第2章 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用-2

1、六、水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展六、水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)展脊椎動(dòng)物脊椎動(dòng)物無脊椎動(dòng)物無脊椎動(dòng)物魚類魚類多孔動(dòng)物門多孔動(dòng)物門棘皮動(dòng)物門棘皮動(dòng)物門腔腸動(dòng)物門腔腸動(dòng)物門節(jié)肢動(dòng)物門節(jié)肢動(dòng)物門軟體動(dòng)物門軟體動(dòng)物門1、魚類、魚類 魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)所取材的組織魚類細(xì)胞原代培養(yǎng)所取材的組織器官來源很多，包括性腺、腎臟、肝臟、器官來源很多，包括性腺、腎臟、肝臟、脾臟、心臟、鰭條、鰾、鰓上皮、皮膚、脾臟、心臟、鰭條、鰾、鰓上皮、皮膚、吻端、內(nèi)分泌組織、血液、肌肉組織以及吻端、內(nèi)分泌組織、血液、肌肉組織以及骨骼細(xì)胞。魚類胚胎和幼魚的各種組織，骨骼細(xì)胞。魚類胚胎和幼魚的各種組織，分化程度低，分裂潛能大，病毒攜帶少，

2、分化程度低，分裂潛能大，病毒攜帶少，適合作為原代培養(yǎng)的材料。適合作為原代培養(yǎng)的材料。 魚類細(xì)胞平均傳代魚類細(xì)胞平均傳代100 100 代仍可以繼代仍可以繼續(xù)分裂續(xù)分裂, , 比起哺乳類比起哺乳類, , 分裂極限要大得多分裂極限要大得多, , 并且每一代細(xì)胞的存活期均較長(zhǎng)并且每一代細(xì)胞的存活期均較長(zhǎng); ;人和哺人和哺乳動(dòng)物離體培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞株壽命乳動(dòng)物離體培養(yǎng)的正常二倍體細(xì)胞株壽命一般不超過一般不超過50 50 代。代。 至至2010 2010 年年, ,建立的魚類細(xì)胞系約有建立的魚類細(xì)胞系約有275275類，其中大多數(shù)來自淡水魚或溯河產(chǎn)卵的海類，其中大多數(shù)來自淡水魚或溯河產(chǎn)卵的海洋魚類，

3、約洋魚類，約175175株，分別來源于株，分別來源于7171個(gè)科的個(gè)科的89 89 種魚類的不同組織；而海水魚類及咸水魚類種魚類的不同組織；而海水魚類及咸水魚類的細(xì)胞系約的細(xì)胞系約100 100 株，分別來源于株，分別來源于2323個(gè)科的個(gè)科的3535種海水魚類的不同組織。種海水魚類的不同組織。 1981年我國建立了最早的魚類細(xì)胞系年我國建立了最早的魚類細(xì)胞系草魚吻端組織細(xì)胞系草魚吻端組織細(xì)胞系，至今已經(jīng)建立了，至今已經(jīng)建立了70余種余種細(xì)胞株（系），來自細(xì)胞株（系），來自40多種魚類。來源的組織多種魚類。來源的組織有吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、膘、性腺、肝臟、有吻端、腎臟、卵巢、尾鰭、膘、性腺、

4、肝臟、胚胎、囊胚、原腸胚、鰭條等。以淡水魚細(xì)胞胚胎、囊胚、原腸胚、鰭條等。以淡水魚細(xì)胞培養(yǎng)為主。海水魚細(xì)胞的培養(yǎng)也越來越受到重培養(yǎng)為主。海水魚細(xì)胞的培養(yǎng)也越來越受到重視，如視，如牙鲆牙鲆鰓細(xì)胞系、鰓細(xì)胞系、鱸魚鱸魚脾和心細(xì)胞系、脾和心細(xì)胞系、真真鯛鯛鰭細(xì)胞系、花鱸胚胎干細(xì)胞系、漠斑牙鲆胚鰭細(xì)胞系、花鱸胚胎干細(xì)胞系、漠斑牙鲆胚胎干細(xì)胞系、大菱鲆鰭細(xì)胞系、點(diǎn)帶石斑魚脾胎干細(xì)胞系、大菱鲆鰭細(xì)胞系、點(diǎn)帶石斑魚脾臟細(xì)胞系臟細(xì)胞系等。等。 1976年建立了世界上第一個(gè)魚類細(xì)胞系，年建立了世界上第一個(gè)魚類細(xì)胞系，虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系：虹鱒魚生殖腺細(xì)胞系：RTG-2。 魚類細(xì)胞系的應(yīng)用越來越廣泛魚類細(xì)胞系的應(yīng)用

5、越來越廣泛, 已由單純的病毒培養(yǎng)分離、免疫學(xué)、已由單純的病毒培養(yǎng)分離、免疫學(xué)、毒理學(xué)、致癌作用、遺傳學(xué)研究逐毒理學(xué)、致癌作用、遺傳學(xué)研究逐步向近些年研究很集中的基因組學(xué)、步向近些年研究很集中的基因組學(xué)、DNA 的復(fù)制與修飾、表觀遺傳學(xué)、的復(fù)制與修飾、表觀遺傳學(xué)、基因敲除、基因敲除、RNAi 以及最新的以及最新的iPS等等各個(gè)方面發(fā)展。各個(gè)方面發(fā)展。2 2、節(jié)肢動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物 已經(jīng)對(duì)龍蝦、中國對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、草蝦、已經(jīng)對(duì)龍蝦、中國對(duì)蝦、日本對(duì)蝦、草蝦、斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦等多種蝦類進(jìn)行了細(xì)胞斑節(jié)對(duì)蝦、羅氏沼蝦等多種蝦類進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)研究。但由于其生理、生化特點(diǎn)以及生培養(yǎng)研究。但由于其生理、生化特點(diǎn)

6、以及生活環(huán)境均與陸生動(dòng)物有很大差異，加之其細(xì)活環(huán)境均與陸生動(dòng)物有很大差異，加之其細(xì)胞的營養(yǎng)需要和代謝機(jī)理研究滯后，因而，胞的營養(yǎng)需要和代謝機(jī)理研究滯后，因而，節(jié)肢動(dòng)物節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞系的建立細(xì)胞系的建立問題至今仍是全世界問題至今仍是全世界所面臨的挑戰(zhàn)性課題。所面臨的挑戰(zhàn)性課題。斑節(jié)對(duì)蝦淋巴器官的斑節(jié)對(duì)蝦淋巴器官的細(xì)胞在細(xì)胞在L-15 培養(yǎng)基中傳了培養(yǎng)基中傳了90代，第代，第90代后細(xì)代后細(xì)胞不能繼續(xù)傳代生長(zhǎng)，只建立了有限細(xì)胞系。胞不能繼續(xù)傳代生長(zhǎng)，只建立了有限細(xì)胞系。 心臟、卵巢、鰓、胸腺、內(nèi)臟、肌肉、心臟、卵巢、鰓、胸腺、內(nèi)臟、肌肉、淋巴、肝胰臟等組織以及胚胎都被嘗試培養(yǎng)淋巴、肝胰臟等組織以及胚

