ICH遺傳毒性研究指導(dǎo)原則修訂的最新進(jìn)展

1、ICH遺傳毒性研究指導(dǎo)原則修訂的最新進(jìn)展中國藥事2009年第23卷第5期491?國外藥事?ICH遺傳毒性研究指導(dǎo)原則修訂的最新進(jìn)展王雪,宋捷,張曼,胡燕平,王欣,李波,王軍志(中國藥品生物制品檢定所國家藥物安全評價監(jiān)測中心,北京100176)摘要:目的介紹ICH關(guān)于遺傳毒性研究的指導(dǎo)原則修訂的最新進(jìn)展.方法介紹ICH遺傳毒性研究指導(dǎo)原則修訂的背景,修訂的經(jīng)過及要點(diǎn).結(jié)果修訂的指導(dǎo)原則在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合,體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)的選擇,結(jié)果分析及評價等方面做了若干修訂,提出了新的要求.結(jié)論修訂后的指導(dǎo)原則ICHS2更具科學(xué)性和可操作性.關(guān)鍵詞:ICH指導(dǎo)原則;遺傳毒性;標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合;體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn);

2、3R中圖分類號:R951.01文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:10027777(2009)0549104ICHGuidelineonGenotoxicity:LatestProgressinRevisionWangXue,SongJie,ZhangMin,HuYanping,WangXin,LiBoandWangJunzhi(NationalCenterforSafetyEvaluationofDrugs,NationalInstitutefortheControlofPharmaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100176)ABSTRACT:Objectiv

3、eTointroducethe1atestprogressofICHS2revisions.MethodsThebackground,processandimportantpointsoftherevisionwereintroducedinthisarticle.ResultsThestandardbatteryofgenotoxicitytest,choiceofinvitroandinvivoassays,interpretationandevaluationofresultsinICHS2hadbeenrevised.ConclusionsICHS2revisionismorescie

4、ntificandpracticable.KEYWORDS:ICHguideline;genotoxicity;standardbatteryforgenotoxicitytesting;invitromammaliancellsassay;3RICH(人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會議)關(guān)于遺傳毒性試驗(yàn)現(xiàn)行的兩個指導(dǎo)原則(S2A和S2B)分別制定于1995年和1997年.2006年6月,ICH指導(dǎo)委員會(SteeringCommittee,SC)同意對其進(jìn)行修訂,自此,ICH關(guān)于遺傳毒性試驗(yàn)的修訂開始.ICH專家工作組(ExpertWorkingGroup,EwG)在經(jīng)過一系列工作會議后,于2

5、008年2月完成指導(dǎo)原則修訂案的征求意見稿.按計劃于2009年6月在日本橫濱召開會議,屆時,新的指導(dǎo)原則一S2(R1):GuidanceonGenotoxicityTestingandDataInterpretationforPharmaceuticalsIntendedforHumanUse(人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析的指導(dǎo)原則)將正式發(fā)布并付諸實(shí)施.新的指導(dǎo)原則在遺傳毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合,體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)的選擇,結(jié)果分析及評價等方面做了若干修訂,提出了新的要求,這將對藥物安全性評價遺傳毒性試驗(yàn)和研究產(chǎn)生重大影響.及時了解國際上對藥物安全性評價的技術(shù)要求,對于國內(nèi)該領(lǐng)域的研究具有重要意義.

6、指導(dǎo)原則的詳細(xì)內(nèi)容可參考ICH發(fā)布的原案,本文就修訂的背景,經(jīng)過以及要點(diǎn)做一簡介,供國內(nèi)同行參考.1指導(dǎo)原則修訂背景和修訂進(jìn)程的各階段成果現(xiàn)行的遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則發(fā)布實(shí)施近l0年時間,其中存在的一些問題隨著時間的推移逐漸顯現(xiàn)出來,對部分內(nèi)容進(jìn)行修訂提上了日程,同時,遺傳毒性試驗(yàn)技術(shù)方法的進(jìn)步和數(shù)據(jù)積累也為修訂提供了支持;另一方面,隨著社會進(jìn)步,動物作者簡介:王雪,理學(xué)博士,研究方向:遺傳毒理學(xué);主要從事藥物安全性評價毒理學(xué)試驗(yàn)和研究工作;Tel:(010)678722338209;E-mail:.ca492中國藥事2009年第23卷第5期愛護(hù)的理念逐漸被大眾

