流式細胞儀原理及應用

1、致：致：流式細胞術概述流式細胞術概述BD BiosciencesImmune Function流式細胞術的基本概念流式細胞術的基本概念=流式細胞術（流式細胞術（Flow Flow CytometryCytometry, , 簡稱簡稱FCMFCM）是一種可以快速、是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線準確、客觀，并且能夠同時檢測快速直線流動狀態(tài)流動狀態(tài)中的中的單單個個微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術，微粒（通常是細胞）的多項特性，并加以定量的技術，同時可以對特定群體加以分選同時可以對特定群體加以分選=研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微研究對象為生物顆粒

2、，如各種細胞、微生物及人工合成微球等球等=研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量BD BiosciencesImmune Function流式細胞儀的檢測范圍流式細胞儀的檢測范圍 細胞結構細胞結構 細胞大小細胞大小 細胞顆粒度細胞顆粒度 細胞表面積細胞表面積 核漿比例核漿比例 DNADNA含量與細胞周期含量與細胞周期 RNARNA含量含量 蛋白質含量蛋白質含量 細胞功能細胞功能 細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核的特異性抗原核的特異性抗原 細胞活性細胞活性 細胞內細胞內/ /外的細胞因子外的細胞因子 激素結合位點、細胞受體激素結

3、合位點、細胞受體 蛋白磷酸化蛋白磷酸化 pHpH值值 鈣離子濃度鈣離子濃度 細胞膜電位、線粒體膜電位細胞膜電位、線粒體膜電位 流式細胞儀的原理流式細胞儀的原理BD BiosciencesImmune FunctionBD BiosciencesImmune Function液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，液流系統(tǒng)：鞘液包繞著單行排列的細胞依次高速通過流動池，而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經檢測的樣本和而激光聚焦于流動池中心的樣本流上，隨后經檢測的樣本和鞘液流向廢液桶。鞘液流向廢液桶。BD BiosciencesImmune Function光學系統(tǒng)：經熒光染色的細

4、胞在激光的照射下產生散射光學系統(tǒng)：經熒光染色的細胞在激光的照射下產生散射光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增光和熒光信號，同時被前向光電二極管和一組光電倍增管（管（PMT）接收，熒光信號經一系列雙色性反射鏡和帶）接收，熒光信號經一系列雙色性反射鏡和帶通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號通或長通濾光片的分離，形成多個不同波長的熒光信號BD BiosciencesImmune Function電子系統(tǒng)：熒光信號和散射光信號經二極管和電子系統(tǒng)：熒光信號和散射光信號經二極管和PMT接收后接收后可轉換為電信號，再通過?？赊D換為電信號，再通過模/數(shù)轉換器轉換為可被計算機識數(shù)轉換器轉

5、換為可被計算機識別的數(shù)字信號，以圖形的形式呈現(xiàn)給操作者別的數(shù)字信號，以圖形的形式呈現(xiàn)給操作者BD BiosciencesImmune Function散射光信號散射光信號FALS SensorLaserBD BiosciencesImmune Function散射光信號散射光信號Right Angle Light Right Angle Light Detector Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Forward Light Detector Detector Cell Surface Area Cell

6、Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource= 前向角散射光（前向角散射光（FSC, Forward ScatterFSC, Forward Scatter）細胞相對大小及其表面積細胞相對大小及其表面積 = 側向角散射光（側向角散射光（SSC, Side ScatterSSC, Side Scatter）細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性BD BiosciencesImmune Function外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖（紅細胞溶解后）（紅細胞溶解后

7、）GranulocytesMonocytesLymphocytesBD BiosciencesImmune Function流式細胞儀的檢測信號流式細胞儀的檢測信號熒光信號熒光信號 使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析 熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量BD BiosciencesImmune Function熒光信號熒光信號雙色直接染色雙色直接染色BD BiosciencesImmune Function數(shù)據(jù)存儲數(shù)據(jù)存儲 FCS 2.0格式格式 常以列表模式（常以列表模式（LIST MODE)：將每個細

8、胞的每個檢測參：將每個細胞的每個檢測參量依次排列順序存儲量依次排列順序存儲FSC SSC FL1 FL2Eventvent 210016024585Event 3300650160720FITC/PE雙染樣本雙染樣本BD BiosciencesImmune FunctionBD BiosciencesImmune Function數(shù)據(jù)顯示數(shù)據(jù)顯示 直方圖（直方圖（Histogram） 二維點圖（二維點圖（Dot Plot） 等高線圖（等高線圖（Contour Plot） 密度圖（密度圖（Density） 三維圖（三維圖（3D Plot）等）等BD Bioscience

9、sImmune Function單參數(shù)直方圖分析單參數(shù)直方圖分析BD BiosciencesImmune Function數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析= 直方圖分析直方圖分析BD BiosciencesImmune Function多參數(shù)散點圖分析多參數(shù)散點圖分析BD BiosciencesImmune Function數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=等高圖和密度圖分析等高圖和密度圖分析BD BiosciencesImmune Function數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析=三維圖分析三維圖分析BD BiosciencesImmune Function流式細胞儀的應用流式細胞儀的應用BD BiosciencesImmune Func