7、胎都被嘗試培養(yǎng)過。最易培養(yǎng)的組織依次是心臟、淋巴、卵過。最易培養(yǎng)的組織依次是心臟、淋巴、卵巢、腦神經(jīng)節(jié)、眼球。巢、腦神經(jīng)節(jié)、眼球。 待培養(yǎng)組織的消毒滅菌非常困難。節(jié)肢待培養(yǎng)組織的消毒滅菌非常困難。節(jié)肢動(dòng)物的組織器官大多暴露于外界動(dòng)物的組織器官大多暴露于外界, ,帶有較多的帶有較多的微生物和寄生蟲微生物和寄生蟲, ,即使是健康個(gè)體體內(nèi)也存在即使是健康個(gè)體體內(nèi)也存在一些微生物一些微生物, ,使得培養(yǎng)易受污染而失敗。使得培養(yǎng)易受污染而失敗。雖然蝦雖然蝦的胚胎和幼體應(yīng)是最易培養(yǎng)的材料的胚胎和幼體應(yīng)是最易培養(yǎng)的材料, ,但是其胚胎和幼但是其胚胎和幼體是體外發(fā)育體是體外發(fā)育, ,受微生物污染嚴(yán)重受微生物污

8、染嚴(yán)重, ,目前還沒有理想的目前還沒有理想的消毒方法。消毒方法。鱟的鰓組織暴露在海水中，附有一層粘液，鱟的鰓組織暴露在海水中，附有一層粘液，沖洗液很難除菌，鱟的血液中生活有許多的原生動(dòng)物，沖洗液很難除菌，鱟的血液中生活有許多的原生動(dòng)物，在培養(yǎng)鱟血細(xì)胞時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)原生動(dòng)物污染的現(xiàn)象。在培養(yǎng)鱟血細(xì)胞時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)原生動(dòng)物污染的現(xiàn)象。蝦類細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用蝦類細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用病毒研究：病毒研究：桿狀病毒桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒、黃頭病毒(YHV）、）、白斑綜合癥病毒白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血、皮下及造血組織壞死病毒組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒）、蝦彈狀病毒奇怪的現(xiàn)象：奇怪的現(xiàn)象：

9、蝦蟹類在春季、秋季細(xì)胞培養(yǎng)較難，蝦蟹類在春季、秋季細(xì)胞培養(yǎng)較難，冬季幾乎不能成功。這可能與其體內(nèi)冬季幾乎不能成功。這可能與其體內(nèi)的激素分泌和細(xì)胞的基因調(diào)控有關(guān)。的激素分泌和細(xì)胞的基因調(diào)控有關(guān)。 軟體動(dòng)物的數(shù)量?jī)H次于節(jié)肢動(dòng)物軟體動(dòng)物的數(shù)量?jī)H次于節(jié)肢動(dòng)物, , 為動(dòng)物界中第二大類群為動(dòng)物界中第二大類群, , 包括各種包括各種螺類、螺類、雙殼類、烏賊和章魚雙殼類、烏賊和章魚等。軟體動(dòng)物是細(xì)胞等。軟體動(dòng)物是細(xì)胞培養(yǎng)研究開展得最多的一類海洋無脊椎動(dòng)培養(yǎng)研究開展得最多的一類海洋無脊椎動(dòng)物。物。3 3、軟體動(dòng)物門、軟體動(dòng)物門 軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)象主要是一軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的對(duì)象主要是一些養(yǎng)殖的些養(yǎng)殖的雙殼類

10、雙殼類和和腹足類腹足類, , 包括貽貝、珍包括貽貝、珍珠貝、牡蠣、蛤蜊、螺和鮑等。所培養(yǎng)的珠貝、牡蠣、蛤蜊、螺和鮑等。所培養(yǎng)的組織細(xì)胞主要來源于胚胎、鰓、外套膜、組織細(xì)胞主要來源于胚胎、鰓、外套膜、神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、消化腺和心肌等。神經(jīng)細(xì)胞、血細(xì)胞、消化腺和心肌等。 19 世紀(jì)世紀(jì)70 年代年代, 軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就已取得軟體動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)就已取得了一些進(jìn)展。在珍珠牡蠣外套膜組織培養(yǎng)中了一些進(jìn)展。在珍珠牡蠣外套膜組織培養(yǎng)中, 成成功觀察到了體外培養(yǎng)的外套膜細(xì)胞能夠分泌有機(jī)功觀察到了體外培養(yǎng)的外套膜細(xì)胞能夠分泌有機(jī)物和進(jìn)行有絲分裂的現(xiàn)象。但隨后的珍珠牡蠣的物和進(jìn)行有絲分裂的現(xiàn)象。但隨后的珍珠牡蠣的

11、外套膜組織培養(yǎng)卻一直沒有很大的進(jìn)展。外套膜組織培養(yǎng)卻一直沒有很大的進(jìn)展。 1976 年年, 建立起了第一個(gè)也是迄今為止唯一建立起了第一個(gè)也是迄今為止唯一一個(gè)軟體動(dòng)物細(xì)胞系一個(gè)軟體動(dòng)物細(xì)胞系:淡水蝸牛擔(dān)輪幼蟲胚胎細(xì)淡水蝸牛擔(dān)輪幼蟲胚胎細(xì)胞系胞系BGE 。至今沒有解決海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞的。至今沒有解決海洋軟體動(dòng)物細(xì)胞的體外長(zhǎng)期存活和成功傳代建系的問題體外長(zhǎng)期存活和成功傳代建系的問題,即使是培即使是培養(yǎng)貝類的腫瘤組織也不例外。近年來養(yǎng)貝類的腫瘤組織也不例外。近年來, 海洋軟體海洋軟體動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)物的應(yīng)用研究開始增多。利用動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)物的應(yīng)用研究開始增多。利用巨牡蠣的血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)外源污染

12、物的毒巨牡蠣的血細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)外源污染物的毒性效應(yīng)。性效應(yīng)。貝類細(xì)胞培養(yǎng)貝類細(xì)胞培養(yǎng)：無脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，：無脊椎動(dòng)物缺少獲得性免疫系統(tǒng)，血液是重要的免疫器官。細(xì)胞培養(yǎng)作為血液是重要的免疫器官。細(xì)胞培養(yǎng)作為良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅＿m用于良好的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头浅＿m用于血細(xì)胞血細(xì)胞對(duì)外毒物的反應(yīng)的研究對(duì)外毒物的反應(yīng)的研究：外套膜細(xì)胞培養(yǎng)。主要有：馬氏珠：外套膜細(xì)胞培養(yǎng)。主要有：馬氏珠母貝、櫛孔扇貝、鮑、文蛤、大珠母貝母貝、櫛孔扇貝、鮑、文蛤、大珠母貝：鰓細(xì)胞的培養(yǎng)。：鰓細(xì)胞的培養(yǎng)。 利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細(xì)胞探究利用原代培養(yǎng)的櫛孔扇貝血細(xì)胞探究了血細(xì)胞在了血細(xì)胞在細(xì)菌脂多糖細(xì)菌脂多糖的

