第十章 有機高分子

1、第十章第十章 有機高分子基質(zhì)的高效有機高分子基質(zhì)的高效 液相色譜分離柱填料液相色譜分離柱填料韶關(guān)學(xué)院生物科學(xué)系HPLC是現(xiàn)在生物分離分析的重要手段，具有分離效率高、選擇性好、適應(yīng)面廣（對被分離物質(zhì)大小、含量、性質(zhì)和操作方法）、產(chǎn)品純度高和重復(fù)性好等特點。HPLC的核心是在于分離柱填料。HPLC的分類按分離機理：基于吸附分配的反/正相及疏水色譜，基于電荷作用的離子交換、基于空間排阻的凝膠層析/凝膠滲透，基于生物特異作用的親和色譜等。按填料性質(zhì)分：有機和無機填料色譜。有機填料的優(yōu)越性： 以多糖和有機基質(zhì)骨架，易于改性。 理化穩(wěn)定性好，耐酸、堿和溶劑，反復(fù)使用。 生物相容性好，非特異吸附少。 高負載

2、，高容量。非常適合生物活性分子，有機高分子的剛性普遍不如無機填料，淋洗過程會膨脹或皺縮。第二節(jié)第二節(jié) 有機高分子類型有機高分子類型HPLCHPLC填料的結(jié)構(gòu)特性填料的結(jié)構(gòu)特性一、填料的物理結(jié)構(gòu)填料的色譜動力學(xué)受粒度及粒度分布、孔徑與孔徑分布、粒度強度和表官形態(tài)等影響。色譜對填料在物理性質(zhì)上的要求： 合適的粒度大小和狹窄的粒度分布范圍，能單分散最好。 剛性好，一定的顆粒強度，滿足高速高壓操作要求。若為多孔結(jié)構(gòu)填料，除達到孔徑大小和分布外，盡量避免形態(tài)復(fù)雜的微孔結(jié)構(gòu)。使用時填料融脹/收縮不能超出規(guī)定用允許范圍。常用HPLC填料按物理形態(tài)可分為：1、多孔型 又分小孔30nm; 超大孔100nm。2、

3、非多孔型 整體顆粒無孔。3、薄殼型 內(nèi)部無孔，表面層為多孔結(jié)構(gòu)。實踐上以高負載量的多孔型最常用，特別是大孔和超大孔gel。顆粒大小也各不一樣，工業(yè)化生產(chǎn)中使用大粒度填料便于操作。上世紀80年代以來，填料研究在一些方面取得了可喜的進步：顆粒單分散填料具貫穿性超大孔結(jié)構(gòu)填料 如貫流色譜填料顆粒含600-800nm貫穿孔，貫穿孔內(nèi)連接80-150nm的擴散孔。小顆粒非多孔填料 避免了非特異性吸附，效率高時間短。二、填料的化學(xué)結(jié)構(gòu)色譜的化學(xué)熱力學(xué)行為決定于其填料化學(xué)結(jié)構(gòu)（特別是顆粒外表面和內(nèi)孔表面化學(xué)結(jié)構(gòu)）。既要有選擇性分離的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又要良好的化學(xué)和熱穩(wěn)定性以及極低的非特異性吸附。HPLC填料按結(jié)構(gòu)

4、分為：1、離子交換色譜填料 顆粒表面帶某種電荷的可交換基團。2、反相色譜填料 顆粒表面含C8、C18烷基/苯基強疏水基團/鏈段。3、正相色譜填料 顆粒表面含羥基、氨基、羧基醚鏈等極性基團/鏈段。4、疏水相互作用色譜填料 顆粒表面含C1、C4烷基、笨基、PEG等弱疏水基團/鏈段。5、空間排除色譜填料 有親水和親油2類，用于水相體系的含羥基的親水基團；非水相的含疏水基團。6、親和色譜填料 顆粒表面帶特異性配基。對基質(zhì)材料經(jīng)過化學(xué)修飾，才能制備成合適的色譜填料，滿足不同色譜技術(shù)的需要。有機高分子類型有機高分子類型HPLCHPLC填料的基質(zhì)樹脂填料的基質(zhì)樹脂基質(zhì)材料/載體 是色譜填料的支撐骨架，決定填