10、tion流式細胞儀的臨床應用流式細胞儀的臨床應用= HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4絕對計數(shù)絕對計數(shù)= 淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析= 白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型= 腫瘤的細胞周期和倍體分析腫瘤的細胞周期和倍體分析= 網織紅細胞計數(shù)網織紅細胞計數(shù)= 細胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測細胞移植的免疫狀態(tài)監(jiān)測= 干細胞計數(shù)干細胞計數(shù)= 陣發(fā)性血紅蛋白尿陣發(fā)性血紅蛋白尿= HLA-B27HLA-B27檢查檢查= 血小板功能及相關疾病血小板功能及相關疾病BD BiosciencesImmune Function流式細胞儀的科研應用流式細胞儀的科研應用=免疫功能研究免疫功能研究

11、=血小板分析（心腦血管疾病）血小板分析（心腦血管疾?。?細胞周期和倍體分析細胞周期和倍體分析=細胞凋亡細胞凋亡=干細胞研究干細胞研究=樹突細胞研究樹突細胞研究=腫瘤相關基因表達的研究腫瘤相關基因表達的研究=抗腫瘤藥物作用機制以及多藥耐藥性的研究抗腫瘤藥物作用機制以及多藥耐藥性的研究=放療放療/ /化療療效的研究化療療效的研究BD BiosciencesImmune Function淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析 使用經熒光素標記的特異單克隆抗體，進行多色使用經熒光素標記的特異單克隆抗體，進行多色染色，同時分析淋巴細胞膜上多種白細胞分化抗染色，同時分析淋巴細胞膜上多種白細胞分化抗原（原（CDC

12、D分子）的表達，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分分子）的表達，可以將淋巴細胞亞群區(qū)分開，進行定性分析開，進行定性分析 各淋巴細胞亞群的百分含量各淋巴細胞亞群的百分含量 淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)，進行定量分析淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)，進行定量分析BD BiosciencesImmune Function淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析 根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為根據(jù)功能，淋巴細胞主要分為B B淋巴細胞（淋巴細胞（CD19+CD19+），），與體液免疫有關與體液免疫有關T T淋巴細胞（淋巴細胞（CD3+CD3+），），與細胞免疫有關與細胞免疫有關 總總T T和總和總B B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病

13、可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NKNK細胞（細胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），），行使免疫監(jiān)控功能，行使免疫監(jiān)控功能， 能能夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作夠介導對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。用。BD BiosciencesImmune Function淋巴細胞亞群分析淋巴細胞亞群分析根據(jù)根據(jù)CD4CD4、CD8CD8表達，表達，T T淋巴細胞又分為淋巴細胞又分為T T輔助輔助/ /誘導細胞（誘導細胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/ /細胞毒性細胞（細胞毒性細胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）ThTh/Ts

14、 /Ts 評價那些自身免疫失調、被懷疑是免疫失調評價那些自身免疫失調、被懷疑是免疫失調或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)或已知患有免疫缺陷的病人的免疫狀態(tài)BD BiosciencesImmune Function診斷原發(fā)性免疫缺陷病（如先天性無診斷原發(fā)性免疫缺陷?。ㄈ缦忍煨詿o r 球蛋白血癥）或繼發(fā)球蛋白血癥）或繼發(fā)性免疫缺陷病（如性免疫缺陷?。ㄈ鏏IDS）造血干細胞移植后免疫重建（造血干細胞移植后免疫重建（6個月個月NK ；9個月個月T、B ） ThTh/Ts/Ts ：機體免疫功能亢進機體免疫功能亢進：自身免疫性疾病，如：自身免疫性疾病，如SLESLE、類風、類風濕性關節(jié)炎等（治療有效恢復正

15、常）濕性關節(jié)炎等（治療有效恢復正常） ThTh/Ts/Ts ：機體免疫功能低下機體免疫功能低下：AIDSAIDS、病毒感染、慢性活動性、病毒感染、慢性活動性肝炎和活動性肝硬化、再障、結核、腫瘤等肝炎和活動性肝硬化、再障、結核、腫瘤等 移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：移植后動態(tài)免疫監(jiān)測：急排臨床癥狀出現(xiàn)前急排臨床癥狀出現(xiàn)前1-51-5天，活化天，活化T T和和ThTh/Ts/Ts持續(xù)持續(xù) ，1.21.2預示急排；預示急排；ThTh/Ts/Ts持續(xù)持續(xù) 表明可能感染，比值表明可能感染，比值1.081.08，可能性大，可能性大，0.20.2應停用免疫抑應停用免疫抑制劑；制劑； 實體腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察實體