7、接受,歐盟更將禁止使用動物進(jìn)行化妝品的安全性評價的規(guī)定法律化,這對食品和藥品領(lǐng)域的相關(guān)法規(guī)制定也產(chǎn)生了影響.此兩點(diǎn)為指導(dǎo)原則修訂的大的背景.ICH此次對遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則的修訂目的:1)解決標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)存在與人用風(fēng)險不相關(guān)的陽性率過高問題;2)在實(shí)驗(yàn)的科學(xué)價值和人的風(fēng)險評價不發(fā)生沖突的前提下,盡可能將動物實(shí)驗(yàn)的3R原則(減少,替代,優(yōu)化)引入到遺傳毒性試驗(yàn)中.自2006年起,在ICH召開的歷次SC/EWG工作會議上,遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則修訂被列入了討論議題,相關(guān)的幾次會議經(jīng)過及成果如下:(1)2006年6月,橫濱:ICH指導(dǎo)委員會同意對遺傳毒性試驗(yàn)指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂,

8、并決定設(shè)置非正式工作組(InformalWorkingGroup),自此開始對修訂計劃和方案進(jìn)行討論;(2)2006年1O月,芝加哥:EWG首次召開工作會議,針對遺傳毒牲試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合中的”體外試驗(yàn)問題”以及”以確認(rèn)遺傳毒性為目的的重復(fù)給藥試驗(yàn)的評價終點(diǎn)”等內(nèi)容進(jìn)行了討論;(3)2007年5月,布魯塞爾:EWG就修訂問題達(dá)成共識,一致同意起草指導(dǎo)原則修訂案s2(R1).對指導(dǎo)原則S2(R1)中”新的標(biāo)準(zhǔn)組合”以及”在科學(xué)性前提下適當(dāng)減少使用實(shí)驗(yàn)動物的遺傳毒性試驗(yàn)”議題進(jìn)行了討論,目標(biāo)定于當(dāng)年秋季到達(dá)進(jìn)程第二階段;(4)2007年l1月,橫濱:對指導(dǎo)原則S2(R1)中”新的標(biāo)準(zhǔn)組合”以及”在科學(xué)性

9、前提下適當(dāng)減少使用實(shí)驗(yàn)動物的遺傳毒性試驗(yàn)”議題進(jìn)行了討論,目標(biāo)定于年終到達(dá)進(jìn)程第二階段(實(shí)際于2008年2月完成了修訂案的最后簽字,結(jié)束了進(jìn)程第二階段);(5)2008年6月,波特蘭:對S2(RI)征集的意見EWG召開會議進(jìn)行審議,進(jìn)一步討論進(jìn)程第四階段的工作;(6)2008年11月,布魯塞爾:由于”彗星試驗(yàn)合作研究”的數(shù)據(jù)沒有完成,EWG未召開會議;(7)2009年6月,橫濱(預(yù)定):預(yù)計結(jié)束進(jìn)程第四階段.由上可見,議題的討論似沒有完全按照日程完成,修訂進(jìn)程的進(jìn)展比EWG計劃有所延長(原計劃在2008年末結(jié)束進(jìn)程第四階段).這是因?yàn)椴糠中抻唭?nèi)容需要做進(jìn)一步的調(diào)查或者通過合作研究獲取數(shù)據(jù)后方可