5、料的顆粒大小與分布、顆粒強度、孔徑大小與分布、孔的結(jié)構(gòu)形態(tài)、顆粒內(nèi)部的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其穩(wěn)定性等，也影響對顆粒表面的化學(xué)修飾的實施。常見有機高分子類型填料的基質(zhì)樹脂可分為：多糖型 天然多糖原料用物理方法加工成微珠并交聯(lián)成凝膠。聚合物型 將合成單體/交聯(lián)劑用化學(xué)聚合成交聯(lián)高聚物微球。一、多糖型基質(zhì)材料親水性樹脂無須改性可直接用于凝膠過濾色譜1、葡聚糖系凝膠 由葡聚糖和環(huán)氧氯丙烷偶聯(lián)制成。早期的軟凝膠系列Sephadex G-x，強度低，粒度分布寬，改進型有高交聯(lián)羥丙基化葡聚糖 Sephasorb HP Uitrafine 以及烯丙基葡聚糖和甲叉雙丙烯酰氨交聯(lián)共聚凝膠 Sephacryl系列，剛性好，柱

6、壓低適合高流速色譜。2、瓊脂糖系凝膠 傳統(tǒng)的Sepharose，Bio-gel A，Ultragel A軟膠系列。改進型Sepharose CL系列， Sepharose Fast Flow， Sepharose High Performance等。二、聚合物型基質(zhì)材料 比多糖型凝膠的機械強度大，化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，更適合于高速高壓的HPLC操作。按結(jié)構(gòu)形態(tài)分為多空型和非多空型；按性能分有親水及疏水凝膠。1、交聯(lián)聚苯乙烯樹脂 苯乙烯與二乙烯基苯的交聯(lián)共聚物微球，Rohmhaas 的AmberliterXAD系列、Hamilton Co. 的PRP-1、 Hitachi gel 3010、3011系

7、列等。具顆粒小而均勻，單分散，貫穿性超大孔的特性。 不改性的這類樹脂也可用于色譜操作。2、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂以甲基丙烯酸的甲酯、丁酯、羥基乙酯、環(huán)氧丙酯等為原料為單體制備的多型高聯(lián)高聚物微球。Spheron、 Shodex OH pak、Hitachi Gel 3020等系列凝膠，具有 良好的親水性和剛性。3、其他類型樹脂TSK gel PW from Toyosoda co.Toyopearl 系列Asahipad GS系列顆粒剛性好，粒度分布范圍窄。一、填料物化性質(zhì)的表征顆粒大小dp（m）與分布 用顯微鏡觀察或粒度分布儀測定。填料比表面積S（m2/g） BET方法測定。BET是三位科

8、學(xué)家（Brunauer、Emmett和Teller）的首字母縮寫，三位科學(xué)家從經(jīng)典統(tǒng)計理論推導(dǎo)出的多分子層吸附公式基礎(chǔ)上，即著名的BET方程，成為了顆粒表面吸附科學(xué)的理論基礎(chǔ)，簡單說就是從BET公式可以計算樣品的單層吸附量Vm，再由相關(guān)公式算出樣品的比表面積。 填料骨架密度g(g/ml)、溶劑吸收量Sr(ml/g)、溶脹因子 f 等參數(shù)，可用中科院施良和的方法測定。填料的比孔體積Vp(ml/g)，可據(jù)Sr、f、g值按公式計算。 Sr=fVp+ （f-1）/ g填料孔度的計算 Vp = Vp +1/g填料孔徑大小與分布測定：毛細管聚凝聚法、壓汞法及電經(jīng)法?？椎慕Y(jié)構(gòu)形態(tài)可以掃描電鏡直接觀察，也可行

