WB檢測(cè)全攻略

1、WB檢測(cè)全攻略 WesternBlot,對(duì)于任何一個(gè)科研君都不陌生，但是，為甚么別人的實(shí)驗(yàn)時(shí)間短、跑膠快、成像顯影辣么好看活生生的羨慕，嫉妒，hen(哼)，足足被甩了幾篇SCI„內(nèi)情你知否？ 除了實(shí)驗(yàn)精細(xì)化操作，選擇合適的實(shí)驗(yàn)試劑，還有呢？當(dāng)然離不開(kāi)你的優(yōu)化設(shè)計(jì)你對(duì)關(guān)鍵步驟的步步為營(yíng)。 本文旨在通過(guò)提供建議，幫助您在短時(shí)間、以更少的終端用戶優(yōu)化調(diào)整得到預(yù)期結(jié)果，提升免疫印跡效果。PS：科研是不斷進(jìn)步的過(guò)程，有不當(dāng)之處，望指正。 何為蛋白印跡（WB） 蛋白印跡也稱作免疫印跡，是一種被廣泛應(yīng)用并得到公認(rèn)的技術(shù)，用于檢測(cè)細(xì)胞或組織提取物中的蛋白表達(dá)水平。 這一技術(shù)利用抗體與特定待

2、檢測(cè)蛋白的結(jié)合，測(cè)定生物樣本中的蛋白水平?？贵w與其靶點(diǎn)蛋白表位的精確結(jié)合可用于檢測(cè)蛋白質(zhì)中具有高度特異性的氨基酸序列。 一句話講完WB：就是抗原抗體反應(yīng)！ WesternBlot可以： 1.從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)； 2.定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況； 3.用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。 以下，會(huì)從關(guān)鍵步驟入手，我們將給出試劑和實(shí)驗(yàn)過(guò)程的建議，逐一介紹每個(gè)步驟中的一些關(guān)鍵注意點(diǎn)以及給出對(duì)應(yīng)優(yōu)化后的圖表，供大家參考 一、裂解產(chǎn)物制備1.組織裂解 常見(jiàn)破碎組織的方法：機(jī)械法、勻漿法、超聲波破碎解、研磨法，反復(fù)凍融法等； 實(shí)驗(yàn)室常用的破碎方法

3、：1.超聲波；2.電動(dòng)研磨；3.磁珠破碎法。（注意磁珠高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的熱量比較多，需提前把機(jī)器放在冰箱制冷）以上主要注意發(fā)熱引起的蛋白變性和聚集，操作過(guò)程中盡量減少細(xì)節(jié)上的差異，這樣才能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性比較一致。 2.細(xì)胞裂解 一般裂解液包含以下幾個(gè)組分:1.緩沖系統(tǒng)；2.鹽離子；3.離液劑； 4.蛋白酶抑制劑；5.還原劑 二、凝膠電泳 1.加入足量的樣品和分子量大小標(biāo)記物 SDS-PAGE根據(jù)蛋白電泳遷移率將其分離，遷移率是蛋白大小和電荷的函數(shù)。 我們建議在預(yù)制Tris-Glycine小孔膠上樣20-40μg全細(xì)胞裂解液或100ng純化蛋白，根據(jù)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量?jī)?yōu)化上樣量。

4、 對(duì)于大分子量靶標(biāo)，我們建議采用Tris-Acetate凝膠和相關(guān)緩沖液。應(yīng)在待測(cè)樣本附近的泳道始終加入分子量標(biāo)記物，作為參考點(diǎn)。分子量標(biāo)記物（或梯狀條帶）是已知分子量的純化蛋白的混合物。 采用預(yù)染色標(biāo)記可以看見(jiàn)電泳過(guò)程中蛋白遷移的距離，隨后確認(rèn)經(jīng)電轉(zhuǎn)移至膜。采用生物素標(biāo)記物可以看見(jiàn)膜上的梯狀條帶和抗體靶標(biāo)。 2.選擇合適的蛋白marker預(yù)染蛋白marker應(yīng)用： ?實(shí)時(shí)監(jiān)控SDA-PAGE中的蛋白遷移 ?檢驗(yàn)western轉(zhuǎn)膜效率 ?對(duì)蛋白大小進(jìn)行初略鑒定 ?呈彩色且轉(zhuǎn)膜效果好 三、轉(zhuǎn)膜1.濕轉(zhuǎn)移 把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上的濕轉(zhuǎn)移是指把濾紙-凝膠-膜-濾紙"三明治'完全浸入