10、寫入指導(dǎo)原則中,合作研究的最終數(shù)據(jù)提交拖延了修訂進(jìn)程.2體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)的陽性率過高問題體#bN-L動物細(xì)胞試驗(yàn)系統(tǒng)的陽性率過高問題早已引起了廣泛關(guān)注,而這些陽性結(jié)果與人用風(fēng)險并不相關(guān).陽性結(jié)果一般是在與體內(nèi)環(huán)境相差甚遠(yuǎn),且非生理環(huán)境(比如受試物的細(xì)胞毒性,不溶性等)下獲得的,而非真正的遺傳毒性.這些陽性結(jié)果導(dǎo)致必須實(shí)施大量的后續(xù)試驗(yàn)(如體內(nèi)試驗(yàn))來進(jìn)一步評價其遺傳毒性.因此,亟需采取必要措施以解決體外試驗(yàn)的高陽性率問題,避免在后續(xù)試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)動物使用上產(chǎn)生更多的浪費(fèi).為此,EWG曾提出若干種補(bǔ)救措施意見(2007,芝加哥會議):(1)保留體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)方法,但要改進(jìn)對證據(jù)份量(w

11、eightofevideneeW0E)的評價及后續(xù)試驗(yàn)的建議;(2)降低受試物處理的最高濃度以減少不相關(guān)陽性結(jié)果;(3)降低抑制細(xì)胞生長(細(xì)胞毒性)的最高濃度以減少不相關(guān)陽性結(jié)果;(4)從標(biāo)準(zhǔn)組合中取消體#VNL動物細(xì)胞試驗(yàn),無需替代;(5)從標(biāo)準(zhǔn)組合中取消體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn),但需要追加兩個體內(nèi)試驗(yàn).其后,EWG工作會議對包括降低最高濃度的可能性,遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)合到重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中,大鼠外周血微核試驗(yàn)的利用,體外微核試驗(yàn)作為哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)的第三種選擇,提議新的試驗(yàn)組合等議題均作了充分的討論.在形成修訂案之前,EWG于芝加哥會議后通過ICH三方的制藥協(xié)會共同實(shí)施了一項(xiàng)調(diào)查,即將現(xiàn)行的最高濃

12、度lOmM降低至100M,考察能否既可檢測”相關(guān)(relevant)”陽性(如體內(nèi)試驗(yàn)為陽性的物質(zhì)),又能減少”非相關(guān)(notrelevant)”陽性結(jié)果.該項(xiàng)調(diào)查的最大成果是,EWG一致同意將最高濃度10mM(或5mg?mL-)降低至lmM(或0.5mg?mL-),同時,對于受試物產(chǎn)生沉淀和出現(xiàn)細(xì)胞毒性時的策略也達(dá)成了一致意見.3遺傳毒性試驗(yàn)與一般毒性動物試驗(yàn)的結(jié)合目前的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)均單獨(dú)使用實(shí)驗(yàn)動物,如果將體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)合到一般毒性試驗(yàn)中,分別進(jìn)行各自的終點(diǎn)檢測,將能夠大大減少動物的使用數(shù)量,推動動物實(shí)驗(yàn)3R原則在業(yè)界的普及.為體現(xiàn)這一精神,EWG充分討論了將遺傳毒性評價終點(diǎn)結(jié)合到

13、重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的可能性.首先,減少實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量可以直接帶來受試物使用量中國藥事2009年第23卷第5期493的減少;其次,一般毒性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)特別是毒代動力學(xué)數(shù)據(jù)可以用于遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果分析,這些無疑是有利的一面.然而,也有不確定的一面,例如,重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)的最高濃度通常低于急性毒性試驗(yàn),試驗(yàn)系統(tǒng)的敏感性是否會降低?另外,沒有數(shù)據(jù)表明重復(fù)給藥對遺傳毒性檢測的效果如何,如微核試驗(yàn)即便進(jìn)行長時間處理也只反映最近的暴露水平.為此,EWG通過ICH三方的制藥協(xié)會又做了一項(xiàng)調(diào)查,對體內(nèi)微核試驗(yàn)或急性毒性試驗(yàn)(1次或2次給藥至最大耐受劑量)和重復(fù)給藥試驗(yàn)(2/4/12周給藥分別至給藥結(jié)束時檢測)的最大