9、色譜分析或其他性質(zhì)測量。填料化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、pH適應(yīng)交換容量等用其他常規(guī)方法測定。二、填料色譜性能的表征不同色譜方法各有其特定的性能指標，但又包括一些共同的基本參數(shù)。1、保留值 tR指樣品在填充柱中的滯留時間；若以體積表示即為保留體積。 VR= tRFc 為Fc流動相流速。 扣除不保留物質(zhì)的流出時間（死時間 t0），得到調(diào)整保留值： tR = tR t0 ； VR= VR t0Fc tR tR k = - 1 = t0 t0k即容量因子 ，與固定相流動相性質(zhì)和柱溫有關(guān)。2、選擇性a表示相鄰二物質(zhì)保留時間的比值 tR2 1+ k2 a = = tR1 1+ k1a與固相種類、 流動相組成及溫度有

10、關(guān)。3、柱效率以理論踏板數(shù)（N）表示 N=5.54（Tr/2t1/2） t1/2 為色譜峰的半高寬。用理論踏板高度表示的柱效為 H = L / N4、填充柱的總孔隙度和穿透性5、分離度R是相鄰2色譜峰的保留值之差與各自底峰寬（tW1和tW2）一半之和的比值。是色譜柱分離效能的綜合指標。第五節(jié)第五節(jié) 有機高分子類型的反相有機高分子類型的反相HPLCHPLC填料填料 反相色譜（RPC）是HPLC的分支，目前仍然使用硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主的填充材料的色譜柱。其特點是顆粒剛性好利于傳質(zhì)柱效高選擇性好pH適應(yīng)范圍2-8之間，不如其他有機填料基質(zhì)表面的硅羥基可能使蛋白樣品失活。保留機理還不清楚，有的認為

11、是分配作用，有的說是吸附作用。 微球形交聯(lián)聚苯乙烯樹脂，是高分子基質(zhì)的RPC填料，可在廣泛的pH1-212-14范圍使用，樹脂表面有較強的疏水作用。多孔填料應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)大小選擇合適孔徑的填料，除多孔型填料外，非多孔型填料也在RPC中 得到推廣使用。 非多孔型填料的特點：粒度小、剛性好、柱效高、分辨率高，特別適合少量和微量樣品的分析與分離。教材P194列出了部分RPC填料的參數(shù)與特性。利用樣品與固相表面基團之間電荷的相互作用達到分離目的。表現(xiàn)為離子離子、偶極與離子間或著其他動態(tài)平衡的作用力，有4種交換方式。已非常廣泛地應(yīng)用于分析檢測和分離純化的操作手段。特點：pH適應(yīng)廣、使用壽命長、大容量、

12、低非特異性吸附一、多糖基質(zhì)的IEC層析介質(zhì)基質(zhì)骨架為葡聚糖、瓊脂糖或釬維素構(gòu)成，有良好的親水性和生物相容性，容量大，價格低。隨著制備技術(shù)發(fā)展，一些顆粒強度和均勻性更好的高度聯(lián)多糖類凝膠不斷涌現(xiàn)，在保持原有類型介質(zhì)優(yōu)點的同時，也能在適當壓力和較高流速下操作。教材P197表10-2列出了部分多糖基質(zhì)IEC介質(zhì)的特性。二、聚合物基質(zhì)的高效IEC填料常見的有以交聯(lián)共聚的苯乙烯-二乙烯為基質(zhì)或其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)填料。按所帶基團分為：強堿性陰離子型（含季胺鹽）弱堿性陰離子型（伯、仲氨基）、強酸性陽離子型（磺酸基）、 弱酸性陽離子型（羧基），具體參見教材P198表10-3的內(nèi)容。1、多孔樹脂的IEC填料以多

13、孔交聯(lián)聚苯乙烯微球為基質(zhì)，代表了今年來高效IEC填料新的發(fā)展水平。在柱效、分離度、負載量和回收率等方面性能卓越。Mono Beads、SOURCE、POROS三類系列產(chǎn)品。大孔親水性高聚物羥基化聚醚凝膠為基質(zhì)的IEC填料，目前應(yīng)用也很廣，是在原有親水凝膠過濾色譜填料的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。如TSK gel DEAE-5pw、SP-5PW、CM-5PW等。粒度小、大孔徑、中等交換容量。以親水性大孔交聯(lián)聚甲基丙烯酸羥基乙酯微球為基質(zhì)的IEC填料，也占有重要地位。2、非多孔樹脂的IEC填料主要包括親水性 高聚物即羥基化聚醚、交聯(lián)聚苯乙烯、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯及交聯(lián)瓊脂糖等。表面結(jié)構(gòu)與多孔性型產(chǎn)品類似。粒度