16、腫瘤療效和病人免疫狀態(tài)觀察治療前常伴治療前常伴T T 、ThTh/Ts/Ts ，放，放/ /化療有效可恢復；化療有效可恢復；淋巴細胞免疫表型正常或治療后能恢復正常者預后常較好；淋巴細胞免疫表型正?；蛑委熀竽芑謴驼Ｕ哳A后常較好； 探索疾病發(fā)病機理、進程和預后（炎癥、腫瘤）探索疾病發(fā)病機理、進程和預后（炎癥、腫瘤）臨床意義臨床意義判斷病人的機體免疫狀態(tài)判斷病人的機體免疫狀態(tài)BD BiosciencesImmune Function常見疾病的常見疾病的T 淋巴細胞的變化淋巴細胞的變化： CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 類風濕性關類風濕性關節(jié)炎節(jié)炎 （活動期）（活動期） 系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性

17、紅斑狼瘡 - 或或 （活動期）（活動期） 多發(fā)性硬化癥多發(fā)性硬化癥 重癥肌無力重癥肌無力 膜型腎小球腎炎膜型腎小球腎炎 胰島素依賴性糖尿病胰島素依賴性糖尿病 乙型肝炎乙型肝炎 自身溶血性貧血自身溶血性貧血 上呼吸道感染上呼吸道感染 BD BiosciencesImmune Function常見疾病的常見疾病的T 淋巴細胞的變化淋巴細胞的變化 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 腫瘤腫瘤 再障及粒細胞減少癥再障及粒細胞減少癥 巨細胞病毒感染巨細胞病毒感染 血小板減少血小板減少 活動性特應性皮炎活動性特應性皮炎 過敏性皮炎過敏性皮炎 BD BiosciencesImmune Func

18、tion淋巴細胞亞群雙色分析淋巴細胞亞群雙色分析12%76%49%26%11%BD BiosciencesImmune FunctionAIDS 病人病人T亞群分析亞群分析27-51%15-44%50-84%BD BiosciencesImmune Function先天性無先天性無 r 球蛋白血癥球蛋白血癥5-18%BD BiosciencesImmune Function乳腺癌患者乳腺癌患者T淋巴細胞亞群變化淋巴細胞亞群變化BD BiosciencesImmune FunctionTriTEST/MultiTestTriTEST/MultiTest與與T T淋巴細胞絕對計數(shù)淋巴細胞絕對計數(shù)

19、使用三色試劑或四色免洗試劑使用三色試劑或四色免洗試劑 樣本使用樣本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量5050uLuL 免洗操作，減少細胞丟失免洗操作，減少細胞丟失 絕對計數(shù)絕對計數(shù)TruCOUNTTruCOUNT管預先加有已知數(shù)量微球，在流式細管預先加有已知數(shù)量微球，在流式細胞儀上直接得到胞儀上直接得到T T淋巴細胞亞群的絕對含量，提高工作效淋巴細胞亞群的絕對含量，提高工作效率和計數(shù)的精確度率和計數(shù)的精確度單平臺計數(shù)單平臺計數(shù) 報告報告T T淋巴細胞及淋巴細胞及THTH、TSTS百分含量、絕對含量和百分含量、絕對含量和H/SH/S比值比值BD BiosciencesImmun

20、e FunctionTriTESTTriTEST CD4/CD8/CD3 CD4/CD8/CD3分析分析與與T T淋巴細胞絕對計數(shù)淋巴細胞絕對計數(shù)h %T LymphCD3+ Abs Cnth CD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs Cnth CD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs Cnth T H/S RatioBD BiosciencesImmune FunctionMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19淋巴細胞淋巴細胞活化功能研究活化功能研究BD BiosciencesIm

21、mune FunctionT淋巴細胞活化淋巴細胞活化 細胞數(shù)目增殖細胞數(shù)目增殖 細胞表面表達細胞表面表達活化標記活化標記 分泌細胞因子分泌細胞因子BD BiosciencesImmune FunctionCFSE示蹤原理 羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)是一種可穿透細胞膜的熒光染料，CFSE進入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質上。當細胞分裂時，CFsE標記熒光可平均分配至兩個子代細胞中，因此其熒光強度是親代細胞的一半。這樣，在一個增殖的細胞群中，各連續(xù)代細胞的熒光強度呈對遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進行分析。 體內、體外實驗均可以應用

22、BD BiosciencesImmune FunctionDilution of CFSE with cell divisionLyons and Parish, 1994JIM, 171;131Divisions:3 2 1 0CFSEFL-1 (Log)Divisions: 3 2 1 0BD BiosciencesImmune Function葡萄球菌腸毒素刺激牛時間變化示意圖，BD BiosciencesImmune FunctionT淋巴細胞活化淋巴細胞活化 細胞數(shù)目增殖細胞數(shù)目增殖 細胞表面表達細胞表面表達活化標記活化標記 分泌細胞因子分泌細胞因子BD BiosciencesImm

23、une FunctionT細胞激活抗原表達的動力學曲線細胞激活抗原表達的動力學曲線FastImmune Assay System快速全面檢測淋巴細胞功能快速全面檢測淋巴細胞功能 BD BiosciencesImmune FunctionBD FastImmune Activation System快速免疫活化檢測系統(tǒng)快速免疫活化檢測系統(tǒng)lymphocyte Activation 4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulusBD BiosciencesImmune Function優(yōu)點優(yōu)點快速快速全程全程單核細胞單核細胞成熟粒細胞成

