輔助生殖PGD與PGS技術

1、植入前遺傳學診斷及篩查技術植入前遺傳學診斷及篩查技術臨床應用臨床應用譚躍球譚躍球,中南大學生殖與干細胞工程研究所中南大學生殖與干細胞工程研究所*人類干細胞國家工程研究中心人類干細胞國家工程研究中心 * 中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院內容概要內容概要植入前遺傳學診斷與篩查的概念植入前遺傳學診斷與篩查的概念PGD檢測流程檢測流程染色體易位攜帶者的染色體易位攜帶者的PGD基于全染色體篩查的基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)單基因病單基因病PGD背景介紹背景介紹適應征及技術進展適應征及技術進展臨床應用臨床應用植入前診斷植入前診斷 植入前遺傳植入前

2、遺傳學診斷和篩學診斷和篩查的概念查的概念植入前遺傳學植入前遺傳學診斷的臨床應診斷的臨床應用用植入前遺傳學植入前遺傳學篩查的臨床應篩查的臨床應用用一、一、植入前遺傳學診斷與篩查的概念植入前遺傳學診斷與篩查的概念PGD (Preimplantation Genetic Diagnosis)：又稱為孕前診斷(preconception genetic diagnosis, PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技術對顯微活檢的胚胎細胞進行染色體異?；蜻z傳性疾病進行診斷，選擇正常的胚胎植入。第一部分 植入前遺傳學診斷和篩查的概念第三代試管嬰兒？PGD/PGS是以ICSI-ET為基礎，結合顯微操作技術

3、和分子生物學研究的而發(fā)展起來的。PGDPGD的意義的意義nPGD可在孕前階段杜絕X-連鎖隱性遺傳病、染色體病和基因病患兒的妊娠，避免人工流產(chǎn)終止異常妊娠給廣大婦女的身心痛苦。n理論上還可減少遺傳病在人群中的遺傳負荷。nPGD是遺傳性病防治的重要手段，是Edwards獲諾貝爾獎的理由之一。植入前診斷植入前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷PGDPGD發(fā)展歷程發(fā)展歷程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在顯微操縱下對兔囊胚進行活檢，取出少量滋養(yǎng)外胚層細胞分析染色質來選擇雌性胚胎。1990年Handyside報道了世界第一例植入前性別診斷嬰兒的出生，開創(chuàng)了產(chǎn)前診

4、斷的新紀元。1994年，Munne用FISH技術，在植入前診斷胚胎染色體非整倍體及性別獲得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和單鏈多態(tài)性分析技術，對單細胞進行視網(wǎng)膜母細胞瘤的易感性分析，在植入前確定胚胎未來發(fā)生腫瘤的可能性大小，從而為PGD應用于人類胚胎基因表達的研究開辟了嶄新的途徑。2001年Verlinsky有報道對胚胎進行HLA選型以便于骨髓移植。進一步拓寬了該技術的研究和應用。u染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等）染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等） 染色體異常的篩查染色體異常的篩查u單基因病（一般的單基因病、性連鎖遺傳病等）單基因?。ㄒ话愕膯位虿　⑿赃B鎖遺傳病等）

5、單基因異常的篩查單基因異常的篩查 PGDPGD期望解決的問題期望解決的問題 植入前遺傳學篩查的概念植入前遺傳學篩查的概念u胚胎植入前遺傳學篩查（Preimplantation Genetic Screening, PGS），是指胚胎植入著床之前，對早期胚胎進行染色體數(shù)目和結構異常的檢測，通過一次性檢測胚胎23對染色體的結構和數(shù)目，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低多胎妊娠。uPGS目前特指針對染色體數(shù)目異常，即非整倍體；uPGS理論上將來可以應用于單基因病。uPGS是低風險人群，夫妻雙方的染色體或者基因是正常的。二、二、PGDPGD檢測流程檢測流程卵子精子I

