鱸魚病毒性疾病病

1、鱸魚病毒性疾病病原體的檢測(cè)鱸魚病毒性疾病病原體的檢測(cè)與鑒定與鑒定 淡水鱸魚具有生長(zhǎng)快、適應(yīng)性廣、抗病能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，深受人們歡迎。我國(guó)沿海均有分布，資源豐富，雖然，鱸魚抗病能力較強(qiáng)，自然條件下不易患病。但人工高密度養(yǎng)殖因其生存環(huán)境及空間發(fā)生很大變化，稍有不慎極易造成疾病，尤其是病毒性疾病，危害極大。 鱸魚?；嫉牟《拘约膊∮校瑚|魚常患的病毒性疾病有： 鱸魚淋巴囊腫病鱸魚淋巴囊腫病 鱸魚病毒性出血性敗血癥鱸魚病毒性出血性敗血癥 鱸魚病毒性腦壞死疾病鱸魚病毒性腦壞死疾病 魚類淋巴囊腫病是由淋巴囊腫病毒感染引起魚類的一種典型的皮膚和淺表組織慢性病,它是最早發(fā)現(xiàn)最早發(fā)現(xiàn)的魚類病毒性疾病。 該病的

2、普遍癥狀是病魚體表長(zhǎng)有瘤狀物該病的普遍癥狀是病魚體表長(zhǎng)有瘤狀物,嚴(yán)嚴(yán)重時(shí)內(nèi)臟組織器官也出現(xiàn)病變。重時(shí)內(nèi)臟組織器官也出現(xiàn)病變。 所以以鱸魚淋巴囊腫病鱸魚淋巴囊腫病為例設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)證明這一病毒為這一病害的病原體。 鱸魚淋巴囊腫病病狀：鱸魚淋巴囊腫病病狀： 病魚眼睛、口腔內(nèi)外、鰓及上下體表各部位有大小不一的囊腫物，囊腫物小如念珠，大如菜花，顏色有白色、粉紅色和黑色，較大的囊腫物上有肉眼可見(jiàn)的紅色小血管?；疾?yán)重的，囊腫物遍布體表，當(dāng)囊腫物破裂時(shí)，會(huì)形成開(kāi)放性潰面。鱸魚輕微發(fā)病時(shí)，攝食正常、但生長(zhǎng)緩慢；疾病嚴(yán)重時(shí)，病魚基本不攝食、部分死亡 。檢測(cè)方法檢測(cè)方法 顯微和超微觀察顯微和超微觀察 核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸

3、擴(kuò)增技術(shù) 免疫檢測(cè)免疫檢測(cè) 顯微和超微觀察顯微和超微觀察 顯微鏡和生物電鏡技術(shù)是研究病毒感染引起的的病理變化，觀察病毒和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，揭示病毒與宿主細(xì)胞相互作用的技術(shù)。通過(guò)電子顯微鏡可以觀察病變細(xì)胞的病理結(jié)構(gòu)、病毒形態(tài)大小和類型以及了解病毒的感染、復(fù)制和形態(tài)發(fā)生等特征。 檢測(cè)步驟檢測(cè)步驟 收集病體魚與健康魚的細(xì)胞或組織樣品 （主要靶器官魚體表皮下結(jié)締組織、其次是鰓、體腔膜、腸、脾和頭主要靶器官魚體表皮下結(jié)締組織、其次是鰓、體腔膜、腸、脾和頭腎腎）制備石蠟切片、冷凍切片或半薄切片經(jīng)熒光染料染色觀察并與健康魚同區(qū)域細(xì)胞做對(duì)比觀察到的癥狀觀察到的癥狀 在體表皮下結(jié)締組織中，當(dāng)大量成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞

4、膨大、變圓膨大、變圓，大小為1018m時(shí)，細(xì)胞膜外未出現(xiàn)囊壁，少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到嗜堿性物質(zhì)嗜堿性物質(zhì)（堿性物質(zhì)通常是指具有提供電子的能力或接受質(zhì)堿性物質(zhì)通常是指具有提供電子的能力或接受質(zhì)子的能力的物質(zhì)。子的能力的物質(zhì)。）；1820m的膨大細(xì)胞在細(xì)胞膜外出現(xiàn)囊壁，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)嗜堿性物質(zhì)；大于20m的細(xì)胞具有了淋巴囊腫細(xì)胞的典型特征。另外，在鱸魚的鰓等部位均觀察到淋巴囊腫細(xì)胞淋巴囊腫細(xì)胞，并在鱸魚脾內(nèi)觀察到膨大細(xì)膨大細(xì)胞。胞。 顯微和超微觀察顯微和超微觀察 核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù) 核酸雜交技術(shù)是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用于檢測(cè)DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。PCR技術(shù)具有特異、敏

5、感、高效、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。目的是：在試管中將所要研究的鱸魚病變組織的基因或DNA片段在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增足量的DNA，再進(jìn)行分析研究和檢測(cè)鑒定。目前已成功進(jìn)行了魚類細(xì)胞淋巴囊腫病毒的檢測(cè)。間接熒光法間接熒光法該方法分為兩步：獲取單克隆抗體、間接熒光法的檢測(cè)和鑒定該方法分為兩步：獲取單克隆抗體、間接熒光法的檢測(cè)和鑒定l 獲取單克隆抗體的步驟：獲取單克隆抗體的步驟：（1）抗原制備）抗原制備 1.取病體魚的病變細(xì)胞或組織取病體魚的病變細(xì)胞或組織 2.將樣品制成組織勻漿，反復(fù)凍融三次，選擇適當(dāng)轉(zhuǎn)速進(jìn)行差速離心將樣品制成組織勻漿，反復(fù)凍融三次，選擇適當(dāng)轉(zhuǎn)速

6、進(jìn)行差速離心 或密度梯度離心的方法進(jìn)行純化或密度梯度離心的方法進(jìn)行純化 3.進(jìn)行滅活處理進(jìn)行滅活處理（2）將待測(cè)抗原注射到小鼠體內(nèi)（免疫動(dòng)物）；）將待測(cè)抗原注射到小鼠體內(nèi)（免疫動(dòng)物）；（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合；）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備、細(xì)胞融合； （5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)、篩選；）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)、篩選；（7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化及單克隆抗體的大量制備。）雜交瘤細(xì)胞的克隆化及單克隆抗體的大量制備。間接法（又稱熒光間接法（又稱熒光抗體法）的步驟抗體法）的步驟（1）制作病體魚的組織切片并固定）制作病體魚的組織切片并固定（2）第一步，用已知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原（待檢）第一步，用已知未標(biāo)記的抗體（待檢標(biāo)本）加到已知抗原（待檢標(biāo)本）標(biāo)本上，在濕盒中標(biāo)本）標(biāo)本上，在濕盒中37保溫保溫30min，使抗原抗體充分結(jié)合。洗，使抗原抗體充分結(jié)合。洗滌，除去未結(jié)合的抗體。滌，除去未結(jié)合的抗體。（3）加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗）加上熒光標(biāo)記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM 抗體（通常為熒光標(biāo)抗體（通常為熒光標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗）。如果第一步發(fā)生了