14、?。◣孜⒚祝?，顆粒均勻、剛性好、穿透力強、流速適應(yīng)范圍廣、低負載量、避免溶質(zhì)在固相內(nèi)部的吸附與擴散。如 TSK gel DEAE-NPR、SP-NPR等。對改善柱效、提高分離回收率、保持大分子生物活性非常有利。但對分子量小于1000的小肽混合物，效果不令人滿意。用于分離寡核苷酸效果很好，常用于核酸合成的的處理。IEC在快速分離分析和微量樣品分離檢測與制備中有廣闊的前景。3、薄殼型樹脂的PEC填料在HPLC發(fā)展初期時比價盛行，一定程度上堅固了多孔和非多孔填料的部分優(yōu)點，現(xiàn)在逐漸被多孔和非多孔填料代替了。三、高聚物型離子色譜填料離子色譜產(chǎn)生于上世紀70年代中期，依賴高靈敏的電導(dǎo)檢測器、高柱效低交換

15、容量分離柱填料及消除淋洗背景離子干擾技術(shù)的進步。能夠快速靈敏低測定各種痕量的陰陽離子型物質(zhì)。常見的IC有單柱系統(tǒng)和雙柱系統(tǒng)2類。單柱系統(tǒng)將分離柱直接與檢測器連接；雙柱系統(tǒng)在分離柱與檢測器之間連接有消除本底電導(dǎo)信號的抑制系統(tǒng)。雙柱系統(tǒng)填料如Dionex的AS系列（陰離子分析柱）和CS系列（陽離子分析柱），均是以交聯(lián)聚苯乙烯為基質(zhì)的具有薄殼結(jié)構(gòu)的離子 交換劑。單柱系統(tǒng)填料為低交換容量的多孔性離子交換劑，如 TSKgel IC-Anion-PW ，TSK gel-IC-Cation-PW。IC成功解決了痕量陰/陽離子型物質(zhì)的分析檢測難題。疏水性相互作用色譜（hydrophobic interacti

16、on chromatography, HIC）指采用適度疏水性的固定相指采用適度疏水性的固定相, , 以含鹽的水溶液作為流動相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）以含鹽的水溶液作為流動相分離生物大分子（如蛋白質(zhì)）鍵合相色譜方法。鍵合相色譜方法。為適應(yīng)生物活性大分子提取，特別是蛋白質(zhì)提取純化而發(fā)展起來的。原理原理：HIC依賴溶質(zhì)與填料表面間的弱疏水相互作用實現(xiàn)物質(zhì)分離純化。在高鹽離子活度溶液中，蛋白質(zhì)分子疏水部分與填料表面產(chǎn)生疏水性相互作用而被吸附，當淋洗液離子強度下降后，蛋白質(zhì)按疏水性特征被依次洗脫下來，疏水性越強，洗脫時間越長。特點：采用高鹽進樣，中性或接近中性的鹽水溶液洗脫, 樣品的生物活性高，蛋白

17、質(zhì)純度高，高回收率，成本低等。疏水色譜中無機鹽的作用與鹽析沉淀蛋白質(zhì)的作用十分相似?；蚪?jīng)親水性處理的有機高聚物有機高分子 類型HIC填料組成：通常以親水性凝膠微球為基質(zhì)，表面再經(jīng)過化學(xué)修飾引入疏水性基團/鏈段的的樹脂。填料材料的選擇：基質(zhì)可以是多糖，也可以是高聚物微球。擬選擇的基質(zhì)可以是多孔結(jié)構(gòu)（大孔/超大孔）或非多孔結(jié)構(gòu)，有機高聚物微球應(yīng)在連接官能團之前做疏水性處理。教材P206-7之表10-4列出了部分有機高分子HIC填料的特性。常見HIC填料的疏水基團的疏水性強弱，依官能團的不同而不同，一般地苯基辛基丁基異丙基醚鏈。同時，疏水基團的結(jié)構(gòu)和密度是影響生物樣品保留值和色譜柱負載量的主要因素。

