高級(jí)技能訓(xùn)練分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)江南大學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)與功能因子研究中心2009年09月目 錄實(shí)驗(yàn)一 總RNA的提取和純化1實(shí)驗(yàn)二 RNA的甲醛變性電泳3實(shí)驗(yàn)三 RTPCR5實(shí)驗(yàn)四 PCR基因擴(kuò)增7實(shí)驗(yàn)五 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA9實(shí)驗(yàn)一 總RNA的提取和純化【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹棵恳粋€(gè)真核細(xì)胞約含10-5g RNA。理論上每克細(xì)胞可分離出5-10mgRNA，其中80-85%是rRNA（主要是28S、18S和5SrRNA），10-15%tRNA和核內(nèi)小分子RNA，以及1-5%的mRNA。mRNA是一類分子量不均一的RNA，是分子生物學(xué)的主要研究對(duì)象之一。提取高純度完整的RNA，是研究基因表達(dá)、體外轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、R

2、T-PCR、Northern雜交的重要基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3´末端有polyA組成的尾，利用此特性，可以方便地用寡聚（dT）親和層析柱分離mRNA。本實(shí)驗(yàn)按照TRIzol法提取總RNA?？捎糜谌恕?dòng)植物、微生物總RNA的提取分離。TRIzol中含有RNase抑制劑異硫氰酸胍、-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉，可有效的抑制RNA降解，保持RNA的完整性；同時(shí)，增強(qiáng)了對(duì)核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA與蛋白分離，在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA選擇性地進(jìn)入無(wú)蛋白和DNA的水相中，容易被異丙醇沉淀。氯仿不但有一定的蛋白質(zhì)變性作用，而且能迅速使各相分離，使DNA

3、與其它成分分開(kāi)。異丙醇使RNA沉淀濃縮。1. 4取100 mg新鮮肝組織加1 ml TRizol（預(yù)冷）試劑，于冰浴中勻漿，后將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml 離心管中，冰浴10 min；2. 加入200l（或1/ 5體積）的氯仿，劇烈振蕩混合30 s， 12000 rpm 離心 15 min。離心管中液體分為3層：上層為水相，RNA在此相中，蛋白質(zhì)在下層黃色的有機(jī)相中，DNA保留在上下兩層的界面處的中間層中；3. 小心吸取上層水相約0.4ml 于新的塑料離心管中（切勿吸取中間層和下層液體）。加根據(jù)RNA提取量加約100 DEPC處理的水溶解沉淀，65水浴10min，立即置于冰上，得到所提取的RNA

4、溶液。如須保存，可加0.1體積的3M醋酸鈉（pH 5.2）和2.2倍體積的冰無(wú)水乙醇，充分混勻，于-70低溫保存?；蛴梅€(wěn)定的甲酰胺溶解（4mg/ml）, -20保存，用時(shí)，4倍乙醇沉淀，回收RNA。RNA純度、濃度測(cè)定及分子完整性的鑒定 RNA是否能用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，取決于它的純度和分子的完整性，常用的鑒定方法是測(cè)定樣品260 nm與280 nm的光吸收值以及電泳顯示RNA分子是否降解。1. 260 nm /280 nm光吸收比值取10µL 總RNA樣品，加1000µL DEPC處理過(guò)的水，混勻，測(cè)同一樣品在260nm和280nm光吸收值，以A260 / A280 的比值表示其

5、純度，比值在之間為純的RNA，比值低于1.8，說(shuō)明RNA樣品有蛋白質(zhì)或酚的污染，需要用氯仿重新抽提。2. RNA含量 RNA濃度（/ml ）= A260×40×（1/光徑）×稀釋倍數(shù) RNA得量（）=RNA濃度×最終RNA原液毫升數(shù) RNA濃度約1-5µg/µL為宜3. 電泳鑒定（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二）RNA樣品（約5-10）經(jīng)含甲醛的1.5 % 瓊脂糖凝膠變性電泳，電泳后在紫外光激發(fā)下，RNA分子會(huì)產(chǎn)生桔紅色熒光，如此可以觀察到28 S和18 S rRNA兩條帶是否清晰，若28 S的熒光強(qiáng)度為18 S的二倍以上，則說(shuō)明RNA分子沒(méi)有降解?！咀⒁?/p>

6、事項(xiàng)】創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNase的環(huán)境，盡量減少外源RNase及組織細(xì)胞內(nèi)源RNase對(duì)RNA的降解作用。1. 實(shí)驗(yàn)器具的預(yù)處理和配制試劑的注意點(diǎn)（1）金屬、玻璃器皿：通常的高壓消毒方法不能充分使RNase失活，必須將清洗烘干的玻璃器皿等，用鋁鉑包裝好，（15磅）高溫高壓20 min后，烘干使用；DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性，也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性，DEPC與氨水溶液混合會(huì)產(chǎn)生致癌物,因而使用時(shí)需小心。DEPC水經(jīng)處理，可分解為CO2而無(wú)害。（3）所有試劑、器具應(yīng)新包裝并專用。（4）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境潔凈，避免飛塵及攜帶微生物RNase污染