24、熟粒細胞原幼細胞，在紅細胞中不原幼細胞，在紅細胞中不表達；表達；SSC是側向角參數(shù)，反應細胞的顆粒度（成熟粒細胞是側向角參數(shù)，反應細胞的顆粒度（成熟粒細胞單核細胞單核細胞原幼細胞原幼細胞淋巴細胞）淋巴細胞）。目前，國際上采用CD45SSC設門（設門（Gating），可非常輕松地將白血病細胞與正常細胞分開，增加白血病免疫分型的準確性BD BiosciencesImmune FunctionCD45的臨床應用的臨床應用 用用CD45-SSC設門尋找異常細胞，將細胞分為設門尋找異常細胞，將細胞分為5個群個群體體，當幼稚細胞達70-80%時，即可大致估計AL的類型。骨髓成分復雜，各種大小和分化程度的細

25、胞均有，若不用CD45-SSC設門，我們檢測到的陽性細胞的百分率是以總細胞為分母來計算，當時以陽性細胞大于20%為界線，現(xiàn)在以CD45-SSC設門，排除了正常細胞的干擾，陽性細胞的百分率是以幼稚細胞為分母，因此再以陽性細胞20%作界線則不太合適了，所以，用CD45-SSC設門尋找異常細胞時，以定性比定量更重要。BD BiosciencesImmune Function正常人血液白細胞免疫表型散點圖正常人血液白細胞免疫表型散點圖BD BiosciencesImmune Function正常人血液細胞免疫表型正常人血液細胞免疫表型 T淋巴細胞：淋巴細胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/C

26、D8+、CD5+/CD7+，部分細胞，部分細胞CD（16+56）+，無，無CD4+CD8+雙雙陽性細胞陽性細胞 B淋巴細胞：淋巴細胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13- NK細胞：細胞：CD45+ 、CD（16+56）+/CD3- 單核細胞：單核細胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+ 中性粒細胞：中性粒細胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比CD33表達更高表達更高 嗜酸性粒細胞：嗜酸性粒細胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比比C

27、D33表達更高表達更高BD BiosciencesImmune Function正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖正常人骨髓有核細胞免疫表型散點圖BD BiosciencesImmune Function正常人骨髓細胞免疫表型正常人骨髓細胞免疫表型 淋巴細胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴細胞）；CD10-/CD19（B淋巴細胞） 單核細胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA- 粒系細胞: 原粒細胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR+/CD13+ 早幼粒

28、細胞及其以下各階段中性粒細胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，與原粒細胞或更幼稚細胞的表型有明顯差異 巨核細胞：CD45+、CD41+/CD61+ 幼紅細胞：CD45-、CD36+/GlyA+BD BiosciencesImmune FunctionT Lymphoid MaturationCD 3 CD 1a CD 2 CD 10 I II III IV CD 4/8 CD 45 CD 7 CD 34 103 102 101 T Lymphoid Maturation Antigen Expression CD 4 CD 8 CD 5

29、BD BiosciencesImmune FunctionB Lymphoid Maturation I II III IV B Lymphoid Maturation CD 10 FMC 7 CD 34 CD 45 CD 19 CD 20 CD 22 TdT CD 5 CD 23 Antigen Expression 103 102 101 BD BiosciencesImmune FunctionNeutrophil Maturation I II III IV V CD 45 CD 33 CD 11b CD 15 CD 34 HLA-DR CD 13 CD 16 Neutrophil M

30、aturation Antigen Density 103 102101 BD BiosciencesImmune FunctionMonocyte Maturation I II III 102 103 101 CD 33 CD 34 CD 11b CD 13 HLA-DR CD 14 Monocytoid Maturation Antigen Density CD 45 CD 15 BD BiosciencesImmune FunctionErythroid Maturation I II CD 71 Glycophorin CD 45 Antigen Expression 101 102

31、 103 Enucleation Erythroid Maturation BD BiosciencesImmune FunctionT-ALLT-ALL免疫表型免疫表型BD BiosciencesImmune FunctionB-ALLB-ALL免疫表型免疫表型 HLHLA A- -DRDR CD19CD19 CD10CD10 CD20CD20 CD22CD22 CD79CD79a a 其它其它 早期前早期前B B- -ALLALL + + + + - - - - C C+ +/ /M M- - + + 34/3834/38+ + 普通型普通型ALLALL + + + + + - - C C

32、- -/ /M M + + 34/3834/38 前前 B B- - ALLALL + + + + + + + + B B- -ALLALL + + + + - - + + + + + + KappaKappa+ +/ / LambdaLambda+ + * *CD10CD10+ +的的 ALLALL 療效好，有療效好，有 CD34CD34+ +病人往往合并病人往往合并 t(9,22),t(9,22),需強化治療需強化治療 成熟成熟BD BiosciencesImmune FunctionAMLAML免疫表型免疫表型BD BiosciencesImmune Function急性急性T T淋巴細

