生物化學(xué)第15章核酸的研究方法

1、第第1515章章 核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法1 1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定一、DNA的分離： 真核生物中的染色體DNA常與堿性蛋白結(jié)合成核蛋白（DNP）形式存在于核內(nèi)。 1）苯酚法： 用濃鹽（1MNaCl）提取出DNP；用稀鹽（0.14MNaCl）沉淀出DNP；用苯酚提取，除去蛋白質(zhì)；冷乙醇沉淀出DNA；1 1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定一、一、DNADNA的分離：的分離：2 2）蛋白酶法：）蛋白酶法： 細(xì)胞懸液中加入含細(xì)胞懸液中加入含1 1SDSSDS的緩沖溶液的緩沖溶液 加入蛋白酶加入蛋白酶K K，6565C C保

2、溫保溫4h4h 苯酚抽提苯酚抽提 乙醇沉淀乙醇沉淀核酸的研究方法核酸的研究方法1 1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定二、RNA的分離： 因?yàn)镽nase無處不在而得RNA提取分離更為困難。 制備RNA應(yīng)注意： 1）、所有玻璃器具都應(yīng)高溫滅菌；2）、破碎細(xì)胞時(shí)使用強(qiáng)變性劑，如胍鹽，使酶失活； 3）、在RNA反應(yīng)體系內(nèi)加入RNA酶的抑制劑；1 1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定二、二、RNARNA的分離：的分離：目前最常用的RNA制備方法有兩個(gè)： 1）用酸性胍鹽/苯酚/氯仿抽提：少量制備RNA。 2）用胍鹽/氯化銫將細(xì)胞抽提物進(jìn)行密度梯度離心：大量制備

3、RNA核酸的研究方法1 1、核酸的分離、提純和定量測定、核酸的分離、提純和定量測定三、核酸含量的測定：鉬藍(lán)比色法： 用濃硫酸或過氯酸將有機(jī)磷氧化成無機(jī)磷，在酸性條件下與鉬酸生成磷鉬酸，在還原劑存在下生成鉬藍(lán)，最大吸收在660nm處，從而可以比色測定。核酸的研究方法2、核酸的超速離心應(yīng)用超速離心技術(shù)，可以測定核酸的沉降常數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量，其基本原理與測定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量相同。分析DNA時(shí)，常用氯化銫密度梯度，密度梯度沉降平衡法常用于如下幾個(gè)方面： 核酸密度測定 測定DNA中G-C的含量 溶液中核酸構(gòu)象的研究 核酸的制備核酸的研究方法核酸的研究方法密度梯度沉降平衡法核酸的研究方法3 3、核酸的

4、凝膠電泳、核酸的凝膠電泳核酸常用的電泳有瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳。既可在水平電泳槽也可在垂直電泳槽內(nèi)進(jìn)行電泳。以瓊脂糖為支持物的電泳遷移率主要受下面因素影響：1）核酸分子大??；2）膠濃度；3）DNA的構(gòu)象；4）電壓；5）堿基組成；6）溫度3 3、核酸的凝膠電泳、核酸的凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳的異同： 相同點(diǎn)： 基本操作相同 影響因素相同 不同點(diǎn)： 分離分子量大小不同 適用對(duì)象不同 靈敏度不同 電泳槽類型不同 核酸的研究方法核酸的研究方法4 4、核酸的核苷酸序列測定、核酸的核苷酸序列測定（一）Sanger的酶法測序：反應(yīng)體系包含單鏈模板、引物、四種dNTP和DNA聚

5、合酶。共分4組，每組按一定比例加入少量2,3雙脫氧核苷酸。Frederick Sanger核酸的研究方法核酸的研究方法核酸的研究方法自動(dòng)DNA序列分析儀4 4、核酸的核苷酸序列測定、核酸的核苷酸序列測定(二)DNA的化學(xué)法測序：化學(xué)法的基本原理是用特異的化學(xué)試劑作用于DNA分子不同堿基，然后用哌啶切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸。4種特異性反應(yīng)有： G反應(yīng) G+A反應(yīng) T+C反應(yīng) C反應(yīng)核酸的研究方法4 4、核酸的核苷酸序列測定、核酸的核苷酸序列測定Walter Gilbert核酸的研究方法核酸的研究方法毛細(xì)管陣列電泳毛細(xì)管陣列電泳基本步驟：設(shè)計(jì)引物優(yōu)化體系選擇熱循環(huán)溫度鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物核酸的研究方法5 5、DNADNA聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCRPCR）6、DNA的化學(xué)合成核酸的研究方法核酸的研究方法Questions CRISPR/Cas9技術(shù)原理及研究進(jìn)展 RNAi技術(shù)原理及研究進(jìn)展 ABI SOLiD sequencing Illumina (Solexa) sequencing 454 pyrosequencing人有了知識(shí)，就會(huì)具備各種分析能力，明辨是非的能力。所以我們要勤懇讀書，廣泛閱讀，古人說“書中自有黃金屋?！蓖ㄟ^閱讀科技書籍，我們能豐富知識(shí)，培養(yǎng)邏輯思