7、；為防止操做者手上、唾液的RNase對(duì)樣品和試劑污染，實(shí)驗(yàn)中要戴一次性手套和一次性口罩，并經(jīng)常更換手套；2. 特異性RNase抑制劑的應(yīng)用（1）氧釩酰核苷復(fù)合物（Vanadyl-ribonuCleoside Complexes，VRC）它是一種由氧化釩離子和四種核苷（腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷和胞苷）組成的復(fù)合物，可與RNase結(jié)合而抑制RNase的活性。常用濃度為10 m mol；（2）RNasin：為RNase的非競(jìng)爭(zhēng)、特異抑制劑，1mmol/L二巰基乙醇益于其發(fā)揮最大抑制活性。反復(fù)凍融易破壞其活性。樣品中的VRC和RNasin都可用酚抽提方法去除。3. 組織塊用液氮研磨，效果最好；若沒(méi)有液氮或電動(dòng)

8、勻漿器，可用手動(dòng)勻漿器代替，   此時(shí)組織塊需先用眼科剪將組織絞碎，然后再充分研磨。高蛋白，脂肪或多糖類組織，肌肉組織或塊狀植物組織等，組織勻漿或液氮研磨 后須4 12000離心10min去掉不溶物，再進(jìn)行后面操作。核酸是兩性解離物質(zhì)，一般在pH 8.0時(shí)向正極移動(dòng)。不同大小和構(gòu)象的核酸分子的電荷密度大致相同，在自由電泳時(shí)，各核酸分子的遷移率區(qū)別很小，難以分開(kāi)，因此，用適當(dāng)濃度的凝膠（主要是瓊脂糖凝膠和聚丙酰胺凝膠）介質(zhì)作為電泳支持物，發(fā)揮分子篩的功能，使得分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動(dòng)率出現(xiàn)較大差異，達(dá)到分離目的。影響核酸分子遷移率的因素主

9、要有核酸分子量大小、電荷密度、顆粒形狀、空間構(gòu)型、膠濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度以及緩沖液離子強(qiáng)度等。一般核酸分子量和形狀愈小、電荷密度愈大、膠濃度愈低、電場(chǎng)強(qiáng)度和緩沖液離子強(qiáng)度愈強(qiáng)，則遷移率液愈大。甲醛作為變性劑，與谷氨酸殘基的單亞氨基基團(tuán)形成不穩(wěn)定sehiff堿基對(duì)，在凝膠中可阻止鏈內(nèi)堿基配對(duì)，使RNA維持在變性狀態(tài)，sehiff堿基對(duì)不穩(wěn)定易被稀釋除去。核酸凝膠電泳結(jié)果的檢測(cè)方法有EB（溴化乙錠）、銀染法及同位素放射自顯影等，其中最常用是EB染色法。EB是一種熒光染料，可嵌入核酸的配對(duì)堿基中，在紫外下發(fā)出熒光。RNA分子中常用存在自身堿基配對(duì)的雙鏈區(qū)，也可嵌入EB分子。1. 200g/ml電泳槽的處理

10、用去污劑洗滌電泳槽，再用水沖凈，用無(wú)水乙醇漂洗、干燥，然后在3 H2O2中浸泡30 min,棄3H2O2，用0.1%DEPC處理水將其徹底沖洗干凈；2. 膠版制作取一干凈的膠板，用膠帶紙將膠板兩端封住，放于平臺(tái)上，插入梳子；3. 樣品制備4. 2l10×mops3l甲醛溶液，變性冰中冷卻，（RNA含量約5-10g）電泳結(jié)束，將膠置于UVP凝膠成像系統(tǒng)中觀察、攝像（或在紫外觀察箱中下照像）【注意事項(xiàng)】1. 甲醛有毒，最好在通風(fēng)櫥中操作；2. 瓊脂糖要完全熔于水中，凝膠不能有氣泡存在；3. 電泳膠中含溴化乙啶，最好經(jīng)處理后丟棄。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcript

11、ion-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。一、常用反轉(zhuǎn)錄酶：1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性，RNA酶H活性相對(duì)較弱，最適作用溫度為37。 2 禽成髓細(xì)胞瘤病毒（A

12、MV）反轉(zhuǎn)錄酶：有強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性，最適作用溫度為42。 3MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體：商品名為SuperScript 和SuperScript。此種酶較其它酶能將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的mRNA模板合成較長(zhǎng)cDNA。二、常用合成cDNA引物：1 Oligo(dT)：是一種對(duì)mRNA特異的方法。因絕大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA具有3端Poly(A )尾，此引物與其配對(duì)，僅mRNA可被轉(zhuǎn)錄。 2 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標(biāo)RNA的互補(bǔ)序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應(yīng)用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與m

13、RNA 3端最靠近的配對(duì)引物起始。用此類引物僅產(chǎn)生所需要的cDNA，導(dǎo)致更為特異的PCR擴(kuò)增。（一） （一）試劑RNA提取試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒dNTP、Taq DNA聚合酶1.合成cDNA在PCR管中加25反應(yīng)體系：第一步：模板RNA（約2g） 2ldNTP（10mmol/L） 2lOligo(dT) 2lDEPC水 4l70 5min然后至冰浴迅速冷卻；第二步：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 5lRnase Inhibitor 0.2lM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U） 0.5DEPC水 9.3l37 水浴1.5 h, 95 3min, -20保存2PCR：（1）取PCR管配制25l體系，依次加入下列試劑： 第一鏈cDNA 2 l 上游引物（10 pM） 1l 下游引物（10 pM） 1l dNTP （10 mmol/L） 0.5l 10×PCR buffer 2.5l Taq 酶（4 u/L） 0.2lMgCl2 1.5l ddH2O 16.3l輕輕混勻，離心；（2） PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：（3） 電泳鑒定：瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)四 PCR基因擴(kuò)增【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反