13、刺激下免疫相關(guān)的刺激下免疫相關(guān)基因基因CfToll-1 表達(dá)量的變化情況；研究苯表達(dá)量的變化情況；研究苯并芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞的影響。并芘對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞的影響。利用多種病原相關(guān)分子模式刺激培養(yǎng)的利用多種病原相關(guān)分子模式刺激培養(yǎng)的長(zhǎng)牡蠣原代血細(xì)胞來研究相關(guān)基因表達(dá)隨長(zhǎng)牡蠣原代血細(xì)胞來研究相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化情況。時(shí)間的變化情況。利用僧帽牡蠣的鰓組織進(jìn)行了培養(yǎng)，并利用僧帽牡蠣的鰓組織進(jìn)行了培養(yǎng)，并在此基礎(chǔ)上研究了毒性較大的氯化三丁基在此基礎(chǔ)上研究了毒性較大的氯化三丁基錫對(duì)牡蠣鰓組織細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)以及存活錫對(duì)牡蠣鰓組織細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)以及存活率的影響。率的影響。貝類細(xì)胞培養(yǎng)面臨的主要困難貝類細(xì)胞培

14、養(yǎng)面臨的主要困難（2）在添加促生長(zhǎng)因子方面，一直沒能尋得一種或是幾種混合的生長(zhǎng)因子來促進(jìn)貝類細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。不能單純的套用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)模式，必須要充分的認(rèn)識(shí)海洋貝類動(dòng)物的不同，深入研究貝類細(xì)胞的營養(yǎng)代謝以及細(xì)胞生理等，以便研發(fā)海洋貝類細(xì)胞培養(yǎng)所適用的培養(yǎng)基；（3）貝類開放的生活環(huán)境，器官組織攜帶大量病菌。（1）在體外使貝類細(xì)胞無限增殖仍然是全世界所面臨的難題。目前對(duì)于海洋無脊椎動(dòng)物特別是貝類細(xì)胞增殖和調(diào)控的知識(shí)知之甚少； 由于海綿特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn)由于海綿特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理特點(diǎn), 使得海綿細(xì)胞培養(yǎng)面臨很大困難使得海綿細(xì)胞培養(yǎng)面臨很大困難, 進(jìn)展緩進(jìn)展緩慢慢, 仍停留在原代培養(yǎng)水平。

15、主要有以下仍停留在原代培養(yǎng)水平。主要有以下兩個(gè)原因兩個(gè)原因:(1)海綿動(dòng)物多為海綿動(dòng)物多為合胞體合胞體，即整，即整個(gè)生物體是由一個(gè)巨大的內(nèi)有橫隔片的個(gè)生物體是由一個(gè)巨大的內(nèi)有橫隔片的多核細(xì)胞構(gòu)成，通過胞內(nèi)隔片上的孔道多核細(xì)胞構(gòu)成，通過胞內(nèi)隔片上的孔道來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)交換。來進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)交換。分散培養(yǎng)的分散培養(yǎng)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)中很難存活和分裂。細(xì)胞在體外培養(yǎng)中很難存活和分裂。體體外培養(yǎng)的海綿細(xì)胞相互接觸后外培養(yǎng)的海綿細(xì)胞相互接觸后, 會(huì)彼此融會(huì)彼此融合合, 形成一個(gè)大的形成一個(gè)大的多核體多核體, 結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有著很大的不同；著很大的不同；2) 海綿動(dòng)物體內(nèi)存在著海綿動(dòng)物體內(nèi)存在著

16、多種內(nèi)共生的微生物多種內(nèi)共生的微生物, 難以實(shí)現(xiàn)海綿細(xì)胞難以實(shí)現(xiàn)海綿細(xì)胞的無菌培養(yǎng)。如果不使用抗生素的話的無菌培養(yǎng)。如果不使用抗生素的話, 培培養(yǎng)又只能維持養(yǎng)又只能維持13天。天。4 4、多孔動(dòng)物（海綿動(dòng)物）、多孔動(dòng)物（海綿動(dòng)物） 細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞的數(shù)量、組織培細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。體體外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴(yán)格的要求。養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴(yán)格的要求。在培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)時(shí), , 多數(shù)腔多數(shù)腔腸動(dòng)物細(xì)胞都只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能腸動(dòng)物細(xì)胞都

17、只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能存活存活, , 而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上的基質(zhì)上, , 才能很好地貼壁、鋪展和遷移。才能很好地貼壁、鋪展和遷移。 腔腸動(dòng)物門包括珊瑚、海葵等腔腸動(dòng)物門包括珊瑚、?？? , 是是二胚層二胚層多細(xì)胞后生動(dòng)物多細(xì)胞后生動(dòng)物, , 有了組織的分化有了組織的分化, , 但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單單, , 體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中膠層中膠層構(gòu)成構(gòu)成, , 細(xì)胞類型少。細(xì)胞類型少。5 5、腔腸動(dòng)物、腔腸動(dòng)物 細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞的數(shù)量、組織培細(xì)胞分散技術(shù)對(duì)存活細(xì)胞

18、的數(shù)量、組織培養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。養(yǎng)的好壞和培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短都有很大影響。體體外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培外培養(yǎng)腔腸動(dòng)物細(xì)胞的存活、貼壁和遷移對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴(yán)格的要求。養(yǎng)基質(zhì)有著很嚴(yán)格的要求。在培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)時(shí), , 多數(shù)腔多數(shù)腔腸動(dòng)物細(xì)胞都只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能腸動(dòng)物細(xì)胞都只有與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸時(shí)才能存活存活, , 而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成而且它們只有附著于由中膠層殘片構(gòu)成的基質(zhì)上的基質(zhì)上, , 才能很好地貼壁、鋪展和遷移。才能很好地貼壁、鋪展和遷移。 腔腸動(dòng)物門包括珊瑚、?？惹荒c動(dòng)物門包括珊瑚、?？? , 是是二胚層二胚層多細(xì)胞后生動(dòng)物多細(xì)胞

19、后生動(dòng)物, , 有了組織的分化有了組織的分化, , 但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)但結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單單, , 體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細(xì)胞以及中間無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中膠層中膠層構(gòu)成構(gòu)成, , 細(xì)胞類型少。細(xì)胞類型少。5 5、腔腸動(dòng)物、腔腸動(dòng)物水螅剖面圖水螅剖面圖棘皮動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)研究棘皮動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)研究開展得很少開展得很少, , 雖然棘皮動(dòng)雖然棘皮動(dòng)物具有無與倫比的再生能物具有無與倫比的再生能力力, ,如海星臂的再生和海參如海星臂的再生和海參的吐臟再生等。但是其細(xì)的吐臟再生等。但是其細(xì)胞培養(yǎng)還是難獲成功胞培養(yǎng)還是難獲成功, , 目目前仍然停留在原代培養(yǎng)的前仍然停留在原代培養(yǎng)的水平上。

