肝病的病理形態(tài)特點及免疫組化染色體會

1、常見肝病的病理形態(tài)特點及免常見肝病的病理形態(tài)特點及免疫組化染色的幾點體會疫組化染色的幾點體會 復旦大學病理學系張錦生肝穿刺標本檢查和處理原則肝穿刺標本檢查和處理原則1. 1. 肉眼觀察肉眼觀察 肝穿刺標本呈完整園柱狀，長度肝穿刺標本呈完整園柱狀，長度1 13 cm3 cm典型的慢性肝炎肝纖維化標本呈竹節(jié)狀外觀典型的慢性肝炎肝纖維化標本呈竹節(jié)狀外觀肝硬化的穿刺標本，呈不規(guī)則碎塊肝硬化的穿刺標本，呈不規(guī)則碎塊2.石蠟切片石蠟切片 每張玻片上應放置超過每張玻片上應放置超過6個連續(xù)組織切片，有助于肝纖維個連續(xù)組織切片，有助于肝纖維化的病理診斷?；牟±碓\斷。3. 3. 染色染色 除常規(guī)染色供病理診斷用

2、之外，根據條件除常規(guī)染色供病理診斷用之外，根據條件和需要作以下特殊染色：和需要作以下特殊染色：網狀纖維染色，網狀纖維染色，MassonMasson三色染色，三色染色，膠原纖維染色膠原纖維染色(Sirius red(Sirius red或免疫組化或免疫組化 ) ) Dm-HSC Dm-HSC -SMA-MFb -SMA-MFb Dm-SMAS1S2S3S4各種病因引起肝纖維的病理學特點及分期各種病因引起肝纖維的病理學特點及分期1. 1. 慢性肝炎肝纖維化慢性肝炎肝纖維化 ( Dr.Scheuer( Dr.Scheuer 方案）方案）活動性纖維間隔靜止性纖維間隔活動性纖維間隔靜止性纖維間隔2.2.

3、脂肪性肝病肝纖維化脂肪性肝病肝纖維化 穿刺肝組織呈淡黃色，標本懸浮于固定液穿刺肝組織呈淡黃色，標本懸浮于固定液小葉中央區(qū)纖維化竇周纖維化小葉中央區(qū)纖維化竇周纖維化3. 3. 肝糖原累積病肝纖維肝糖原累積病肝纖維 4. Wilson病病 紅氨酸(Rubeanic acid)染色,銅被染成深綠色5. 血色病血色病 穿刺肝組織因含有大量含鐵血穿刺肝組織因含有大量含鐵血黃素沉著呈火焰紅色黃素沉著呈火焰紅色肝細胞普魯氏藍染色陽性6. 6. 自身免疫性肝炎肝纖維化（自身免疫性肝炎肝纖維化（AIHAIH） 門管區(qū)肝細胞呈花環(huán)狀排列門管區(qū)肝細胞呈花環(huán)狀排列Hepatic Rosette Hepatic Ros

4、ette ，表現為數個水樣變，表現為數個水樣變性的肝細胞被炎癥細胞和塌陷的網狀支架包繞成花環(huán)狀結構。性的肝細胞被炎癥細胞和塌陷的網狀支架包繞成花環(huán)狀結構。7. 7. 原發(fā)性膽汁性肝硬化（原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBCPBC） 3 3期（間隔期）期（間隔期）90%90%出現自身抗體出現自身抗體(A-Mit(A-Mit) )，Florid duct lesion+BiliaryFlorid duct lesion+Biliary PN PN， 纖維間隔形成，肝細胞羽毛狀變性纖維間隔形成，肝細胞羽毛狀變性4 4期（肝硬化）期（肝硬化） 靜止靜止- - 纖維間隔內無炎癥或輕度炎癥纖維間隔內無炎癥或輕度炎癥

5、 活動活動 Fibrous PN. Fibrous PN. 8. 8. 血吸蟲性肝纖維化血吸蟲性肝纖維化 肝癌(LIVER CANCER) HCC ICC Combined hepatocellular and cholangiocarcinoma肝癌病理診斷常用免疫組化和特染肝癌病理診斷常用免疫組化和特染 Hep Par1 線粒體相關抗原，與AFP無關對胎兒和成人肝細胞高度特異 (HCC:陽性率82-97%） AFPHCC陽性率：15-82% CD34: HCC型染色長條分枝，管壁纖細，管腔狹窄，分布均勻彌漫.而非癌肝組織內極少見. CK 18: HCC,ICC, Metastatic ca

