酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 楊恩原實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 觀察底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響2. 觀察抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響3. 掌握用雙倒數(shù)作圖法測(cè)定堿性磷酸酶的Km值實(shí)驗(yàn)原理：一、 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶的催化作用有很大的影響。在一般情況下，當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，酶促反應(yīng)的速度(v)隨底物濃度S的增加而迅速增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，反應(yīng)速度的增加率就比較小，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值(即最大速度Vmax)。底物濃度和反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用米氏方程式來(lái)表示(Michaelis-Menten方程)即： 式

2、中Vmax為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，S為底物濃度當(dāng)v=Vmax/2時(shí)，則Km=S，Km是酶的特征性常數(shù)，測(cè)定Km是研究酶的一種重要方法。但是在一般情況下，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成的是直角雙曲線，難以準(zhǔn)確求得Km和Vmax。若將米氏方程變形為雙倒數(shù)方程(Lineweaver-Burk方程)，則此方程為直角方程，即:以1/V和1/S分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)。將各點(diǎn)連線，在橫軸截距為-1/Km，據(jù)此可算出Km值。本實(shí)驗(yàn)以堿性磷酸酶為例，測(cè)定不同濃度底物時(shí)的酶活性，再根據(jù)1/v和1/S的倒數(shù)作圖，計(jì)算出其Km值。二、 抑制劑對(duì)酶促反映的影響凡能降低酶的活性，甚至使酶完全喪失活性的物質(zhì)，成為酶的抑制劑。酶的

3、特異性抑制劑大致上分為可逆性和不可逆性兩類?？赡嫘砸种朴挚煞譃楦?jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制等。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用特點(diǎn)是使該酶的Km值增大，但對(duì)酶促反映的最大速度Vmax值無(wú)影響。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的作用特點(diǎn)是不影響S與酶的結(jié)合，故其Km值不變，然而卻能降低其最大速度Vmax。本實(shí)驗(yàn)選取Na2HPO4作為堿性磷酸酶的抑制物，確定其抑制作用屬于哪種類型。實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)一:底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響試劑管號(hào)1. 取試管9支，將0.01mol/L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度：試劑管號(hào)2. 另取9支試管編號(hào)，做酶促反應(yīng)：3. 混勻，37 水浴保溫5分鐘左右。4. 加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37 準(zhǔn)確保溫15

4、分鐘。5. 保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反應(yīng)。各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 鐵氰化鉀 2.0 ml。6. 充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm處比色。讀取各管吸光度，做記錄。(酶活性計(jì)算及Km值計(jì)算)實(shí)驗(yàn)計(jì)算：1. 在37C下保溫15分鐘產(chǎn)生1mg酚為1個(gè)酶活性單位，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出釋放的酚量（ug），以此計(jì)算處各管的酶活性（v）。2. 以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，求出酶的Km值。Y=0.0581X+0.0242, Km=2.401實(shí)驗(yàn)二:抑制劑對(duì)酶促反映的影響試劑管號(hào)1. 取試管9支，

5、將0.01mol/L基質(zhì)液稀釋成下列不同濃度：試劑管號(hào)2. 另取試管9支，做酶促反應(yīng)：3. 混勻，37 水浴保溫5分鐘左右。4. 加入酶液后立即計(jì)時(shí)，各管混勻后在37 準(zhǔn)確保溫15分鐘。5. 保溫結(jié)束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反應(yīng)。各管分別加入0.3% 4-氨基安替比林1.0 ml及0.5 鐵氰化鉀 2.0 ml。6. 充分混勻，放置10分鐘，以管1為對(duì)照，于波長(zhǎng)510 nm處比色。讀取各管吸光度，并計(jì)算各管酶活性。實(shí)驗(yàn)計(jì)算：以酶活性單位(v)的倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，以底物濃度S的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，在方格紙上描點(diǎn)，并連接各點(diǎn)，求該酶的Km值并與前面未加入抑制劑時(shí)

6、測(cè)出的Km值作比較。Y=0.0832X+0.024, Km=3.47實(shí)驗(yàn)分析：通過(guò)繪圖及分別計(jì)算無(wú)抑制劑與有抑制劑時(shí)酶的Km值，可發(fā)現(xiàn)，此抑制劑為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。通過(guò)繪圖發(fā)現(xiàn)，其兩條以1/v為縱坐標(biāo)、1/S為橫坐標(biāo)的直線截距幾乎相同，而加入抑制劑后，酶的Km值更大，此為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的特征：Vmax不變，Km變大。思考題一、 除了雙倒數(shù)作圖外，你能舉出其它能將酶動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)做出直線圖的方法嗎？1. 海涅斯-沃爾弗作圖法（Hanes-Wolff plot）雙倒數(shù)方程式兩邊同時(shí)乘以S直線的斜率等于1/Vmax，橫軸截距為-Km2. 伊迪-霍夫斯蒂作圖法（Eadie-Hofstee plot）米氏方程式兩邊均除以S直線的斜率為-Km，直線的縱軸截距為Vmax二、 為什么進(jìn)行此種酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定時(shí)，所用各底物濃度不是按等差遞增？在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)速率V對(duì)底物濃度S作圖呈矩形雙曲線。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，反應(yīng)速率與底物濃度成正比，反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)；隨著底物濃度的增高，反應(yīng)速率不再成正比例加速，反應(yīng)為混合級(jí)反應(yīng)；當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度，酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率，反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。三、 酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中，哪些因素需嚴(yán)格控制？1. 配制的各種試劑及反應(yīng)液必須混勻。2. 加酶液要準(zhǔn)確快速