合成

48、法隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探針。合成產(chǎn)物的大小、產(chǎn)量、比活性依賴于反應(yīng)中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600個(gè)核苷酸。利用隨機(jī)引物進(jìn)行反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)是：(1)Klenow片段沒有5'3'外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定,可以獲得大量的有效探針。(2)反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格,用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進(jìn)行反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物的比活性較高,可達(dá)4×109cpm/g探針。(4)隨機(jī)引物反應(yīng)還可以在低熔點(diǎn)瓊脂糖中直接進(jìn)行。材料：待標(biāo)記的DNA片段。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1

49、)隨機(jī)引物（隨機(jī)六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。(2)10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6);10mmol/L MgCl2。(3)Klenow片段。(4)20mmol/LDTT。(5)未標(biāo)記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。-32 P dATP：比活性>3000Ci/mmol, 10Ci/l。(7)緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl （pH7.5）; 50mmol/L NaCl; 5mmol/L EDTA（pH8.0）; 0.5% SDS。操作步驟:(1)200ng雙鏈DNA(1l)和7.5ng隨

50、機(jī)引物(1l)混合后置于eppendorf管內(nèi),水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘。(2)與此同時(shí),盡快在一置于冰浴中的0.5ml eppendorf管內(nèi)混合下列化合物:20mmol/L DTT 1l未標(biāo)記的dNTP溶液 1l10×隨機(jī)標(biāo)記緩沖液 1l-32 PdATP(比活性>3000Ci/mmol; 10Ci/l) 3l ddH2O 1l(3)將步驟(1)eppendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。(4) 加入5單位(約1l) Klenow片段,充分混合,在微型離心機(jī)中以12000g離心1-2秒, 使所有溶液沉于試管底部,在室溫下保溫3-16小時(shí)。(5)在反應(yīng)液中加

51、入10l緩沖液A后,將放射性標(biāo)記的探針保存在-20下備用。同時(shí)計(jì)算放射比活性。注意1、引物與模板的比例應(yīng)仔細(xì)調(diào)整，當(dāng)引物高于模板時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物比較短，但產(chǎn)物的累積較多；反之，則可獲得較長(zhǎng)片段的探針。2、模板DNA應(yīng)是線性的，如為超螺旋DNA，則標(biāo)記效率不足50%。二、單鏈DNA探針用雙鏈探針雜交檢測(cè)另一個(gè)遠(yuǎn)緣DNA時(shí),探針序列與被檢測(cè)序列間有很多錯(cuò)配。而兩條探針互補(bǔ)鏈之間的配對(duì)卻十分穩(wěn)定,即形成自身的無效雜交,結(jié)果使檢測(cè)效率下降。采用單鏈探針則可解決這一問題。單鏈DNA探針的合成方法主要有下列兩種1) 以M13載體衍生序列為模板,用Klenow片段合成單鏈探針; (2) 以RNA為模板, 用反轉(zhuǎn)

52、錄酶合成單鏈cDNA探針。1.從M13載體衍生序列合成單鏈DNA探針 合成單鏈DNA探針可將模板序列克隆到噬?；騇13噬菌體載體中,以此為模板,以特定的通用引物或以人工合成的寡合苷酸為引物,在a-32P-dNTP的存在下,由Klenow片段作用合成放射標(biāo)記探針，反應(yīng)完畢后得到部分雙鏈分子。在克隆序列內(nèi)或下游用限制性內(nèi)切酶切割這些長(zhǎng)短不一的產(chǎn)物,然后通過變性凝膠電泳(如變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)將探針與模板分離開。雙鏈RF型M13DNA也可用于單鏈DNA的制備,選用適當(dāng)?shù)囊锛纯芍苽湔溁蜇?fù)鏈單鏈探針。材料：已制備好的單鏈DNA模板（方法參見第十章中有關(guān)內(nèi)容）。設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。