20、水平上。6 6、棘皮動(dòng)物、棘皮動(dòng)物海參吐臟海參吐臟 最早在最早在1993 年開始了對(duì)海參再生組年開始了對(duì)海參再生組織的細(xì)胞培養(yǎng)織的細(xì)胞培養(yǎng), 至至40天時(shí)天時(shí), 觀察到再生腸組觀察到再生腸組織來源的細(xì)胞團(tuán)發(fā)生旋轉(zhuǎn)和再生呼吸樹來織來源的細(xì)胞團(tuán)發(fā)生旋轉(zhuǎn)和再生呼吸樹來源的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)搏動(dòng)現(xiàn)象。源的細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)搏動(dòng)現(xiàn)象。 最近最近, 對(duì)海參吐臟后不同再生階段的對(duì)海參吐臟后不同再生階段的腸組織進(jìn)行了原代培養(yǎng)腸組織進(jìn)行了原代培養(yǎng), 發(fā)現(xiàn)只有吐臟后發(fā)現(xiàn)只有吐臟后第第1416 天的再生腸組織的原代培養(yǎng)物天的再生腸組織的原代培養(yǎng)物中中, 能觀察到活躍的細(xì)胞增殖能觀察到活躍的細(xì)胞增殖, 細(xì)胞的數(shù)量細(xì)胞的數(shù)量于培養(yǎng)后第

21、于培養(yǎng)后第20 天加倍天加倍,而在其他再生階段而在其他再生階段的腸組織原代培養(yǎng)物中均未觀察到細(xì)胞分的腸組織原代培養(yǎng)物中均未觀察到細(xì)胞分裂現(xiàn)象。裂現(xiàn)象。應(yīng)用應(yīng)用1 1 用細(xì)胞生產(chǎn)珍珠用細(xì)胞生產(chǎn)珍珠珍珠的價(jià)值珍珠的價(jià)值n中國海水珍珠年產(chǎn)量中國海水珍珠年產(chǎn)量2020余噸；淡水珠產(chǎn)量余噸；淡水珠產(chǎn)量15001500余噸余噸, ,占世界的占世界的9595以上以上, , 但但能作為高檔工藝珠的不足能作為高檔工藝珠的不足1%1%。 與生產(chǎn)工藝有關(guān)與生產(chǎn)工藝有關(guān)n年需求量約年需求量約10001000噸，出口量達(dá)噸，出口量達(dá)400400噸噸 觀賞收藏觀賞收藏藥用保健藥用保健藥用珍珠藥用珍珠4%4%91%0.4%

22、?；撬崤；撬峋S生素維生素藥用、化妝品、中成藥用、化妝品、中成藥的主要原料藥的主要原料（六神（六神丸、安宮牛黃丸等），丸、安宮牛黃丸等），安神、平肝息風(fēng)安神、平肝息風(fēng) 。天然海水珍珠天然海水珍珠淡水養(yǎng)珠淡水養(yǎng)珠珍珠的主要來源珍珠的主要來源馬氏珍珠貝馬氏珍珠貝又稱合浦珠母貝。貝殼斜四方形又稱合浦珠母貝。貝殼斜四方形，背緣略平直，腹緣弧形，背緣略平直，腹緣弧形，前、后緣弓狀。前耳突出，近三角形；后耳較粗短。中國前、后緣弓狀。前耳突出，近三角形；后耳較粗短。中國分布在廣西、廣東和臺(tái)灣海峽南部沿海一帶。國際上公認(rèn)分布在廣西、廣東和臺(tái)灣海峽南部沿海一帶。國際上公認(rèn)中國出產(chǎn)的南海珍珠的質(zhì)量在世界上首屈一指。

23、中國出產(chǎn)的南海珍珠的質(zhì)量在世界上首屈一指。珍珠的形成機(jī)理珍珠的形成機(jī)理軟體動(dòng)物和軟體動(dòng)物和腕足動(dòng)物殼腕足動(dòng)物殼內(nèi)的體壁褶。內(nèi)的體壁褶。珍珠的形成機(jī)理珍珠的形成機(jī)理珍珠的形成機(jī)理珍珠的形成機(jī)理外套膜外套膜海水珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)海水珍珠養(yǎng)殖場(chǎng)傳統(tǒng)的珍珠生產(chǎn)傳統(tǒng)的珍珠生產(chǎn)超大型淡水珍珠養(yǎng)殖吊養(yǎng)場(chǎng)超大型淡水珍珠養(yǎng)殖吊養(yǎng)場(chǎng)視頻資料視頻資料利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)珍珠利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)珍珠目的：目的：培養(yǎng)直徑8mm以上、光澤度好的正圓珍珠實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料：（1）選取體質(zhì)健康、大小均一的1齡三角帆蚌用作細(xì)胞培養(yǎng)，3齡的三角帆蚌為插核之用。（2）細(xì)胞培養(yǎng)材料：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25胰酶、10000I

24、U雙抗(青、鏈霉素) 、牛磺酸、抗壞血酸、水解乳蛋白、制霉菌素、多聚賴氨酸（1）外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)外套膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)的過程生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)的過程（2）細(xì)胞活性與貼壁效果的檢測(cè)細(xì)胞活性與貼壁效果的檢測(cè)（3）珠核的預(yù)處理珠核的預(yù)處理臺(tái)盼藍(lán)染色法顯微鏡觀察法1齡小蚌，切斷前后閉殼肌，撕膜法分離出外套膜外表皮，剪碎，胰酶消化洗滌、高壓滅菌處理（5）內(nèi)臟團(tuán)插核手術(shù)（為什么選擇？）內(nèi)臟團(tuán)插核手術(shù)（為什么選擇？）（6）垂直吊養(yǎng)垂直吊養(yǎng)（4）共培養(yǎng)共培養(yǎng)嚴(yán)格消毒后，用通道針在內(nèi)臟團(tuán)與斧足交界處開口，嚴(yán)格消毒后，用通道針在內(nèi)臟團(tuán)與斧足交界處開口，并制造通道，深度為并制造通道，深度為2 cm2 cm，口徑為，口徑

25、為1 cm1 cm，將處理后，將處理后的珠核移植到育珠蚌體內(nèi)，吸取的珠核移植到育珠蚌體內(nèi)，吸取0.5 mL0.5 mL外套膜細(xì)胞外套膜細(xì)胞懸液，注射到珠核周圍。用浸泡在雙抗中的一次性懸液，注射到珠核周圍。用浸泡在雙抗中的一次性棉棒擦拭傷口，按壓以促進(jìn)傷口消炎愈合。棉棒擦拭傷口，按壓以促進(jìn)傷口消炎愈合。珠核放入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中，完全淹沒珠珠核放入培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞懸液中，完全淹沒珠核。核。吊養(yǎng)位置為水面下吊養(yǎng)位置為水面下25cm25cm處，進(jìn)行常規(guī)育珠養(yǎng)殖。處，進(jìn)行常規(guī)育珠養(yǎng)殖。 由于外套膜比較薄，容易插破，不適由于外套膜比較薄，容易插破，不適宜插大核來培育大顆粒的珍珠。相比之宜插大核來培育