18、多孔型和非多孔型結(jié)構(gòu)的HIC填料，幾十mg/ml樹脂，如Toyopearl 10-50mg/ml, Macrosphere gel 13-110mg/ml。洗脫方式：高鹽吸附，低鹽洗脫。常用硫酸胺 （與IEC比較？）產(chǎn)品檢測：光度檢測；電導(dǎo)檢測；生化檢測光度檢測；電導(dǎo)檢測；生化檢測圖 蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的分離比較蛋白質(zhì)在疏水柱和反相柱上的分離比較1 細胞色素細胞色素 C 2 肌紅蛋白肌紅蛋白 3 溶菌酶溶菌酶TSK 5PW硫酸銨從硫酸銨從1.7減少到減少到0.1mol/LRP-304乙腈從乙腈從0增增加到加到100%空間排阻色譜（size exclusion chromato- grap

19、hy,SEC）根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸根據(jù)溶質(zhì)分子尺寸(分子量、有效分子量、有效體積、流體力學(xué)體積體積、流體力學(xué)體積)的差別進行分離的。主要的差別進行分離的。主要應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測定，應(yīng)用于高分子化合物和聚合物的分子量分布測定，在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。在生物化學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。與液相色譜液相色譜根據(jù)樣品組分在固定相和流動相之間根據(jù)樣品組分在固定相和流動相之間的平衡分配系數(shù)差別，的平衡分配系數(shù)差別， 造成不同的移動速度而造成不同的移動速度而達到分離的機制不同。達到分離的機制不同。 SEC方法包括包括:1、凝膠過濾色譜、凝膠過濾色譜(GFC):,以水

20、為流動相以水為流動相2、凝膠滲透色譜、凝膠滲透色譜(GPC): 以有機溶劑為流動以有機溶劑為流動該方法能簡便迅速分離分離大小差異較大的組分。該方法能簡便迅速分離分離大小差異較大的組分。非常適合分析樣品組分分布情況，以及純化的最非常適合分析樣品組分分布情況，以及純化的最后脫鹽等操作。后脫鹽等操作。一、一、SEC填料的一般特性與色譜指標填料的一般特性與色譜指標填料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)必須與淋洗體系相匹配，不能填料的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)必須與淋洗體系相匹配，不能與試劑和溶質(zhì)分子發(fā)生任何基團間的的相互作用，與試劑和溶質(zhì)分子發(fā)生任何基團間的的相互作用，將盡可能避免非空間排阻效應(yīng)（吸附、離子交換、將盡可能避免非空間排阻效應(yīng)

21、（吸附、離子交換、分配層析）。物理結(jié)構(gòu)上粒度均勻，孔徑均勻而分配層析）。物理結(jié)構(gòu)上粒度均勻，孔徑均勻而分布窄，還需要光潔的表面，規(guī)整而通暢的孔結(jié)分布窄，還需要光潔的表面，規(guī)整而通暢的孔結(jié)構(gòu)形態(tài)，較大的孔度及適當?shù)目讖酱笮∨c分布。構(gòu)形態(tài)，較大的孔度及適當?shù)目讖酱笮∨c分布。SEC填料的色譜表征，除了柱效、選擇性、分離度、穿透性外，還需滿足下面的要求：1、排除極限表示填料可用來分離物質(zhì)大小的最大極限，超過該極限物質(zhì)就從填料顆粒間隙穿過而沒有分離效果。排除極限取決于填料的最大有效孔徑。2、分離范圍表示填料能物質(zhì)分子量的范圍，分子量高于或低于此范圍的物質(zhì)分別被排除或滲透而不能分離，它取決于有效孔徑的分布