33、胞白血?。馨图毎籽。═-ALLT-ALL）骨髓細胞免疫分型散點圖骨髓細胞免疫分型散點圖BD BiosciencesImmune Function急性早幼粒細胞白血?。毙栽缬琢＜毎籽。ˋML-M3AML-M3）骨髓細胞免疫分型散點圖骨髓細胞免疫分型散點圖BD BiosciencesImmune FunctionFCMFCM在臨床血液學中的應用在臨床血液學中的應用能正確區(qū)別AML和ALL，并能進一步區(qū)別ALL中的T系和B系及亞型能正確鑒別AML中難于鑒別的M0、M6、M7診斷雙系或雙表型白血病發(fā)現(xiàn)僅表達個別次要非本系列相關抗原的白血病診斷少見疑難白血?。ㄈ鏗CL）BD Bioscien

34、cesImmune Function免疫分型免疫分型 對對下列情況具有重要意義下列情況具有重要意義 用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。用形態(tài)學、細胞化學染色不能肯定細胞來源的白血病。 形態(tài)學為急性淋巴細胞白血?。ㄐ螒B(tài)學為急性淋巴細胞白血病（ALLALL）或急性未分化白或急性未分化白血?。ㄑ。ˋULAUL）但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記。但缺乏特異性淋巴細胞系列抗原標記。 混合性白血病?；旌闲园籽?。 部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒- -單核細胞和單單核細胞和單核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。核細胞白血病的鑒別尚有一定困難。 慢性淋巴細胞白

35、血病。慢性淋巴細胞白血病。 微小殘留白血病。微小殘留白血病。BD BiosciencesImmune Function陣發(fā)性血紅蛋白尿陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH=陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細胞膜的獲得性缺陷，對激活陣發(fā)性血紅蛋白尿是由于紅細胞膜的獲得性缺陷，對激活補體異常敏感的一種慢性血管內溶血補體異常敏感的一種慢性血管內溶血=患者體內紅細胞呈不均一性患者體內紅細胞呈不均一性=利用流式細胞術和利用流式細胞術和CD55CD55和和CD59CD59單克隆抗體，對單克隆抗體，對PNHPNH患者紅細患者紅細胞、粒細胞和血小板進行分析，證實存在膜蛋白表達缺陷胞、粒細胞和血小板進行分析，證實存在膜蛋白表達缺陷的

36、血細胞，并計算缺陷細胞在全血中所占比例的血細胞，并計算缺陷細胞在全血中所占比例BD BiosciencesImmune Function陣發(fā)性血紅蛋白尿陣發(fā)性血紅蛋白尿PNH=正常人紅細胞、粒細胞和血小板正常人紅細胞、粒細胞和血小板CD59表達完全陽性表達完全陽性=PNH患者血細胞分為三型：患者血細胞分為三型：型：型：CD59表達完全陽性，熒光強度與正常人陽性峰熒光表達完全陽性，熒光強度與正常人陽性峰熒光強度接近強度接近型：型：CD59表達部分陽性，熒光強度介于表達部分陽性，熒光強度介于型與型與型之間型之間 型：型：CD59表達完全陰性表達完全陰性=分析分析PNH患者各型細胞所占百分比，評估疾

37、病的嚴重程度患者各型細胞所占百分比，評估疾病的嚴重程度BD BiosciencesImmune Function紅細胞紅細胞 PNH分析分析 A 正常人正常人B D 病人病人BD BiosciencesImmune Function網織紅細胞計數(shù)網織紅細胞計數(shù)Retic-COUNT= 操作快速、簡便操作快速、簡便= 計數(shù)精確計數(shù)精確= 低水平網織紅細胞檢測低水平網織紅細胞檢測= 網織紅細胞成熟指數(shù)網織紅細胞成熟指數(shù)IRF臨床應用：臨床應用：= 預測骨髓移植效果預測骨髓移植效果= 判斷貧血發(fā)病原因判斷貧血發(fā)病原因= 評價生物制劑的療效評價生物制劑的療效BD BiosciencesImmune F

38、unction網織血小板的檢測 人們最先于1969年指出網織血小板是一類能被新亞甲藍深染的血小板。如網織紅細胞一樣它們是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人們發(fā)現(xiàn)網織血小板為骨髓新釋放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中網織血小板的多少，可以間接反映骨髓巨核系造血的活躍程度。并能用常規(guī)的檢測網織紅細胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式細胞儀上方便、準確地檢測。BD BiosciencesImmune Function臨床應用臨床應用正常人網織紅細胞正常人網織紅細胞1.07% 1.07% 缺鐵性貧血（缺鐵性貧血（IDA )4.78%IDA )4.78%BD Biosciences

39、Immune Function臨床應用臨床應用再障（再障（AA)0.03% AA)0.03% 溶血性貧血（溶血性貧血（HA)29.33%HA)29.33%BD BiosciencesImmune Function造血干細胞計數(shù)造血干細胞計數(shù) 造血干細胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細造血干細胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血細胞。胞。 造血干細胞的特征是：造血干細胞的特征是： 大小（大?。‵SCFSC）和顆粒度（和顆粒度（SSCSSC）介于成熟淋巴細胞、大淋介于成熟淋巴細胞、大淋巴細胞相似巴細胞相似 細胞內含有較多核酸物質細胞內含有較多核酸物質 CD34 CD34表達弱陽性或