14、血藥濃度值(C瑚x)進(jìn)行了對比研究,結(jié)果表明,在多數(shù)情況下高濃度(重復(fù)給藥累計暴露水平類似于急毒的水平)是可以用于遺傳毒性研究的.因此,EWG一致認(rèn)為,結(jié)合一般毒性研究檢測遺傳毒性終點(diǎn)(如微核試驗(yàn))是可以接受的,關(guān)鍵是必須確定一般毒性試驗(yàn)的最高劑量標(biāo)準(zhǔn).確定標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)考慮到以下幾個因素,需符合其中任意一項(xiàng)(以大鼠為例):(1)現(xiàn)實(shí)可行的最大給藥劑量;(2)14d或更長時間的試驗(yàn),劑量限度為1000mg?kg:(3)穩(wěn)定和充分的暴露,有蓄積;(4)達(dá)到或接近最大耐受量;(5)與短期試驗(yàn)的高劑量接近的暴露水平(應(yīng)大于該劑量的50).4遺傳毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合的兩種選擇此次修訂的重要內(nèi)容之一是增加了一種標(biāo)

15、準(zhǔn)試驗(yàn)組合供選擇,這種改變無疑考慮了體外試驗(yàn)陽性率過高的問題.選擇一仍如從前,選擇二則提供了不進(jìn)行體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)仍可以實(shí)現(xiàn)遺傳毒性評價的可能,在策略上兩種選擇均體現(xiàn)了3R的理念.選擇二中,當(dāng)劑量或暴露不合適時,為了優(yōu)化劑量設(shè)定推薦實(shí)施的一項(xiàng)單次給藥體內(nèi)試驗(yàn),指導(dǎo)原則亦建議”如可能時將兩個遺傳毒性試驗(yàn)合并在一項(xiàng)試驗(yàn)中”,即在一個動物試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)兩個遺傳終點(diǎn)的檢測,事實(shí)上這種策略也能夠達(dá)到減少動物使用量的目的,仍為3R原則的一種體現(xiàn).此外,體內(nèi)試驗(yàn)不再設(shè)平行陽性對照組也在修訂案中被提及.選擇一:(1)細(xì)菌基因突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn));(2)體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn)(染色體畸變試驗(yàn)或小鼠淋巴瘤tk基

16、因突變試驗(yàn));(3)體內(nèi)微核試驗(yàn)(如可能時結(jié)合到重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中).選擇二:(1)細(xì)菌基因突變試驗(yàn)(Ames試驗(yàn));(2)兩種不同組織的遺傳毒性體內(nèi)試驗(yàn)(如可能時結(jié)合到重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中).圖l為按照新的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)的流程.1)Ames試驗(yàn):結(jié)果為陰性方可進(jìn)入選擇一或選擇二.2)選擇一:首先實(shí)施體外哺乳動物細(xì)胞試驗(yàn),可以選擇染色體畸變試驗(yàn),小鼠淋巴瘤tk基因突變試驗(yàn)或體外微核試驗(yàn).a如果結(jié)果為陰性,則只選做體內(nèi)微核試驗(yàn)即可;b如果結(jié)果為陽性,則除了選做微核試驗(yàn)外,尚需實(shí)施一個后續(xù)的體內(nèi)試驗(yàn).3)選擇二:可以跳過體外試驗(yàn)直接進(jìn)入體內(nèi)試驗(yàn),但必須實(shí)施兩項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn).此時,應(yīng)假設(shè)受試