6、CSI活檢取樣胚胎冷凍遺傳學檢測選擇胚胎胚胎植入遺傳咨詢知情談話FISHCHIPPCRMPSIVF臨床促排卵極體活檢活檢第一極體和第二極體，檢測母源性的染色體結構異?；蚧蛲蛔?，以及減數(shù)分裂異常造成的染色體非整倍體。優(yōu)點：對卵母細胞的發(fā)育沒有影響。 缺點：只能檢測母源性的染色體異常； 不能檢測受精后發(fā)生的染色體異常； 可檢測細胞數(shù)少，易發(fā)生檢測失敗。（一）活檢技術選擇卵裂球活檢 在D3胚胎發(fā)育到6-10細胞時活檢出1-2個卵裂球，進行遺傳學診斷。 優(yōu)點：最成熟最常用的活檢方法。 缺點：活檢出卵裂球后降低了胚胎的發(fā)育潛能； 細胞數(shù)少，容易發(fā)生檢測失敗(細胞固定及 雜交失敗，擴增失敗，ADO等)。

7、 囊胚活檢 D5-6天胚胎發(fā)育到囊胚階段后，活檢囊胚滋養(yǎng)層細胞進行遺傳學檢測。 優(yōu)點：對滋養(yǎng)層細胞的活檢不影響將要發(fā)育成胎 兒的內細胞團的發(fā)育； 可檢測細胞數(shù)較多，檢測失敗概率降低。 對SNP-array而言，能大大減低費用。 缺點：大部分情況下（除非可以在24小時之內出結果） 需將活檢后的囊胚冷凍保存。 染色體易位(Translocation):一種染色體結構異常，一條染色體的一段轉移到同一條或另一條染色體上，導致易位片段基因的重排 (Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010)易位是一種常見的染色體結構重排異常，新生兒中發(fā)病率0.2%.(

8、Stern et al., 1999)臨床上兩種類型的易位最常見：羅氏易位和相互易位一、染色體易位攜帶者的一、染色體易位攜帶者的FISH-PGDFISH-PGD第二部分 植入前遺傳學診斷的臨床應用相互易位：兩條非同源染色體之間進行片段的交換，常常是整個末端的斷裂并互換。- Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010著絲粒著絲粒Derivative chromosome 4Derivative chromosome 20羅氏易位：這種類型的易位是在兩組端著絲粒染色體 (D組 and G 組, 染色體13-15, 21-22)間進行交換，往往在靠

9、近著絲粒的區(qū)域斷裂重組，導致易位的兩條染色體隨體的丟失-Thompson&Thompson GENETICS IN MEDICINE 2010CentromereCentromereChr21Chr14der(14;21)易位攜帶者的健康風險 平衡的染色體易位個體往往沒有明顯的疾病表型，稱為“易位攜帶者”。但卻多存在生殖的障礙； 易位攜帶者主要的遺傳風險起源于配子減數(shù)分裂的過程，攜帶者可產(chǎn)生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以導致流產(chǎn)，出生染色體異常患兒引起出生缺陷（特別是智力障礙），并可導致不孕和不育；平衡易位攜帶者的遺傳風險平衡易位攜帶者的遺傳風險四射體對于相互易位攜帶者，配子分離

10、模式理論上產(chǎn)生18種配子類型：包括1種正常, 1種平衡易位型 和16 種不平衡分離的配子。normalbalanceddisomy 21disomy 21nullisomy 21Nullisomy 14羅氏易位產(chǎn)生6種配子類型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4種不平衡分離配子，這類不平衡配子往往導致流產(chǎn)。羅氏易位的遺傳風險羅氏易位的遺傳風險染色體易位和生殖健康反復流產(chǎn)： 3-4%的反復流產(chǎn)患者存在染色體結構異常 相互易位占 61%羅氏易位占 16% - Clifford et al. 1994; Franssen et al. 2005我院數(shù)據(jù)：共發(fā)現(xiàn)1425 易位攜帶者，其中相互易位 7