40、強陽性表達弱陽性或強陽性 CD45 CD45表達弱陽性表達弱陽性 在干細胞移植時需要做造血干細胞絕對計數(shù)在干細胞移植時需要做造血干細胞絕對計數(shù)BD BiosciencesImmune Function造血干細胞計數(shù)造血干細胞計數(shù)BD BiosciencesImmune Function干細胞移植應用干細胞移植應用 血液系統(tǒng)病癥血液系統(tǒng)病癥: : L&L , L&L , 再生障礙想貧血再生障礙想貧血 惡性腫瘤惡性腫瘤: :乳腺癌、兒童神經母細胞瘤、卵巢癌乳腺癌、兒童神經母細胞瘤、卵巢癌 遺傳性異常病變遺傳性異常病變 免疫缺陷免疫缺陷: :血紅蛋白病血紅蛋白病BD BiosciencesImmun

41、e Function血小板檢測血小板檢測=血小板膜糖蛋白復合物診斷血小板缺陷性疾病血小板膜糖蛋白復合物診斷血小板缺陷性疾病CD41-CD61復合物：血小板無力癥復合物：血小板無力癥CD42a-CD42b 復合物：巨大血小板癥復合物：巨大血小板癥=血小板活化的相關檢查血小板活化的相關檢查血小板顆粒膜糖蛋白，如血小板顆粒膜糖蛋白，如CD62，CD63血小板膜糖蛋白活化表位，如血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1=血小板減少性疾病血小板減少性疾病血小板自身抗體檢測血小板自身抗體檢測網織血小板的檢測網織血小板的檢測=血小板脫落微粒的檢測血小板脫落微粒的檢測BD BiosciencesImmune Fu

42、nction血小板活化血小板活化 IIb/IIIa復合物（復合物（CD41/CD61）在所有靜止和在所有靜止和活化的血小板上都有表達活化的血小板上都有表達 血小板活化時發(fā)生的改變血小板活化時發(fā)生的改變IIb/IIIa復合物發(fā)生變構，表達復合物發(fā)生變構，表達PAC-1血小板內顆粒釋放，分泌促進凝血反應的物質，這血小板內顆粒釋放，分泌促進凝血反應的物質，這時表達時表達CD62PBD BiosciencesImmune Function CD61CD61圈血小板門圈血小板門 PAC-1/PAC-1/ 1 1：陰性對照，陰性對照，靜止的血小板靜止的血小板 PAC-1/CD62PPAC-1/CD62P：

43、試驗管，試驗管，ADPADP刺激下活化的血小刺激下活化的血小板，報告血小板活化板，報告血小板活化百分含量百分含量血小板活化血小板活化BD BiosciencesImmune Function血小板活化血小板活化 直接測量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應性直接測量循環(huán)血小板活化狀態(tài)與反應性 可直接測定凝血酶等誘導劑活化的血小板可直接測定凝血酶等誘導劑活化的血小板 血小板活化與臨床的關系：監(jiān)測血小板活化相關疾病過程，血小板活化與臨床的關系：監(jiān)測血小板活化相關疾病過程，抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預測血栓形成抗血小板藥物療效或治療藥物的影響，預測血栓形成 心肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關心

44、肌缺血（心絞痛、心肌梗塞）與血小板活化有關 預測冠狀動脈成形術后發(fā)生急性缺血事件的危險性預測冠狀動脈成形術后發(fā)生急性缺血事件的危險性 缺血性腦血管病與血小板活化有關缺血性腦血管病與血小板活化有關 子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加子癇前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治療療效監(jiān)測抗血小板治療療效監(jiān)測BD BiosciencesImmune Function腦栓塞病人血小板活化檢測腦栓塞病人血小板活化檢測 A CD61-SSC設分析門設分析門 B 陰性對照陰性對照 C 治療前治療前 PAC-I 27.74% CD62P 15.86% D 溶栓后溶栓后 PAC-I 9.13%

45、 CD62P 4.12% BD BiosciencesImmune Function血小板無力癥血小板無力癥（CD41缺陷，缺陷，PAC-I下調）下調）BD BiosciencesImmune Function巨血小板癥巨血小板癥 藍藍陰性對照陰性對照 綠綠正常人正常人 紅紅病人病人 CD41表達上調表達上調 CD42a/CD42b缺失缺失BD BiosciencesImmune Function血小板自身抗體血小板自身抗體 ITP病人病人BD BiosciencesImmune FunctionDNA細胞周期分析細胞周期分析細胞周期細胞周期0 200 400 600 8001000DNA含量