53、試劑：(1)10×Klenow緩沖液：0.5mol/L NaCl, 0.1mol/LTris·Cl(pH7.5); 0.1mol/L MgCl2。(2)0.1mol/L DTT溶液。(3) -32 PdATP：3000Ci/mmol, 10Ci/l。(4)40mmol/L和20mmol/L的未標(biāo)記的dNTP溶液。(5)dCTP,dTTP,dGTP各20mmol/L的溶液。Klenow片段（5單位/ml）。(7)適宜的限制酶，如EcoR、Hind等。0.5mol/L EDTA （pH8.0）。操作步驟：(1)在0.5ml eppendorf管中混合如下溶液：?jiǎn)捂溎０澹s0.5

54、pmol） 1mg適當(dāng)引物 5pmol10×Klenow緩沖液 3ml加水至 20ml(2)將eppendorf管加熱到85 5分鐘，在30分鐘內(nèi)，使小離心管降到37；(3)依次加入：DTT 2mla-32PdATP 5ml未標(biāo)記的dATP 1mldGTP,dCTP,dTTP混合液 1ml混合均勻后，稍離心使之沉于試管底部。(4)加1ml（5單位）Klenow酶室溫下30分鐘。(5)加1ml20mmol/L未標(biāo)記的dATP溶液20分鐘。68加熱10分鐘，使Klenow片段失活。調(diào)整NaCl濃度，使之適宜于酶切。(7)加入20單位限制性內(nèi)切酶（如EcoR,Hind等）酶切1小時(shí)。酚/氯

55、仿抽提DNA，乙醇沉淀以去除dNTP或加0.5mol/L EDTA(pH8.0)至終濃度10mmol/L。(9)用電泳方法分離放射性標(biāo)記的探針。2. 從RNA合成單鏈cDNA探針cDNA單鏈探針主要用來分離cDNA文庫(kù)中相應(yīng)的基因。用RNA為模板合成cDNA探針?biāo)玫囊镉袃煞N:(1)用寡聚dT為引物合成cDNA探針。本方法只能用于帶Poly(A)的mRNA,并且產(chǎn)生的探針極大多數(shù)偏向于mRNA 3'末端序列。(2)可用隨機(jī)引物合成cDNA探針。該法可避免上述缺點(diǎn),產(chǎn)生比活性較高的探針。但由于模板RNA中通常含有多種不同的RNA分子,所得探針的序列往往比以克隆DNA為模板所得的探針復(fù)雜

56、得多,應(yīng)預(yù)先盡量富集mRNA中的目的序列。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物RNA/DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后,RNA單鏈可被迅速地降解成小片段,經(jīng)SephadexG-50柱層析即可得到單鏈探針。 材料：已提純的RNA或mRNA設(shè)備：高速臺(tái)式離心機(jī)，恒溫水浴鍋等。試劑：(1)合適的引物：隨機(jī)引物或oligo(dT)15-18。(2)5mmol/L dGTP, dATP dCTP, dTTP。(3) a-32PdCTP(>3000Ci/mmol, 10mCi/ml)。(4)反轉(zhuǎn)錄酶(200000單位/ml)。(5)100mmol/L DTT。250mmol/L MgCl2。(7)1mol/LKCl。0.5mo

57、l/L EDTA (pH8.0)。(9)10% SDS。(10)RNasin(40單位/ml)。操作步驟:(1)在已置于冰浴中的滅菌離心管中加入下列試劑：RNA或mRNA 10.0ml合適的產(chǎn)物(1mg/ml) 10.0ml1mol/L Tris·Cl(pH7.6) 2.5ml1mol/L KCl 3.5ml 250mmol/L MgCl2 2.0ml5mmol/L dNTP 10.0mla-32PdCTP 10.0ml0.1mol/L DTT 2.0mlRnasin 20U加水至 48ml反轉(zhuǎn)錄酶(200000單位/ml) 2ml混勻后,稍稍離心，37保溫2小時(shí)。(2) 反應(yīng)完畢后加入下列試劑： 0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2ml 10% SDS 2ml(3) 加入3ml3mol/L NaOH。68保溫30分鐘以水解RNA。(4) 冷卻至室溫后, 加入10ml 1mol/L Tris·Cl(pH7.4)。混勻。然后加入