11、6.6% (1094/1428)，羅氏易位 23.4% (334/1428).反復流產(chǎn) 75.2% (1071/1425)嚴重男性因素 17.2% (245/1425)卵巢功能下降1.2% (18/1425) PGD用于易位攜帶者治療的歷史 產(chǎn)前診斷移植以來被有效的用來避免染色體異?；純撼霈F(xiàn)，但是診斷異常后流產(chǎn)給婦女帶來心理和生理的負擔，并可能導致生育障礙； 第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色體特異性DNA擴增技術成功對人胚胎性別進行診斷并獲得妊娠。- Handyside, AH. Nature,1990 1998年，F(xiàn)ISH技術被用于易位攜帶者的PGD診斷并獲得成功 - Conn CM et

12、 al. 1998; Munn S et al.1998;Pierce KE et al. 1998 熒光原位雜交(FISH)熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization, FISH）是以利用熒光標記的特定基因或染色體片段作為探針，與染色體特定序列DNA分子雜交，可以確定分裂細胞或間期細胞對應染色體序列的位置及數(shù)目，以此檢測染色體數(shù)目或結構異常。FISH技術有以下幾個特點： 安全、快速、靈敏度高； 探針能較長時間保存； 多色標記，簡單直觀； 可用于中期染色體及間期細胞的分析人類干細胞國家工程研究中心 * 中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院熒光原位雜交(FISH

13、-PGD)技術流程歐洲生殖與胚胎學協(xié)會(ESHRE) -FISH-PGD實踐指南ESHRE要求： 實驗室胚胎活檢技術； 遺傳室細胞核玻片固定基礎，并對固定程序有詳細要求； 選擇合適的探針，對平衡易位患者需提前做好外周血淋巴細胞中期分裂相預實驗；歐洲生殖與胚胎學協(xié)會(ESHRE) -FISH-PGD實踐指南細胞核玻片固定程序：活檢卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋養(yǎng)層細胞(TE)；低滲液滴中處理5min；在圓圈標記對應的玻片正面部位加固定劑(Tween-20/HC1)，將低滲好的細胞轉至固定劑液滴中；待固定劑完全干燥后，可放在-20備用，或者直接進入下一步；60烤片，30min-3h；RNase消化，

14、蠟膜封片，濕盒中37度孵育30min-1h；將RNase處理后的玻片依次過2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脫水；將玻片放入變性液中，75預變性3-5min（目的是將DNA雙鏈打開）；玻片依次過75%、90%、100%酒精梯度脫水，2min/濃度，完全風干；探針75變性5min；將探針加到風干的玻片樣本上，雙層蠟膜封片，置于濕盒中，37過夜（雜交4-6h）；玻片依次過洗滌液WS1三缸(45)，WS2兩缸（室溫），WS3一缸（室溫）；75%、90%、100%酒精梯度脫水，風干；加入DAPI，處理3min后，直接熒光顯微鏡下觀察。歐洲生殖與胚胎學協(xié)會(ESHRE) -FISH-PGD實

15、踐指南平衡易位探針選擇和淋巴細胞預實驗探針的選擇：商業(yè)探針的使用需通過QC質控；自制探針也需要進行合適的QC/QA鑒定。所有探針在應用到臨床檢測前都需經(jīng)過細胞雜交預實驗，評估特異性、亮度及彌散度；對于所有平衡易位攜帶者，需要取用對應易位區(qū)段合適的探針以及探針組合對夫妻雙方淋巴細胞中期分裂相及間期核進行預實驗檢測： 至少分析20個中期分裂相，確保探針位置在正確的染色體上，易位片段能被正確指示； 至少分析100個間期核，評估特異性、亮度及彌散度。歐洲生殖與胚胎學協(xié)會(ESHRE) -FISH-PGD實踐指南著絲粒探針位點特異性探針亞端粒探針一例相互易位攜帶者PGD，核型為： 46,XY,t(6;1