26、大顆粒的珍珠。相比之下內(nèi)臟團(tuán)分布空間很大，且具有珍珠生下內(nèi)臟團(tuán)分布空間很大，且具有珍珠生物礦化所需的生化條件。物礦化所需的生化條件。應(yīng)用應(yīng)用2 2 魚類病毒學(xué)魚類病毒學(xué) 用細(xì)胞分離、檢測(cè)鑒別病毒用細(xì)胞分離、檢測(cè)鑒別病毒什么是病毒？什么是病毒？視頻資料病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害病毒對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的危害 迄今已發(fā)現(xiàn)的近迄今已發(fā)現(xiàn)的近60 種魚類病毒。其中種魚類病毒。其中有有9 種病毒對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)有嚴(yán)重的影響種病毒對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)有嚴(yán)重的影響, 它它們是們是: 雙雙RNA 病毒科的傳染性胰壞死病毒病毒科的傳染性胰壞死病毒虹彩病毒科的虹彩病毒虹彩病毒科的虹彩病毒棒狀病毒科的雙鏈棒狀病毒科的雙鏈DNA 棒狀病毒棒狀病毒呼

27、腸病毒科的草魚呼腸病毒呼腸病毒科的草魚呼腸病毒野田病毒科的野田病毒野田病毒科的野田病毒彈狀病毒科的鯉魚春季病毒血癥病毒、彈狀病毒科的鯉魚春季病毒血癥病毒、病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器病毒性出血性敗血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒和白斑狗魚幼魚彈狀病毒。官壞死病毒和白斑狗魚幼魚彈狀病毒。傳染性胰壞死病毒：傳染性胰壞死病毒：1012死亡率可高達(dá)死亡率可高達(dá)80100%。胰腺壞死，胰腺泡、胰島及所有的細(xì)胞幾乎。胰腺壞死，胰腺泡、胰島及所有的細(xì)胞幾乎都發(fā)生異常，多數(shù)細(xì)胞壞死，核固縮、核碎裂十分顯都發(fā)生異常，多數(shù)細(xì)胞壞死，核固縮、核碎裂十分顯著。病魚游動(dòng)失調(diào)，常作垂直回轉(zhuǎn)游動(dòng)，不久便沉入著。病魚

28、游動(dòng)失調(diào)，常作垂直回轉(zhuǎn)游動(dòng)，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重復(fù)以上游動(dòng)，直至死亡。水底，伺歇片刻后又重復(fù)以上游動(dòng)，直至死亡。虹彩病毒：虹彩病毒：死亡率從死亡率從30%(成魚階段成魚階段)到到100%(幼苗階幼苗階段段)不等。感染的硬骨魚類包括鱸形目、鰈形目、鱈不等。感染的硬骨魚類包括鱸形目、鰈形目、鱈形目和鲀形目等形目和鲀形目等4目近百種海水、淡水魚類。目近百種海水、淡水魚類。出血性敗血癥病毒：出血性敗血癥病毒：許多鮭鱒魚對(duì)其敏感。傳染性強(qiáng)，許多鮭鱒魚對(duì)其敏感。傳染性強(qiáng)，死亡率可達(dá)死亡率可達(dá)80%。有急性型。有急性型(體黑、眼突出，肌肉、體黑、眼突出，肌肉、脂肪組織、口腔和鰾出血，死亡率高，常見

29、初期脂肪組織、口腔和鰾出血，死亡率高，常見初期)、慢性型慢性型(動(dòng)作遲緩，貧血，低死亡率，常見中期動(dòng)作遲緩，貧血，低死亡率，常見中期)和神和神經(jīng)型經(jīng)型(運(yùn)動(dòng)失調(diào)，螺旋狀旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，緩慢死亡，流行運(yùn)動(dòng)失調(diào)，螺旋狀旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，緩慢死亡，流行末期末期)3種類型目前無有效治療方法。種類型目前無有效治療方法。病毒感染病毒感染環(huán)境因素環(huán)境因素免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)蝦類病毒：桿狀病毒(MBV)、黃頭病毒(YHV）、白斑綜合癥病毒(WSSV)、皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV）、蝦彈狀病毒。在體外原代培養(yǎng)的斑節(jié)對(duì)蝦類淋巴細(xì)胞中進(jìn)行了斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒(MBV)、白斑綜合癥病毒(WSSV)和黃頭病毒的增殖, 獲得成功。用

30、凡納濱對(duì)蝦類淋巴原代細(xì)胞接種黃頭病毒(YHV), 出現(xiàn)了CPE。 致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）：指病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，導(dǎo)致細(xì)胞病變甚至死亡的現(xiàn)象。具體而言，體外組織細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，溶細(xì)胞病毒在易感細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制增殖導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落、聚集等現(xiàn)象，稱為致細(xì)胞病變效應(yīng)。致細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒 斜帶石斑魚的腦組織細(xì)胞系GBC1 和GBC4 并用于病毒敏感性實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)前者對(duì)于神經(jīng)壞死病毒(GNNV)高度敏感, 但對(duì)于花鱸虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的結(jié)果正好相反。 玳瑁石斑魚腦、鰓、心臟3個(gè)細(xì)胞系, 進(jìn)行了病毒及細(xì)胞毒素敏感性的實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)

31、3種細(xì)胞系對(duì)于不同病毒和毒素的敏感性存在明顯的差異。病毒對(duì)細(xì)胞具有選擇性病毒對(duì)細(xì)胞具有選擇性病毒的培養(yǎng)分離病毒的培養(yǎng)分離實(shí)例實(shí)例-魚源彈狀病毒的分離魚源彈狀病毒的分離 魚類彈狀病毒是一類能使多種魚出現(xiàn)高致死魚類彈狀病毒是一類能使多種魚出現(xiàn)高致死率的病毒病原體，其感染宿主譜廣、普遍存在、率的病毒病原體，其感染宿主譜廣、普遍存在、嚴(yán)重危害各種淡水和海水魚。迄今報(bào)道感染魚類嚴(yán)重危害各種淡水和海水魚。迄今報(bào)道感染魚類的彈狀病毒已有的彈狀病毒已有20 20 多種，包括導(dǎo)致鯉科魚類大多種，包括導(dǎo)致鯉科魚類大規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥的鯉春病毒血癥病毒、引規(guī)模爆發(fā)鯉春病毒血癥的鯉春病毒血癥病毒、引起虹鱒、鮭等患出