6、rcinoma:100%+ 上皮性腫瘤標志物 CK 19: 膽管型CK: CK19,CK7 肝細胞 膽管上皮，ICC：77-100% ICC最好的標志物 CEA： monoclonal CEA:毛細膽管ICC，轉移性肝癌：60-75%+ HCC:0-11%+ polyclonal CEA: 毛細膽管HCC特異標志物之一 CK 20: 胃腸道腺癌的主要標志物轉移性腺癌：74-100%+ ICC:10%+ HCC:0%+ MOC31: 抗人上皮相關抗原轉移性腺癌：100%+ ICC: 92.9%+ HCC: 0% + 胃癌肝轉移 HBsAg: HCC: 70-80% +胞質型，胞核型陽性胞質型，核

7、周型陽性 黏液染色：AB/PAS 酸性黏多糖：蘭色（膽管腺瘤,ICC腔內黏液）中性黏多糖,糖原：紅色（假腺管型HCC)免疫組織化學染色的幾點體會免疫組織化學染色的幾點體會一、組織和細胞標本制備一、組織和細胞標本制備 目的：目的： (1)最大限度地保存組織結構。最大限度地保存組織結構。 (2)最大限度地保存抗原性。最大限度地保存抗原性。 注意事項：在選擇組織處理方法前，先根據實驗注意事項：在選擇組織處理方法前，先根據實驗目的，參考抗體說明，確定組織處理方式目的，參考抗體說明，確定組織處理方式(冰凍冰凍?石蠟石蠟?)。1.取材 （1）原則：盡可能新鮮，動物標本可選）原則：盡可能新鮮，動物標本可選

8、用動脈灌注固定。用動脈灌注固定。 （2）取材部位：盡量包括病灶和正常組）取材部位：盡量包括病灶和正常組 織交界處，避免選擇壞死組織?？椊唤缣?，避免選擇壞死組織。 （3）避免擠壓：受擠壓組織不但影響）避免擠壓：受擠壓組織不但影響 HE切片的觀察，還造成非特異性切片的觀察，還造成非特異性 免疫組化組織著色。免疫組化組織著色。2.固定 根據不同的染色目的，選擇不同的固定液，固定根據不同的染色目的，選擇不同的固定液，固定時組織越新鮮越好。組織塊厚薄大小要合適。時組織越新鮮越好。組織塊厚薄大小要合適。 容器要大容器要大,固定液要寬余固定液要寬余. 固定時間既要考慮充分固定固定時間既要考慮充分固定,又不能

9、太長又不能太長(依組織依組織塊厚薄大小從塊厚薄大小從24hr至至35天天,太長可溶性抗原會滲太長可溶性抗原會滲漏漏,陽性會減弱甚至轉陰陽性會減弱甚至轉陰. 選擇最合適的固定劑選擇最合適的固定劑,如用福爾馬林如用福爾馬林,必須用緩沖必須用緩沖福爾馬林福爾馬林3.制備蠟塊 沖水、脫水、透明、包埋。盡可能采用低沖水、脫水、透明、包埋。盡可能采用低溫石蠟包埋溫石蠟包埋,如無低溫石蠟如無低溫石蠟,可將組織塊盡可可將組織塊盡可能修薄能修薄,以縮短脫水、透明、包埋時間以縮短脫水、透明、包埋時間,盡可盡可能保存組織內抗原穩(wěn)定。能保存組織內抗原穩(wěn)定。4.制備冰凍切片 冷凍包埋能較好保存抗原,新鮮及已固定材料均適