16、0)(q13; p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者舉例：平衡易位攜帶者預實驗結果：外周血淋巴細胞培養(yǎng)制備的一個中期分裂相和一個間期核FISH探針：易位片段的亞端粒探針（6q136qter，Tel 6q SpectrumOrange；10p1510pter， Tel 10p SpectrumGreen）和10號著絲粒片段的著絲粒探針（10p1510qter,blue CEP10 alpha satellite SpectrumAqua）。一例相互易位攜帶

17、者PGD，核型為： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者舉例：平衡易位攜帶者FISH-PGDFISH-PGD檢測結果：檢測結果：不同通道濾光片下觀察到的細胞核中的FISH探針熒光信號。a胚胎細胞核中每個探針均為2個雜交信號提示每個探針位點均為2個拷貝，表示易位相關的染色體組成為正常或平衡易位。b胚胎核中均為1個紅色信號、3個綠色信號和2白色信號，分別提示6號易位片段為一個拷貝、10號易位片段為3個拷貝和10號著絲粒片

18、段為2個拷貝，表示該胚胎為臨近-1分離形成的6q136qter單體和10p1510pter三體不平衡產(chǎn)物。臨近-1分離模式圖Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good quality embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Biopsied embryo (m

19、edian(range)10 (1-30) 9 (1-24)Biopsied embryos27091420 Normal / balanced17.5% (475) 31.8% (451) Unbalanced69.5% (1882) 56.3%(799) Testing failure13.0% (352)12.0% (170)Cancelled cycles (rate)82(31.9%)24(16.1%)2006-2011 年我院易位攜帶者進行d3 FISH-PGD結果正?；蚱胶庖孜慌咛ケ壤?，尤其是相互易位Reciprocal translocation carriersRobert

20、sonian translocation carriersBiopsied cycles257149Oocyte number14.536.5313.816.83Number of good quality embryos on D54.61Number of good blastocysts on D50.931.501.041.71Transferred embryo (median(range)2 (1-3) 2 (1-3)Cycles accepted transfer175125Clinical pregnancy rate per biopsied cycl

21、e33.5% (68/257) 32.2% (48/149) Clinical pregnancy rate per ET38.9% (68/175) 38.4% (48/125) Implantation rate32.2% (86/267) 28.1%(62/221)Miscarriage rate16.2% (11/68)16.7% (8/48)Live birth rate per Biopsy22.2% (57/257)26.8% (40/149)Health babies/delivered babies52/5235/352006-2011 年我院易位攜帶者進行d3 FISH-P

22、GD結果單卵裂球單卵裂球FISHFISH幾種風險可能導致沒有準確結果幾種風險可能導致沒有準確結果：雜交背景干擾太強的情況雜交雜質信號干擾的情況雜交失敗未見信號的情況固定或重雜交細胞核丟失的情況囊胚FISH相對卵裂期FISH更有優(yōu)勢？1.活檢細胞數(shù)的增多有利于信號的判定；2.直觀方便檢出胚胎嵌合體。胚胎胚胎序號序號Tel 7p信信號數(shù)號數(shù)Tel 8q信號數(shù)信號數(shù)CEP8結果提示結果提示1163626異常2173727異常3153525異常4272727正?；蚱胶庖孜徽；蚱胶庖孜?143424異常6272727正?；蚱胶庖孜徽；蚱胶庖孜?173727異常814342異常9163626異常102

23、43224222422異常11321222異常囊胚囊胚FISH-PGDFISH-PGD舉例：平衡易位舉例：平衡易位FISH面臨的挑戰(zhàn)不同實驗室不同實驗室FISH檢出率和準檢出率和準確率波動較大確率波動較大著床率和妊娠率隨著著床率和妊娠率隨著FISH檢檢測錯誤率的上升而降低測錯誤率的上升而降低FISHFISH技術局限技術局限FISH技術僅能檢測有限的染色體，因此患者經(jīng)FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未檢測的非整倍體異常妊娠而引發(fā)的早期流產(chǎn)或出生缺陷。FISH-PGD早期流產(chǎn)胚胎進行比較基因組雜交檢測，檢出5號染色體重復。需要全染色體篩查為基礎的PGD技術？二、基于全染色體篩查的二、基