17、物為體外遺傳毒性陽性,而體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)具有檢測出”相關(guān)”陽性的能力.赫/牝_1磊/IIlIJ體內(nèi)微核試驗(yàn)IJ體內(nèi)徽核試驗(yàn)JJ體內(nèi)觸棱試驗(yàn)J(無需實(shí)施第二個l外加一項(xiàng)體冉試驗(yàn)lI外加一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)l體內(nèi)試驗(yàn))l(第2個終點(diǎn)/組織)1(第2個照點(diǎn)/組織)l圈請侍塞Jf幸試騎流棵示童圖通常,對于試驗(yàn)結(jié)果為陰性的化合物,若證據(jù)充分則不再進(jìn)行其他的試驗(yàn).若出現(xiàn)陽性結(jié)果,則根據(jù)其臨床用途,可能需進(jìn)行更多的試驗(yàn).一些體內(nèi)試驗(yàn)可用在選擇二中體內(nèi)試驗(yàn)的第2項(xiàng)試驗(yàn),基于暴露和代謝能力的考慮,肝臟應(yīng)是首選的組織,但是體內(nèi)組織和試驗(yàn)方法的選擇應(yīng)考慮更多因素,諸如可能的機(jī)理,代謝,相關(guān)組織的暴露等信息.可供選擇的體內(nèi)試驗(yàn)有彗

18、星試驗(yàn),堿性洗脫試驗(yàn),轉(zhuǎn)基因動物基因突變試驗(yàn),UDS試驗(yàn)等,EWG首推在重復(fù)給藥試驗(yàn)中實(shí)施肝臟組織的彗星試驗(yàn).目前,日,美,歐三國的制藥協(xié)會已組織實(shí)施了兩項(xiàng)合作研究,即”彗星試驗(yàn)結(jié)合28天重復(fù)給藥試驗(yàn)”和”肝臟彗星試驗(yàn)和骨髓微核試驗(yàn)整合到一個單項(xiàng)研究中”,預(yù)計獲得的數(shù)據(jù)將支持該方法被寫入指導(dǎo)原則中.494中國藥事2009年第23卷第5期增加選擇二,必須對ICHM3(關(guān)于非臨床研究的實(shí)施時期的指導(dǎo)原則)的相關(guān)部分做出修訂.對于原來的規(guī)定一進(jìn)入臨床I期之前完成Ames和染色體畸變試驗(yàn)(或小鼠淋巴瘤tk基因突變試驗(yàn)),進(jìn)入臨床II期之前完成全部遺傳毒性試驗(yàn)一而言,增加選擇二意味著完成了Ames便可以

19、直接進(jìn)入臨床試驗(yàn),這種試驗(yàn)策略未免風(fēng)險過高.因此,ICH在M3(R2)遺傳毒性研究部分對此作了修改,即在支持多劑量臨床試驗(yàn)的兩種試驗(yàn)組合中“若采用選擇二,應(yīng)在多劑量試驗(yàn)的人體首次應(yīng)用前完成試驗(yàn);若采用選擇一,其中的體外試驗(yàn)應(yīng)在首次多劑量人體試驗(yàn)前完成,選擇一的體內(nèi)試驗(yàn)則應(yīng)在期試驗(yàn)前完成”.5結(jié)語ICHS2修訂案對減少實(shí)驗(yàn)動物的使用具有潛在的積極影響,但是體內(nèi)動物試驗(yàn)是遺傳毒性評價的重要組成部分這一事實(shí)并未因此而改變.這體現(xiàn)在,體內(nèi)動物試驗(yàn)既是體外試驗(yàn)的必要搭配,同時,作為體外試驗(yàn)陽性結(jié)果的后續(xù)試驗(yàn),其存在的意義更大.如前所述,EWG在波特蘭會議及其后,將根據(jù)征集的意見提出補(bǔ)充草案以進(jìn)一步完善s

20、2(R1),同時彗星試驗(yàn)結(jié)合骨髓試驗(yàn)的合作研究也將完成,預(yù)計完善后的S2(R1)將更具科學(xué)性和可操作性,國內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域同行需要關(guān)注今年6月ICH橫濱會議的結(jié)果.致謝:本文的部分資料由日本國立醫(yī)藥品食品衛(wèi)生研究所本間正充博士提供,特此致謝.參考文獻(xiàn):1ICHS2A.SpecificAspectsofRegulatoryGenotoxicityTestsforPharmaceuticalsEB/OLI.1995. t|.iceoN/LOB/media/MEDIA493.pdf.1-2ICHS2B.AStandardBatteryforGenotoxicityTestingofPharmaceuti

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