5、緩沖液中。使用此方法時(shí)，在浸沒(méi)的情況下通過(guò)電泳轉(zhuǎn)移至0.2μm孔徑硝酸纖維素膜，在冷卻的含20%甲醇的轉(zhuǎn)移緩沖液中轉(zhuǎn)膜，70V，1.5小時(shí)。 2.半干轉(zhuǎn)移 把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上的半干轉(zhuǎn)移是指將浸滿緩沖液的濾紙-凝膠-膜-濾紙"三明治'系統(tǒng)，置于本應(yīng)干燥的陽(yáng)極和陰極板上。 在這一系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)移在桌面上進(jìn)行，在室溫條件下約15-60分鐘。轉(zhuǎn)移低分子量和高分子量蛋白時(shí)這一系統(tǒng)均運(yùn)轉(zhuǎn)良好，相較于濕轉(zhuǎn)移所需緩沖液更少，但是在某些情況下會(huì)產(chǎn)生更高的背景染色。（轉(zhuǎn)膜時(shí)不離人，監(jiān)測(cè)電流電壓） 3.干轉(zhuǎn)移 把蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至膜的干轉(zhuǎn)移是指不額外加入緩沖液的系統(tǒng)，因?yàn)殛?yáng)極和陰極板系

6、統(tǒng)中含有緩沖液基質(zhì)。對(duì)于較大分子量蛋白，觀察到信號(hào)差異最大，表明轉(zhuǎn)移效率低。 （注意：在樣本量有限或待檢測(cè)蛋白低內(nèi)源水平的情況下，干轉(zhuǎn)移方法會(huì)限制您分析的靈敏度。） 四、封閉 建議轉(zhuǎn)移之后迅速在Tris-BufferedSaline(TBS)中洗滌膜，以便移除殘留的轉(zhuǎn)移緩沖液，隨后在室溫條件下含5%脫脂牛奶的TrisBufferedSaline和Tween®20去污劑(TBST)中封閉1小時(shí)。這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結(jié)合并降低背景。應(yīng)避免膜封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因?yàn)檫@會(huì)掩蓋抗原表位，阻止抗體結(jié)合。封閉后在TBST中洗滌5分鐘。 五、一抗、二抗孵育1.加一抗與抗原結(jié)合 ?一抗應(yīng)

7、在含5%BSA或5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中稀釋。 ?一抗孵育時(shí)間會(huì)有很大的差別，具體取決于研究人員采用的操作流程。建議在4過(guò)夜孵育一抗。（過(guò)夜孵育提高抗體結(jié)合） ?免疫印跡操作流程的另一個(gè)存在差異的方面是洗滌和稀釋緩沖液。推薦抗體稀釋緩沖液和洗滌步驟使用TBST。(TBST緩沖液產(chǎn)生更強(qiáng)的信號(hào)) 2.加二抗與一抗的結(jié)合 ?建議在含5%脫脂牛奶的TBST中稀釋二抗。 ?因?yàn)槊撝Ｄ痰姆忾]要更強(qiáng)，所以基于BSA的稀釋比基于牛奶的稀釋產(chǎn)生的背景明顯更強(qiáng)。 ?如果對(duì)免疫沉淀細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，考慮采用構(gòu)象或鏈特異性二抗，以避免IgG重鏈或輕鏈的信號(hào)。 這個(gè)步驟的成敗 關(guān)鍵看試劑質(zhì)量的好壞用

8、的抗體不到位整個(gè)實(shí)驗(yàn)都白費(fèi)有木有 六、檢測(cè) 一般使用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。 1HRP-ECL發(fā)光法： 將A、B發(fā)光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見(jiàn)淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見(jiàn)熒光強(qiáng)度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標(biāo)定Marker，進(jìn)行分析與掃描。 2AP-NBT/BICP顯色法： 每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個(gè)EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過(guò)的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報(bào)紙）遮擋光線，顯色20s后每10