24、于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)PGD(PGD-CCS)PGD with Comperhansive Chromosome Screening，避免了，避免了FISH僅能檢測少數(shù)染僅能檢測少數(shù)染色體的限制，采用全染色體篩查的方式對易位或倒位攜帶者進行色體的限制，采用全染色體篩查的方式對易位或倒位攜帶者進行PGD診斷，同診斷，同時排除其它染色體非整倍體異常。時排除其它染色體非整倍體異常。易位攜帶者的SNP-PGD臨床情況總結1. 囊胚+SNP活檢分析增加PGD診斷的準確性2. 基于基于SNP的的PGD-CCS可以檢測出除易位染色體外其他染色體的異常，減少流產(chǎn)可以檢測出除易位染色體外其他染

25、色體的異常，減少流產(chǎn)易位攜帶者SNP-PGD的臨床結局總結0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%100.00%120.00%202122232425262728293031323334353637383940414344新發(fā)生異常率新發(fā)生異常率新發(fā)生異常率共分析共分析360 個患者年齡在個患者年齡在2044歲之間，平均新發(fā)生異常的幾率是歲之間，平均新發(fā)生異常的幾率是27.2% Age是否是否SNP-PGD需要用于每個易位攜帶者需要用于每個易位攜帶者?Reciprocal translocation carriersRobertsonian translocation car

26、riersD5-FISHSNP arrayD3-FISHD5-FISHSNP arrayD3-FISHTransfer cycles29771751238125Clinical pregnancy rate per ET55.2%(16/29)63.7%(49/77)38.9% (68/175) 83.3%(10/12)63.2%(24/38)38.4% (48/125) Implantation rate40%(16/40)59.5%(49/97)32.2% (86/267) 59.1%(10/17)54.9%(28/51)28.1%(62/221)Miscarriage rate25.0%

27、(4/16)8.16%(4/49)16.2% (11/68)0(0/10)12.5%(3/24)16.7% (8/48)Comparison D5-FISH and d5-SNP results in translocation carriers 40種代謝疾病，可覆蓋大規(guī)模人群建立國家和地區(qū)發(fā)病率數(shù)據(jù)庫 確認診斷疾病，特別是稀有疾病疾病亞型分類，或鑒別相似表型的不同疾病，進行有效干預 拯救嬰兒生命，使他們更健康減少對社會和家庭帶來的負擔減少出生缺陷指導意義指導意義Next Generation Sequencing(NGS)NGS-PGD/PGS技術路線WGASNParray檢測NGS檢測平

28、行實驗已知樣本非整倍體單個胚胎干細胞正常核型淋巴細胞FISH-PGD診斷為異常的胚胎重活檢淋巴細胞全基因組擴增獲得產(chǎn)物臨床并行實驗SNParray檢測NGS檢測建立平臺評估檢出率，準確度等指標，芯片與測序相當方法學的建立2X 測序深度能覆蓋60%人類基因組，10X深度能覆蓋90%人類基因組。等位基因脫扣ADO率約5-20%；平均值為4%，近著絲粒區(qū)段發(fā)生ADO率相對較高。堿基對檢出誤差：C:GT:A.Before & after GC bias correction專為單細胞測序 CNV 分析而設置的算法，矯正WGA產(chǎn)生的GC偏差，使結果更接近基因組DNA測序水平。 NGS vs SN