46、含量細細胞胞數(shù)數(shù)量量BD BiosciencesImmune FunctionDNA細胞周期分析參數(shù)細胞周期分析參數(shù)=DNA倍體性倍體性Ploidy 細胞內染色體細胞內染色體DNA含量含量=二倍體二倍體Diploid 正常體細胞內染色體正常體細胞內染色體DNA含量含量=DNA指數(shù)（指數(shù)（DI） 測定標本的測定標本的G0/G1期細胞期細胞DNA含量含量 與同種系正常細胞的與同種系正常細胞的G0/G1期細胞期細胞 DNA含量的比值，表示細胞倍體性含量的比值，表示細胞倍體性=S期含量期含量SPF S期細胞占總周期細胞的比例期細胞占總周期細胞的比例=增殖指數(shù)增殖指數(shù)PI 增殖細胞占總周期細胞的比例增殖

47、細胞占總周期細胞的比例=CV G0/G1期細胞期細胞DNA含量變異系數(shù)含量變異系數(shù)BD BiosciencesImmune FunctionDNADNA分析的臨床意義分析的臨床意義 DNADNA分析診斷腫瘤分析診斷腫瘤 DNADNA非整倍體細胞峰或突出的四倍體細胞峰非整倍體細胞峰或突出的四倍體細胞峰 S S期細胞含量期細胞含量10-15%10-15% DNADNA倍體分析：倍體分析： 結合臨床病理的形態(tài)學診斷，對一些惡性腫瘤進行早期診斷，跟結合臨床病理的形態(tài)學診斷，對一些惡性腫瘤進行早期診斷，跟蹤隨訪和早期治療，提高治愈率和生存率。尤其對一些細胞抽吸蹤隨訪和早期治療，提高治愈率和生存率。尤其對

48、一些細胞抽吸物、體液、組織液、灌洗液脫落細胞的分析，意義尤為重要。物、體液、組織液、灌洗液脫落細胞的分析，意義尤為重要。 研究各期細胞比率與腫瘤組織分級的關系。研究各期細胞比率與腫瘤組織分級的關系。 提示腫瘤患者預后。提示腫瘤患者預后。 增殖狀態(tài)分析：增殖狀態(tài)分析：反映了腫瘤的生長速度和侵襲性，判斷臨床治療方法的療效或用于探反映了腫瘤的生長速度和侵襲性，判斷臨床治療方法的療效或用于探討新藥新方法的作用機理和療效。討新藥新方法的作用機理和療效。BD BiosciencesImmune FunctionFCMFCM在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用在腫瘤早期診斷和鑒別診斷中的作用 DNA非整倍體的出

49、現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個重要標志個重要標志 在淋巴瘤（在淋巴瘤（L&L）病理形態(tài)學不能做出診斷前可提供確病理形態(tài)學不能做出診斷前可提供確切診斷信息切診斷信息 DNA非整倍體的交界瘤應按惡性對待非整倍體的交界瘤應按惡性對待 形態(tài)學表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能形態(tài)學表現(xiàn)良性的腫瘤出現(xiàn)非整倍體提示惡變可能 DNA指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標指數(shù)可作為判斷間葉組織腫瘤良惡性的輔助指標BD BiosciencesImmune FunctionFCM參數(shù)的預后意義參數(shù)的預后意義 DNA及倍體分析在某些腫瘤有預后價值：及倍體分析在

50、某些腫瘤有預后價值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、皮膚黑色素瘤膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、皮膚黑色素瘤 S期比率與腫瘤組織學分級密切相關：期比率與腫瘤組織學分級密切相關：肺癌、乳腺癌、肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腦卵巢癌、直腸癌、甲狀腺癌、睪丸癌、腦型星形細胞瘤型星形細胞瘤BD BiosciencesImmune Function細胞凋亡細胞凋亡PI分析分析PI - Fluorescence# Events凋亡細胞凋亡細胞正常正常G0/G1期細胞期細胞BD BiosciencesImmune Function128正常正常DNA倍體分析倍體

51、分析0 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300BD BiosciencesImmune Function1290 200 400 600 8001000PI FluorescenceCounts0 75 150 225 300DNA異倍體異倍體BD BiosciencesImmune Function秋水仙素處理秋水仙素處理羅田甜柿羅田甜柿獲得獲得12 倍體再生倍體再生植株植株BD BiosciencesImmune Function正常人骨髓細胞正常人骨髓細胞DNADNA周期分析（周期分析（ModFITModFIT）B

52、D BiosciencesImmune Function132腫瘤細胞腫瘤細胞SPF(S期含量期含量)腫瘤細胞腫瘤細胞( (單克隆單克隆) )(14.18%)(14.18%)正常骨髓細胞正常骨髓細胞(2.93%)(2.93%)腫瘤細胞腫瘤細胞( (多克隆多克隆) )(28.52%)(28.52%)BD BiosciencesImmune Function乳腺癌及乳腺良性病變的乳腺癌及乳腺良性病變的流式檢測對比分析流式檢測對比分析細胞凋亡細胞凋亡BD BiosciencesImmune Function細胞凋亡的分析細胞凋亡的分析 細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的過程細胞凋亡與細胞壞死是兩個不同的