32、血性疾病的病毒性出血性敗血起虹鱒、鮭等患出血性疾病的病毒性出血性敗血癥病毒、引起鱒魚和太平洋大馬哈魚為主的急性、癥病毒、引起鱒魚和太平洋大馬哈魚為主的急性、全身性的嚴(yán)重傳染病的傳染性造血器官壞死病毒、全身性的嚴(yán)重傳染病的傳染性造血器官壞死病毒、以及牙鲆彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒、鱖魚彈狀病以及牙鲆彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒、鱖魚彈狀病毒、胭脂魚彈狀病毒、石鰈魚彈狀病毒等。毒、胭脂魚彈狀病毒、石鰈魚彈狀病毒等。草魚腎細(xì)胞系草魚腎細(xì)胞系(CIK) 肥頭鯉細(xì)胞系肥頭鯉細(xì)胞系(FHM)鯉上皮細(xì)胞系鯉上皮細(xì)胞系(EPC) 草魚腦細(xì)胞草魚腦細(xì)胞(CIB) 草魚鰾細(xì)胞草魚鰾細(xì)胞(GSB)錦鯉吻端細(xì)胞系錦鯉吻端細(xì)胞系

33、(KPC) 劍尾魚胚胎細(xì)胞系劍尾魚胚胎細(xì)胞系(SFC) 鱖腦細(xì)胞系鱖腦細(xì)胞系(SCC)所用細(xì)胞系及代號(hào)所用細(xì)胞系及代號(hào) 無菌采取無菌采取病魚病魚的鰾、肝、腎、脾，加入的鰾、肝、腎、脾，加入含雙抗的滅菌的含雙抗的滅菌的PBS 中制成中制成1 1 的勻漿液，的勻漿液，在在20凍融凍融3 次后，組織勻漿液依次經(jīng)次后，組織勻漿液依次經(jīng)2000、5000 和和10000r /min，每次離心，每次離心10 min，去沉淀，上清液經(jīng)濾膜孔徑為，去沉淀，上清液經(jīng)濾膜孔徑為0. 22 m 的微孔濾器過濾除菌分別接種密度為的微孔濾器過濾除菌分別接種密度為80%90% 的單層的單層FHM、EPC、CIK、GIB、

34、GSB、KPC、SFC 和和SCC 細(xì)胞，室溫下吸細(xì)胞，室溫下吸附附1 h，吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的，吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液維持液( 含含3%FBS 的的M199) ，28恒溫培恒溫培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)。病毒傳代時(shí)，將病養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)。病毒傳代時(shí)，將病毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融毒細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融2 3 次。次。如何檢測(cè)鑒別病毒？如何檢測(cè)鑒別病毒？直接檢測(cè)直接檢測(cè)免疫檢測(cè)免疫檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)分子生物學(xué)檢測(cè)1、電子顯微鏡；、電子顯微鏡；2、病毒包涵體檢查、病毒包涵體檢查1、酶免疫技術(shù)；、酶免疫技術(shù)；2、熒光免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)3、單克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)1、核酸雜

35、交；、核酸雜交；2、PCR、RT-PCR技術(shù)；技術(shù)；一、電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)一、電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)n研究病毒形態(tài)、鑒定研究病毒形態(tài)、鑒定n診斷病毒病診斷病毒病 檢測(cè)不能在體外培養(yǎng)的病毒，檢測(cè)不能在體外培養(yǎng)的病毒，如輪狀病毒、星狀病毒、嵌如輪狀病毒、星狀病毒、嵌杯病毒、杯病毒、HAVHAV等都是用電鏡最等都是用電鏡最先發(fā)現(xiàn)的先發(fā)現(xiàn)的能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的病毒和病毒病。新的病毒和病毒病。彈狀病毒的電子顯微鏡觀察彈狀病毒的電子顯微鏡觀察標(biāo)本的制備標(biāo)本的制備 濃縮標(biāo)本方法：濃縮標(biāo)本方法： 超速離心超速離心 離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大離心的時(shí)間和速度取決于病毒顆粒的大小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一

36、般是小和離心機(jī)轉(zhuǎn)頭的半徑，一般是30min到到3h沉淀沉淀的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上；的樣本用滅菌蒸餾水洗后再放到銅網(wǎng)上； 超過濾法超過濾法 用于分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為用于分子篩的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為10000； 接種細(xì)胞接種細(xì)胞 接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切接種細(xì)胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；片； 免疫凝集免疫凝集 如有特異抗血清，且病毒已知，也可用如有特異抗血清，且病毒已知，也可用該法濃縮病毒該法濃縮病毒1、正染法（超薄切片法、病組織）、正染法（超薄切片法、病組織）q將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀將細(xì)胞用戊二醛固定，然后脫水、包埋、切片、染色、觀察

37、病毒顆粒，通常察病毒顆粒，通常12 d完成。完成。q操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長(zhǎng)期保存，可觀察病毒粒子形操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，但樣品可長(zhǎng)期保存，可觀察病毒粒子形態(tài)與發(fā)生過程。態(tài)與發(fā)生過程。2、負(fù)染法、負(fù)染法q直接將病毒懸液直接將病毒懸液(也可用細(xì)胞也可用細(xì)胞)滴在銅網(wǎng)上，用重金屬滴在銅網(wǎng)上，用重金屬(通常通常用磷鎢酸用磷鎢酸) 進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，進(jìn)行染色，觀察病毒顆粒，10-20min可出結(jié)果。可出結(jié)果。q原理：原理：負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，負(fù)性染料不滲入病毒顆粒，而是將病毒顆粒包繞，由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒顆粒具有由于負(fù)性染料含重金屬使電子束不能穿透，病毒

38、顆粒具有亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)亮度，在周圍暗背景上顯示亮區(qū)較正染法顯示的圖像較正染法顯示的圖像清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。清晰，可顯示病毒的結(jié)構(gòu)。q缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒以上，同科病毒難于鑒別。難于鑒別。3、投影技術(shù)、投影技術(shù)采用幾種電鏡技術(shù)觀采用幾種電鏡技術(shù)觀察病毒粒子的形態(tài)察病毒粒子的形態(tài)Orf virus：口瘡病毒口瘡病毒(接觸性膿皰皮炎接觸性膿皰皮炎) )Ebola virus埃博埃博拉病毒（正染技術(shù)）拉病毒（正染技術(shù)）Vaccinia virus 痘苗病毒痘苗病毒（投影技術(shù)）（投影技術(shù)）負(fù)染技術(shù)負(fù)染技術(shù)彩色電子顯微照片。它顯

39、示出彩色電子顯微照片。它顯示出H5N1型禽流感病毒型禽流感病毒（金黃色）在（金黃色）在MDCK細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)細(xì)胞（綠色）培養(yǎng)液中的活動(dòng)狀態(tài)狀態(tài)二、病毒的免疫檢測(cè)二、病毒的免疫檢測(cè)1、熒光免疫法、熒光免疫法(IF)2、酶免疫法（、酶免疫法（ELISA）3、單克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)1、免疫熒光法、免疫熒光法(IF)熒光熒光（fluorescencefluorescence） 熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋放出能量，稱為熒光。光形式釋放出能量，稱為熒光。