29、Parray 在非整倍體與16M缺失重復的比較方法學的建立技術特點 高通量，高準確度：使用新一代測序技術，克服PCR技術通量低的缺點。 不容易產(chǎn)生漏檢：可對所有23對染色體進行檢測。FISH技術由于每一輪雜交的探針數(shù)目是有限的，無法對所有23對染色體進行檢測，容易產(chǎn)生漏檢。 自動化程度高：測序數(shù)據(jù)通過SOAP比對，SegSeq軟件進行分析我們前期已建立了FISH、SNP芯片技術檢測染色體異常，并與華大合作建立了單細胞水平的全基因組測序。2012年8月誕生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女嬰。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作三、單基因病PGDESHRE PGD工作組對擴增基礎的PGD的

30、最佳實踐指南 單基因病PGD的流程 1. 預備實驗 1.1 基因診斷 1.2 設計個性化方案 1.3 構建單體型 1.4 基因組水平實驗 1.5 淋巴細胞/廢棄胚胎細胞水平實驗 2. 臨床實驗 2.1 臨床前預備實驗 2.2 臨床診斷 3. 產(chǎn)前診斷1 1、等位基因脫扣（allele dropout, ADOallele dropout, ADO） 影響PGDPGD準確性的主要因素之一，其發(fā)生率約為5-20%5-20%?？蓪е屡咛サ恼`診。導致ADOADO的原因目前仍未充分弄清。解決辦法： 采用多重PCRPCR的方法，加入標記位點的檢測； 控制擴增片段大小(40%aneuploid cells

31、25%aneuploid cells 25-40%aneuploid cells FISH reanalysis of inner cell mass and trophectoderm samples of previously array-CGH screened blastocysts shows high accuracy of diagnosis and no major diagnostic impact of mosaicism at the blastocyst stage,Antonio C,et al. Human Reproduction, Vol.0, No.0 pp.

32、 110, 2013真正會影真正會影響到移植響到移植風險的嵌風險的嵌合胚胎發(fā)合胚胎發(fā)生率僅為生率僅為5%.因為絕大因為絕大多數(shù)非整多數(shù)非整倍體異常倍體異常在內細胞在內細胞團與滋養(yǎng)團與滋養(yǎng)層中共同層中共同發(fā)生。發(fā)生。而在滋養(yǎng)而在滋養(yǎng)層細胞中層細胞中可能嵌合可能嵌合存在更多存在更多異常。異常。嵌合對PGS診斷的影響如何理解卵裂期活檢的影響（Timelapse分析） 正常卵裂球的移除進一步影響胚胎發(fā)育的潛能 異常卵裂球的存在影響胚胎的正常診斷囊胚活檢有替代卵裂期活檢的趨勢作者認為：卵裂球活檢仍相對更加損傷胚胎，臨床結局顯示囊胚活檢應是最為合適的植入前遺傳學檢測的活檢時期。Fertil Steril.

33、 2013 Sep;100(3):608-14. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.極體活檢風險最低的活檢方法極體活檢對胚胎沒有損傷，隨著極體染色體檢測技術的進步，如極體活檢對胚胎沒有損傷，隨著極體染色體檢測技術的進步，如更精確而且便宜的測序技術的應用，極體活檢將成為未來更精確而且便宜的測序技術的應用，極體活檢將成為未來PGD/PGS中一項非常有前景的技術。中一項非常有前景的技術。 討論：極體活檢vs囊胚活檢？避免嵌合的影響避免嵌合的影響不影響未來的胚胎不影響未來的胚胎僅檢測減數(shù)分裂錯誤而未評估有絲分裂錯僅檢測減數(shù)分裂錯誤而未評估有絲分裂錯誤，而有絲分

34、裂可能修復減數(shù)分裂錯誤誤，而有絲分裂可能修復減數(shù)分裂錯誤 能分析來自父母雙方的異常能分析來自父母雙方的異常嵌合嵌合(滋養(yǎng)外胚層可能不能代表內細胞團滋養(yǎng)外胚層可能不能代表內細胞團) 囊胚培養(yǎng)和玻璃化囊胚培養(yǎng)和玻璃化冷凍冷凍美國的Nathan Treff 代表與歐洲的Joep Geraedts達成了許多共識：極體活檢與囊胚活檢各有優(yōu)勢，不再建議進行卵裂期活檢Willadsen S et al. Hum. Reprod. 1999;14:470-475早年PGS嘗試：利用動物MII卵構建人卵裂球分裂相技術難度大，構建成功率低，無法實現(xiàn)臨床應用。全染色體組篩查技術全染色體組篩查技術FISH: 9-11