10、合于冷凍包埋、切片。 防止冰結晶防止冰結晶! 預處理預處理:目的是減少組織中的水分以減少冰結晶的產生,方法是將已固定、沖洗的組織塊放入2030%蔗糖緩沖液內,4冰箱過夜,再將組織塊埋于OCT包埋劑 速凍速凍:目的是使溫度很快下降迅速通過冰點,防止冰結晶產生。速凍方法液氮法液氮法:將OCT包埋的組織塊投入液氮數秒,等組織塊凍結后,立即移入低溫冰箱(裝入封口塑料袋內密封)或放入恒冷切片機恒冷箱內以備切片;干冰干冰-丙酮法丙酮法:將200ml丙酮注入小型廣口保溫瓶或保溫杯內,逐漸加入干冰至飽和不再冒泡為止,溫度可達-70;將裝有50ml異戊烷的小燒杯緩慢置入干干冰冰-丙酮丙酮飽和液中;然后將OCT包

11、埋的組織塊投入異戊烷內速凍半分至一分鐘。免疫組化染色后的襯染 常用蘇木精或甲基綠襯染細胞核。但如果常用蘇木精或甲基綠襯染細胞核。但如果陽性信號在細胞核陽性信號在細胞核,切勿襯染細胞核切勿襯染細胞核! 細胞質襯染細胞質襯染:1%亮綠亮綠,但退色較快但退色較快,可改用堅可改用堅固綠固綠(FAST BLUE)染染,則保存時間較長則保存時間較長封固和保存封固和保存 絕大多數免疫酶染色后都可用樹膠封絕大多數免疫酶染色后都可用樹膠封固，但如用固，但如用DAB以外的底物應注意有以外的底物應注意有色沉淀物如為脂溶性，應改用水溶性色沉淀物如為脂溶性，應改用水溶性封固物如明膠、甘油緩沖液等。封固物如明膠、甘油緩沖

12、液等。 酶免疫染色切片可保存數周甚至數月。酶免疫染色切片可保存數周甚至數月。 免疫熒光染色后應盡快觀察、拍照。免疫熒光染色后應盡快觀察、拍照。一一.常用免疫組織化學方法常用免疫組織化學方法1.免疫熒光免疫熒光: 用于培養(yǎng)細胞效果較好用于培養(yǎng)細胞效果較好, 石蠟切片因常有自發(fā)熒光石蠟切片因常有自發(fā)熒光,背景熒光較強背景熒光較強,用時要注用時要注意意 FITC(異硫氰酸熒光素) 用450490 nm光激發(fā),515nm 濾片觀察, 呈翠綠色 RB200(四乙基羅達明B200) 用570nm光激發(fā), 596 600nm濾片觀察,呈橘紅色 TRITC(四甲基異硫氰酸羅達明) 用530 560nm光激發(fā),

13、580nm濾片觀察,呈紅色 Texas red 用595nm光激發(fā), 615nm濾片觀察,呈紅色 直接免疫熒光法直接免疫熒光法: 間接免疫熒光法間接免疫熒光法 雙重熒光染色雙重熒光染色2.免疫組織化學免疫組織化學 常用方法: PAP ABC或LSAB ELPS(二步法)20世紀70年（1970）Sternberg Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP)20世紀80年代（1981） 許世民 ABC（親和免疫組化） Avidin-Biotin-Peroxidase Complex90年代中期：Enhanced Polymer One Step (EPOS) EnVisio

14、n (Enhanced Labelled Polymer System, ELPS)簡稱二步法 1 mol 含 70 mol HRP + 10 mol AB如何做好免疫組化染色?什么才是高質量的免疫組化染色什么才是高質量的免疫組化染色?陽性信號突出陽性信號突出無背景染色無背景染色切片平整切片平整無破裂無破裂/碎碎,無污穢無污穢做好免疫組化染色幾點體會1.組織細胞處理: 固定劑 固定時間 速凍防冰結晶 白片質量好:平整,無破裂/碎,無污穢 防脫片 : 玻片絕對干凈 涂粘合劑: 白膠 多聚賴氨酸 鉻明礬明膠液 甲醛明膠液 貼片后冷風吹干或37 /60烘干 2.抗體:特異性,高效價,親合力,適度稀釋度3.石蠟切片- 抗原修復 (1)蛋白酶消化: 胰蛋白酶 胰糜蛋白酶 鏈霉蛋白酶 蛋白酶K 胃蛋白酶 消化不足- 修復失敗,假陰性或信號弱 消化過度- 結構破環(huán),脫片 (2)熱修復: 微波照射 高壓加熱 水浴加熱 (3)微波+蛋白酶消化 注意點: