細菌總數(shù)檢測

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上細菌總數(shù)檢測1 定義食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間等）培養(yǎng)后，所得每g（ml）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。2 設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：2.1 恒溫培養(yǎng)箱：36±1，30±1。2.2 冰箱：25。2.3 恒溫水浴箱：46±1。2.4 天平：感量為0.1g。2.5 均質(zhì)器。2.6 振蕩器。2.7 無菌吸管：1ml（具0.01ml 刻度）、10ml（具0.1ml 刻度）或微量移液器及吸頭。2.8 無菌錐形瓶：容量250ml、500ml。2.9 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。2.

2、10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。2.11 放大鏡或/和菌落計數(shù)器。3 培養(yǎng)基和試劑3.1 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見附錄中1。3.2 磷酸鹽緩沖液：見附錄中2。3.3 無菌生理鹽水：見附錄中3。4 操作方法4.1 試驗前準備4.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑等移至操作室內(nèi)。準備好足夠用量，避免操作中出入操作間。4.1.2 開啟無菌室紫外殺菌燈和潔凈工作臺的空氣過濾裝置30min。4.1.3 操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好無菌衣、帽、口罩、手套等。 4.

3、1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作臺面，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌剪刀或鑷子將供試品啟封。 4.2 樣品稀釋液的制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采取適宜的方法制備樣品稀釋液。樣品稀釋液制備若需用水浴加溫時，溫度不應(yīng)超過45。樣品稀釋液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超過1小時。4.2.1 固體和半固體樣品稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000 r/min10000r/min 均質(zhì)1min2min，或放入盛有225ml稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min2min，制成1:10的樣品勻液。4.2.2

4、 液體樣品以無菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。4.3 菌落總數(shù)測定4.3.1 用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml 稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。4.3.2 按4.3.1操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1ml無菌吸管或吸頭。4.3.3 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液

5、），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1ml樣品勻液于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1ml空白稀釋液加入兩個無菌平皿內(nèi)作空白對照。4.3.4 及時將15ml20ml冷卻至46的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46±1恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。4.4 培養(yǎng)4.4.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36±1培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30±1培養(yǎng)72h±3h。4.4.2 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4ml），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按4.4.1條件進行培養(yǎng)。4.5

6、 菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。4.5.1 選取菌落數(shù)在30CFU300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。4.5.2 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數(shù)。4.5.3 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間

7、無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。4.6 結(jié)果與報告4.6.1 菌落總數(shù)的計算方法4.6.1.1 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每g（ml）樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。4.6.1.2 若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按下公式計算：式中：N樣品中菌落數(shù)；C平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；n1第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；n2第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；d稀釋因子（第一稀釋度）。4.6.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數(shù)，其

8、他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算。4.6.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.6.1.5 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。4.6.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30CFU300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。4.6.2 菌落總數(shù)的報告4.6.2.1 菌落數(shù)小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報告。4.6.2.2 菌落數(shù)大于或等于100CFU時，

9、第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。4.6.2.3 若所有平板上為蔓延菌落而無法計數(shù)，則報告菌落蔓延。4.6.2.4 若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結(jié)果無效。4.6.2.5 稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/ml為單位報告。附錄 培養(yǎng)基和試劑1 平板計數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基1.1 成分胰蛋白胨 5.0g酵母浸膏 2.5g葡萄糖1.0g瓊脂 15.0g蒸餾水 1000mlpH 7.0±0.21.2 制法將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH。分裝試管或錐形瓶，121高壓滅菌15min。2 磷酸鹽緩沖液2.1 成分磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g蒸餾水 500mlpH 7.22.2 制法貯存液：稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500ml蒸餾水中，用大約175ml的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH，用蒸餾