40、 熒光壽命熒光壽命定義定義: :熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。定程度時(shí)所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。 熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光最大吸收光譜譜最大發(fā)射光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用應(yīng)用異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黃（黃綠色）綠色）FATFAT、熒光偏振免疫、熒光偏振免疫測(cè)定測(cè)定四乙基羅丹明四乙基羅丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙紅（橙紅色）色

41、）FITCFITC的襯比染色或的襯比染色或雙標(biāo)記雙標(biāo)記FATFAT四甲基異硫氰酸羅四甲基異硫氰酸羅丹明丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙紅色）（橙紅色）FITCFITC的襯比染色或的襯比染色或雙標(biāo)記雙標(biāo)記FATFAT藻紅蛋白（藻紅蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（紅色）（紅色）雙標(biāo)記雙標(biāo)記FATFAT、流式細(xì)、流式細(xì)胞術(shù)胞術(shù)7-7-氨基氨基-4-4-甲基香甲基香豆素豆素354nm354nm430nm430nm（藍(lán)色）（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm

42、613nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定測(cè)定熒光物質(zhì)：熒光物質(zhì)：一類能吸收激發(fā)光的光能而發(fā)射熒光的物質(zhì)。 電子的躍遷熒光抗體技術(shù)的基本原理熒光抗體技術(shù)的基本原理 熒光素標(biāo)記抗體與切片中組織細(xì)胞抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記抗體與切片中組織細(xì)胞抗原反應(yīng)，洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗洗滌分離后熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)特異熒光的抗原抗體復(fù)合物及其部位，對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定體復(fù)合物及其部位，對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定。位檢測(cè)，或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定?？贵w要求抗體要求 高特異性高特異性 高親和力高親和力 經(jīng)純化提取經(jīng)純化提取IgGIgG

43、 熒光抗體的制備熒光抗體的制備v有能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)有能與蛋白質(zhì)形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。易于清除。v結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。結(jié)合后，仍保持較高的熒光效率。v熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。v結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。v標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒。v與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。熒光素要求熒光素要求抗體的熒光素標(biāo)記抗體的熒光素標(biāo)

44、記v標(biāo)記原理標(biāo)記原理: :利用抗體蛋白的自由氨基與利用抗體蛋白的自由氨基與FITCFITC的異硫的異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵，使抗體與FITCFITC結(jié)結(jié)合成熒光抗體。合成熒光抗體。v標(biāo)記方法標(biāo)記方法: : 攪拌法：攪拌法：適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗適于標(biāo)記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標(biāo)記時(shí)間體。標(biāo)記時(shí)間 短，熒光素用量少，但有非特異性染短，熒光素用量少，但有非特異性染色。色。 透析法：透析法：適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。適于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標(biāo)記比較勻，標(biāo)記比較勻， 非特異染色較低。非特異染色較低。v去除游離熒光

45、素及其降解產(chǎn)物：去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過透析或凝膠過濾濾v去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子陰離子交換層析法交換層析法v去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動(dòng)物肝粉吸收或動(dòng)物肝粉吸收或固相抗原吸收固相抗原吸收熒光抗體的純化熒光抗體的純化直接法直接法直接熒光抗體染色法示意圖直接熒光抗體染色法示意圖 熒光素標(biāo)記的熒光素標(biāo)記的特異性抗體直特異性抗體直接與相應(yīng)抗原接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。反應(yīng)。熒光抗體染色熒光抗體染色間接法間接法特異性抗體與相特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標(biāo)記的抗抗光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體體再與第一抗

46、體結(jié)合。結(jié)合。 間接熒光抗體染色法示意圖間接熒光抗體染色法示意圖 熒光顯微鏡熒光顯微鏡 利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)利用一定波長(zhǎng)的激發(fā)光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品一定波長(zhǎng)的熒光，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測(cè)。定位、定量觀察檢測(cè)。 n主要試劑主要試劑: : 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)記的抗體或抗原n酶標(biāo)物特點(diǎn)：酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性免疫學(xué)活性 酶對(duì)底物的催化活性酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶促催化反應(yīng)的高敏感性酶促催化反應(yīng)的高敏感性2、酶免疫法（、酶免疫法（ELISA）特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)

47、、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有操作簡(jiǎn)便、對(duì)環(huán)境沒有污染。污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的衍生出適用范圍更廣的新方法新方法。原理：原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析定性或定量的測(cè)定分析 酶免疫技術(shù)的核心部分酶免疫技術(shù)的核心部分 酶結(jié)合物酶結(jié)合物（conjugateconjugate）酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物 通過化學(xué)反應(yīng)或免通過化學(xué)反應(yīng)或

48、免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的抗體或抗原形成的結(jié)合物結(jié)合物 酶酶免免疫疫技技術(shù)術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定均均 相相異相異相固相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片中的抗原抗體反應(yīng)組織切片中的抗原抗體反應(yīng) 液體標(biāo)本中抗原或液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量抗體的定性和定量(ELISA)(ELISA)三個(gè)部分：三個(gè)部分： 免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 酶與底物反應(yīng)酶與底物反應(yīng) 檢測(cè)方法的建立檢測(cè)方法的建立ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）高純度的抗原、高親和

49、力的抗體高純度的抗原、高親和力的抗體高活性、高純度的標(biāo)記用酶高活性、高純度的標(biāo)記用酶有效的交聯(lián)方法制備高質(zhì)量的酶有效的交聯(lián)方法制備高質(zhì)量的酶標(biāo)記物標(biāo)記物選用適宜的酶選用適宜的酶/ /底物系統(tǒng)底物系統(tǒng)底物顯色底物顯色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反應(yīng)反應(yīng)加入待測(cè)抗體或加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原抗原和酶標(biāo)抗原或抗體或抗體洗滌洗滌使結(jié)合在固相上使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離與未結(jié)合的分離1234固相的抗原或抗體固相的抗原或抗體 酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物 酶反應(yīng)的底物酶反應(yīng)的底物 雙抗體夾心法雙抗體夾心法（double antibody sandwich-EL

50、ISAdouble antibody sandwich-ELISA）方法：方法：用已知抗體包被，加入待檢血清病毒樣品，再加用已知抗體包被，加入待檢血清病毒樣品，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：應(yīng)用：二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定( (乙型肝炎乙型肝炎表面抗原表面抗原HBsAg),HBsAg),不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。ELISAELISA檢測(cè)抗原的方法檢測(cè)抗原的方法雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E陰性對(duì)照陰性對(duì)照捕獲法捕獲法+ +- -E

51、EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待測(cè)物、加待測(cè)物特異性特異性IgMIgM與與非特異性非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性、加特異性抗原，與特異抗原，與特異性抗體結(jié)合性抗體結(jié)合4 4、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色合，加底物顯色2 2、加待測(cè)物、加待測(cè)物只有非特異性只有非特異性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM結(jié)合結(jié)合3 3、加特異性抗、加特異性抗原，不能與非原，不能與非特異性特異性IgMIgM結(jié)合結(jié)合4 4、加酶標(biāo)抗體、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)

