蛋白質(zhì)含量的測(cè)定課件

1、實(shí)驗(yàn)十一實(shí)驗(yàn)十一 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 一、目的要求一、目的要求1.學(xué)習(xí)和掌握蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理2.掌握考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的操作技術(shù) 二、原理二、原理微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)總含量微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)總含量被測(cè)的天然含氮化合物與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在凱氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸汽蒸餾法將氨蒸入無(wú)機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定所用無(wú)機(jī)酸的量(mol)相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的量(mol)，根據(jù)所測(cè)得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含氮量通常在16 %左右，所以將凱氏定氮法測(cè)得的含氮量乘上系數(shù)6.2

2、5，便得到該樣品的蛋白質(zhì)含量。 Folin酚試劑法酚試劑法(Lowry法法)測(cè)定蛋白質(zhì)濃測(cè)定蛋白質(zhì)濃度度 蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵(CONH)，因此有雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中，能與Cu2+形成絡(luò)合物。Folin酚反應(yīng)是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上，引進(jìn)Folin試劑(磷鉬酸磷鎢酸試劑)，蛋白質(zhì)銅絡(luò)合物能還原磷鉬酸磷鎢酸試劑，生成藍(lán)色物質(zhì)。在一定條件下，藍(lán)色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的量成正比例。本法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、較紫外吸收法靈敏1020倍，較雙縮脲法靈敏100倍。其不足之處是此反應(yīng)受多種因素干擾。 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共

3、軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處。在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值(OD280)與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測(cè)定。利用紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡(jiǎn)便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測(cè)定。 總蛋白定量分析總蛋白定量分析BCA（Bicinchoninic acid，二辛可寧酸、二羧基二喹啉），二辛可寧酸、二羧基二喹啉）準(zhǔn)確靈敏：BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是202000g/ml；Micro BCA試劑測(cè)定范圍是0.5-20g/ml快速：45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowry法快4倍而且更加方便經(jīng)濟(jì)實(shí)用：除試管外，測(cè)定可在微孔板中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和

4、試劑用量不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)小于考馬斯亮藍(lán) 基本原理：基本原理：堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)流程：蛋白質(zhì)檢測(cè)流程： 考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 考馬斯亮藍(lán)在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ，因此可以通過測(cè)定染料在595nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡(jiǎn)單、迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高（比Lowry法靈敏4倍）。 Coomassie Dye-Bas

5、ed 蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax = 595nmBLUEAcidCoomassie G-250Protein - DyeComplexO CH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+三、三、 操作方法操作方法 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取14支試管，分兩組按下表平行操作。試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量(g) 0 10 20 30 40 50 60標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(mL) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06待測(cè)蛋白質(zhì)溶液(mL)蒸餾水(mL) 0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 考馬斯亮藍(lán)試劑(mL) 2.5 mL搖勻，1 h內(nèi)以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm處比色 OD595nm以O(shè)D595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)，根據(jù)所測(cè)定的OD595nm值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。四四. .注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20 min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。（2）測(cè)定中，蛋白-染