22、范圍。3、固流相比指填料有效孔內(nèi)體積與填料顆粒間隙體積的比值，比值越大越好。反應(yīng)柱子的分離容量，緊密填充時，比值與填料孔度有關(guān)。二、凝膠滲透色譜填料凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC) 分離對象一般是酯溶性的物質(zhì)，相應(yīng)的填料是疏水性的，常用有機溶劑淋洗體系。影響色譜行為的主要因素是填料顆粒內(nèi)部高聚物超微結(jié)構(gòu)離子堆積的不均一性而使多孔骨架彎曲，產(chǎn)生阻礙的作用，所以致孔技術(shù)非常重要。高分子類型的GPC填料主要是交聯(lián)共聚苯乙烯-二乙烯苯多孔微球。按孔徑大小和致孔方式不同分結(jié)構(gòu)均勻填料 單純由交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)所決定的，孔徑均勻，透明狀。結(jié)構(gòu)半均勻的填料 用良溶劑

23、致孔而聚合的，半透明狀。結(jié)構(gòu)非均勻的填料用非良溶劑致孔而聚合的，聚合反應(yīng)一開始就產(chǎn)生相分離，形成由交聯(lián)聚合體小顆粒堆積而成的大孔，呈乳白色。很多這類填料以商業(yè)化，-Spherogel系列;Shodex GPC-A, -H,-KF系列;TSK gel-H,HXLX系列等三、凝膠過濾色譜填料凝膠過濾色譜(gel filtration chromatography,GFC)用水相淋洗體系，將物質(zhì)按分子大小分離。傳統(tǒng)GFC填料通常是軟膠，主要有葡聚糖凝膠；瓊脂糖凝膠；聚丙烯酰氨凝膠。其特點是粒度分布范圍寬；強度低；分離速度慢，不能承受較大壓力；親水性好；生物相容性好。1、多糖型GFC填料在傳統(tǒng)seph

24、adex、Sepharose基礎(chǔ)上發(fā)展出高交聯(lián)的多糖型填料。理化性能和指標有明顯改進與提高。具有良好的機械強度和化學(xué)穩(wěn)定性，粒度分范圍窄，可在適當壓力和較高流速下操作，能經(jīng)受酸堿清洗和廣泛pH的溶液。部分用于高效GFC填料，在FPLC，HPLC系統(tǒng)用于分析分離和半制備分離。部分多糖型填料及其特性見書P211-2，表10-5、6。 應(yīng)用應(yīng)用SephadexSephadex G-75 G-75純化的包涵體蛋白純化的包涵體蛋白2、高聚物型GFC填料以多孔高聚物微球為基質(zhì)。機械強度比多糖型更好，粒度分布更窄，甚至達到單分散水平；但親水性和生物相容性不及多糖型填料，通過改性能改善之。按類型分有帶親水基團

25、的多孔交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類樹脂交聯(lián)聚乙烯醇樹脂被親水化處理的交聯(lián)聚苯乙烯樹脂羥基化聚醚類親水性樹脂等。特點：粒度小而均勻；機械強度高；適宜的孔徑大小與分布；良好的親水性和化學(xué)穩(wěn)定性；交好的生物相容性等。部分高聚物型GFC填料特性見書P213表10-7親和色譜(affinity chromatography, AFC)利用生物分子間特異性相互作用的分離方法。專一性強。原則上講只要在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基，就可以建立一種親和色譜方法，用于分離與之配對的物質(zhì)。AFC的特點是高度專一性和選擇性，活性回收率高。有機高分子類型的AFC填料，按基質(zhì)材料分有：多糖型高聚物2類。按配體性能（填料

26、所帶配體對被分離物質(zhì)的選擇性）分有專用性通用性2類。專用性填料基于配體和被分離物質(zhì)（Ag-Ab,激素-受體）間的特異性作用，所以有很高的特異選擇性和親和力。通用性填料配體可與多種物質(zhì)結(jié)合，故選擇性不強，專一性不高。但配體比較廉價且容易獲取，在AFC色譜中仍居主導(dǎo)地位。常見的通用性親和配體有金屬螯合物配體小分子類配體：AA、肽、肝素等顏料類配體：Cibacron蘭、Procion紅等外源性凝聚素類配體：conA、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素等核酸與核苷酸累配體：AMP、PolyA、PolyU等。從親和配體連接方式看有兩種從親和配體連接方式看有兩種配體與基質(zhì)直接偶聯(lián)配體與基質(zhì)直接偶聯(lián)間間接偶聯(lián)接偶聯(lián)在配體與基質(zhì)間插入一適當長度的；鏈狀間