53、過程 細胞凋亡的主要檢查手段細胞凋亡的主要檢查手段形態(tài)學檢查形態(tài)學檢查DNA Ladders實驗實驗流式細胞儀檢查流式細胞儀檢查 與凋亡相關的病理過程（與凋亡相關的病理過程（HIV、自身免疫性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤）腫瘤） 研究凋亡調控因素如癌基因、細胞因子及藥物等對研究凋亡調控因素如癌基因、細胞因子及藥物等對凋亡的影響凋亡的影響B(tài)D BiosciencesImmune Function凋亡檢測凋亡檢測-每一步都有檢測試劑盒每一步都有檢測試劑盒BD BiosciencesImmune Function細胞凋亡檢測細胞凋亡檢測 凋亡相關細胞膜變化的檢測 凋亡相關線粒體變化的檢測 凋亡相關酶活

54、性的檢測 凋亡相關DNA片段的檢測 凋亡相關基因蛋白的檢測BD BiosciencesImmune Function細胞膜變化的檢測細胞膜變化的檢測早期凋亡早期凋亡v磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，DNA不斷裂v線粒體膜電位變化的檢測v細胞內氧化還原狀態(tài)改變的檢測BD BiosciencesImmune Function細胞膜變化的檢測細胞膜變化的檢測磷脂酰絲氨酸（PS）的檢測早期凋亡BD BiosciencesImmune Function早期凋亡早期凋亡PS檢測及結果判斷檢測及結果判斷 早期凋亡特征磷脂膜（PS）外翻，但是細胞膜保持完整性，因此PI染色為陰性DNA沒有發(fā)生斷裂 結果判定早期凋亡：

55、AnnexinV+/PI-死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+正常的活細胞： AnnexinV-/PI-BD BiosciencesImmune FunctionANNEXIN-V/PI檢測檢測BD BiosciencesImmune Function142ANNEXIN-V/PI檢測檢測control處理處理16h后后處理處理24h后后BD BiosciencesImmune Function線粒體水平檢測相關產品線粒體水平檢測相關產品 線粒體膜電位的檢測線粒體膜電位的檢測BD Mitoscreen（JC-1）Cat# 551302 25tests 原理：熒光染料JC-1在活細胞中

56、以聚體形式存在于線粒體基質上產生紅色熒光，在凋亡細胞中，以單體形式存在不與線粒體結合而產生綠色熒光。 操作簡單，試劑直接加入細胞中，20分鐘后檢測BD BiosciencesImmune FunctionJC-1 檢測結果流式圖檢測結果流式圖BD BiosciencesImmune Function凋亡相關酶活性的檢測凋亡相關酶活性的檢測 背景知識背景知識細胞凋亡過程中，胞內主要蛋白通常被降解，調節(jié)這一過程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶）Caspase 3是參與DNA維護和調控細胞的組分裂解 Caspase 3激活=細胞凋亡檢測原理：是通過特異性抗體檢測全長或者剪切后的cas

57、pase活性。BD BiosciencesImmune FunctionCBA分析凋亡信號通路分析凋亡信號通路 YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYDETECTORANTIBODYLYSATE ORSUPERNATANTBEADSYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYWashRead on Flow CytometerActive Caspase-3Bcl-2Cleaved PARP一系列熒光強度不同的微球一系列熒光強度不同的微球包被有特異性捕獲抗體，與包被有特異性捕獲抗體，與待測樣本和檢測抗體孵育后，待測樣本和檢測

58、抗體孵育后，形成形成“三明治三明治”復合物復合物BD BiosciencesImmune FunctionActive Caspase-3Bcl-2Cleaved PARPBcl-2、Caspase-3、PARP構成的凋亡調控通道主要蛋白，對于構成的凋亡調控通道主要蛋白，對于凋亡研究具有特殊的意義凋亡研究具有特殊的意義(CBA Human apoptosis kit 557816)BD BiosciencesImmune Function流式檢測活性流式檢測活性Caspase-3Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破膜液，洗滌液和PE標記抗

59、體；細胞需要固定破膜，然后才能染色BD BiosciencesImmune Function149化療前后胃癌活檢標本中化療前后胃癌活檢標本中Caspase-3+細胞細胞化療前化療前(3.49%)化療后化療后(94.86%)BD BiosciencesImmune FunctionDNA水平的凋亡檢測水平的凋亡檢測-晚期檢測晚期檢測 凋亡晚期DNA內切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段檢測方法 Tunel流式法，通過在核酸片段末端標記，跟傳統(tǒng)相比優(yōu)點在于可以計算凋亡百分比 DNA Ladder分析，但凋亡細胞太少時作不到BD BiosciencesImm

60、une FunctionTUNEL簡介簡介 TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）BD BiosciencesImmune Function152DNA斷裂點檢測斷裂點檢測BD BiosciencesImmune FunctionTUNEL法流式分析凋亡結果法流式分析凋亡結果BD BiosciencesImmune Function154BrdU-FITC/PI檢測檢測S期期BD BiosciencesImmune Function凋亡檢測總結凋亡檢測總結檢測水平檢測水平 細胞細胞