52、合，無抗原結(jié)合，加底物不顯色加底物不顯色n（一）固相載體（一）固相載體 聚苯乙烯聚苯乙烯 特點(diǎn)：吸附蛋白能力強(qiáng)，保留其免疫活性特點(diǎn)：吸附蛋白能力強(qiáng)，保留其免疫活性 形狀：小試管、小珠、微量形狀：小試管、小珠、微量ELISA板板 n（二）抗原和抗體（二）抗原和抗體 高純度的抗原高純度的抗原 高效價(jià)的抗體高效價(jià)的抗體 固相酶免疫測(cè)定的技術(shù)要點(diǎn)固相酶免疫測(cè)定的技術(shù)要點(diǎn)n（三）酶和底物的選擇（三）酶和底物的選擇 標(biāo)記酶的要求：標(biāo)記酶的要求： 活性高活性高 性質(zhì)穩(wěn)定性質(zhì)穩(wěn)定 專一性強(qiáng)專一性強(qiáng) 酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量 方法敏感，重復(fù)性好，簡(jiǎn)單易行方法敏感，重復(fù)

53、性好，簡(jiǎn)單易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉酶的底物易于配制保存，酶及底物價(jià)廉辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)糖蛋白糖蛋白鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTSABTSOPDOPD反應(yīng)后顯橙黃反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng)492nm492nm。不穩(wěn)定，致癌性。不穩(wěn)定，致癌性。TMBTMB反應(yīng)后顯藍(lán)色反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變加

54、酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色為黃色, ,測(cè)定波長(zhǎng)測(cè)定波長(zhǎng)450nm 450nm ，穩(wěn)定，無，穩(wěn)定，無致癌性，致癌性，ELISAELISA中應(yīng)中應(yīng)用最廣泛的底物。用最廣泛的底物。 堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（ALPALP）菌源性菌源性ALP ALP 腸粘膜腸粘膜ALPALP-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal）其他的酶其他的酶大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌 ALPALP的的底物底物 對(duì)對(duì)- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPP pNPP ）經(jīng)經(jīng)ALPALP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405 nm405 nm。 -Gal-Gal的底物的底物 4-4

55、-甲基傘酮基甲基傘酮基-D -D - -半乳糖苷半乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）酶作用后，生成高強(qiáng)度酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物熒光物 ，用熒光計(jì)測(cè)，用熒光計(jì)測(cè)量。量?？乖蠹兌雀?，抗原性完整抗原要求純度高，抗原性完整 抗體需要特異性好、效價(jià)高、親抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。產(chǎn)，易純化。 酶標(biāo)抗體制備方法要求酶標(biāo)抗體制備方法要求制備方法制備方法過碘酸鈉法（直接法）過碘酸鈉法（直接法）常用于常用于HRPHRP標(biāo)記抗體或抗原標(biāo)記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法 酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一純化純化標(biāo)記完成后應(yīng)除去

56、反應(yīng)液中的游離酶、標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度作用而降低特異性染色強(qiáng)度 抗體是從何來的？抗體是從何來的？傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法及缺陷是什么？傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法及缺陷是什么？ 抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的功能的球蛋白。球蛋白。3、單克隆抗體技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)（）（）B B

57、淋巴細(xì)胞受淋巴細(xì)胞受抗原刺激抗原刺激后，可以后，可以產(chǎn)生產(chǎn)生抗體抗體。（）動(dòng)物體內(nèi)的（）動(dòng)物體內(nèi)的B B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生百萬種以上百萬種以上的抗體，每種抗體對(duì)特定的抗的抗體，每種抗體對(duì)特定的抗原具有特異性免疫作用。原具有特異性免疫作用。（）每一個(gè)淋巴細(xì)胞（）每一個(gè)淋巴細(xì)胞只能只能產(chǎn)生一種產(chǎn)生一種抗體?？贵w。B淋巴細(xì)胞有什么特點(diǎn)？淋巴細(xì)胞有什么特點(diǎn)？ 單克隆抗體的特點(diǎn)？單克隆抗體的特點(diǎn)？ 由單個(gè)由單個(gè)B B淋巴細(xì)胞經(jīng)過淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖無性繁殖（克（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性性質(zhì)單一

58、、特異性強(qiáng)強(qiáng)的抗體稱為單克隆抗體。的抗體稱為單克隆抗體。 特異性強(qiáng)、靈敏度高特異性強(qiáng)、靈敏度高 單克隆抗體制備過程？單克隆抗體制備過程？1、單克隆抗體：、單克隆抗體：2、特點(diǎn)：、特點(diǎn)： 單克隆抗體制備過程單克隆抗體制備過程 注射抗原注射抗原B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合、篩選細(xì)胞融合、篩選雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生足夠數(shù)量的、能產(chǎn)生特定抗體的細(xì)胞群特定抗體的細(xì)胞群體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔單克隆抗體單克隆抗體單克隆抗體的應(yīng)用1、診斷試劑（病原微生物、腫瘤抗原檢測(cè)）2、蛋白質(zhì)提純3、腫瘤導(dǎo)向治療技術(shù)（生物導(dǎo)

59、彈）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)細(xì)胞融合是正常的生命活動(dòng)兩個(gè)細(xì)胞正在融合兩個(gè)細(xì)胞正在融合 受精作用受精作用誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法用用 誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合過程細(xì)胞核細(xì)胞核病毒顆粒病毒顆粒滅活的病毒滅活的病毒細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜連接雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞融合細(xì)胞的篩選方法融合細(xì)胞的篩選方法常用的克隆化培養(yǎng)方法常用的克隆化培養(yǎng)方法1、半固體平板培養(yǎng)法、半固體平板培養(yǎng)法2、有限稀釋法、有限稀釋法3、顯微鏡操作法、顯微鏡操作法4、蓋片分離法、蓋片分離法有限稀釋法有限稀釋法樣品樣品處理處理富集富集獲得病毒獲得病毒的

60、的核酸序核酸序列列是描述是描述病毒特征病毒特征的關(guān)鍵。的關(guān)鍵。檢測(cè)檢測(cè)分子生物學(xué)方法分子生物學(xué)方法三、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)三、病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)1、核酸雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)2、PCR和和RT-PCR技術(shù)技術(shù)同源性：同源性：從分子水平講則是指兩個(gè)核酸分子的核從分子水平講則是指兩個(gè)核酸分子的核苷酸序列間的相似程度。苷酸序列間的相似程度。1 1、核酸雜交技術(shù)、核酸雜交技術(shù)DNA的變性與復(fù)性的變性與復(fù)性DNA變性：變性：DNA雙鏈之間以氫鍵連接，氫鍵是一種次級(jí)鍵，能量較低，易受破壞，在某些理化因素作用下，DNA分子互補(bǔ)堿基對(duì)之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)松散，變成單鏈，即為DNA變性。 DNA