35、條條chr所有23對人染色體都需要篩查CGH-比較基因組雜交比較基因組雜交aCGH: 基因組雜交芯片基因組雜交芯片Microarray SNP RealTime PCRNext Generation Sequencing全染色體篩查技術進展1996 Sermon K., et al. Adaptation of the primer extension preamplification (PEP) reaction for preimplantation diagnosis: single blastomere analysis using short PEP protocols. Mol H

36、um Reprod. 1996; 2(3):209-212. (最早用最早用全基因組擴增法進行全基因組擴增法進行PGD，但僅篩查幾個基因，但僅篩查幾個基因)1999 Wells D., et al. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification. Nucleic Acids Res, 27:1214-1218. (首次使用單細胞首次使用單細胞mCGH做做PGS)2005 Knijnenburg J., et al. Rapid detection

37、 of genomic imbalances using micro-array consisting of pooled BACs covering all human chromosome arms. Nucleic Acids Res. 2005;12(33):e159. (首次用首次用aCGH做做PGS)2007 Treff NR., et al. Accurate 23 chromosome aneuploidy screening in human blastomeres using single nucleotide polymorphism (SNP) microarray.

38、Fertil Steril, 2007;86:s217. (首次用首次用SNParray做做PGS)2013 Eric J. Forman, et al.Comprehensive chromosome screening alters traditional morphology-based embryo selection:a prospective study of 100 consecutive cycles of planned fresh euploid blastocyst transfer (首次用首次用qPCR做做PGS)2013 Chunlei Zhang,et al.A

39、Single Cell Level Based Method for Copy Number Variation Analysis by Low Coverage Massively Parallel Sequencing (首次用首次用NGS做做PGS)Pubmed總體能夠搜索到2881篇文獻，自2002年至今，每年平均有176篇，稱增長趨勢作者作者技術技術研究對象研究對象結論結論Munn S,2002FISH1235枚淘汰卵裂期胚枚淘汰卵裂期胚胎，至少檢測胎，至少檢測3個卵裂個卵裂球球/胚。胚。發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)48%復雜嵌合異常，二倍體或多倍體異常占復雜嵌合異常，二倍體或多倍體異常占26%。25%

40、的胚胎發(fā)生了有絲分裂不分離，的胚胎發(fā)生了有絲分裂不分離，16號染色體最常號染色體最常發(fā)生異常，但嵌合率的高低與女性年齡無關。發(fā)生異常，但嵌合率的高低與女性年齡無關。Cupisti S, 2003FISH31-34歲女性卵子歲女性卵子31-34歲女性卵子的染色單體異常發(fā)生率約為歲女性卵子的染色單體異常發(fā)生率約為11%。Lucille Voullaire,2007CGH28名女性名女性176枚囊胚枚囊胚37歲以下女性非整倍體率歲以下女性非整倍體率18.9%；復雜異常率；復雜異常率27.9%；37歲以上女性非整倍體率歲以上女性非整倍體率42.6%；復雜異常率；復雜異常率27.8%Liang L,2013CGHarray平均年齡平均年齡40歲的高齡歲的高齡女性，檢測女性，檢測246枚囊胚枚囊胚RCT研究發(fā)現(xiàn)高齡女性正常胚胎率能達到研究發(fā)現(xiàn)高齡女性正常胚胎率能達到36%，有，有64.7%的病人有可移植胚胎，的病人有可移植胚胎，22個移植周期達到個移植周期達到50%的臨床妊娠率。的臨床妊娠率。證實證實PGS技術能夠顯著提高技術能夠顯著提高40歲以上歲以上女性的移植成功率及抱嬰率。女性