PCR室作業(yè)指導書-檢驗SOP文件[1]

1、市二醫(yī)PC碇作業(yè)指導書編制：審核：批準：生效日期：2011年4月8日凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：主題內(nèi)容編制說明生效日期：第2頁共64頁編制說明本分冊文件可以作為單獨申請衛(wèi)生部 PCR實驗室認可的全套作業(yè)文件， 因此作為ISO15189質(zhì)量管理體系的PC逕作業(yè)文件，要對其重復部分進行刪 減，各檢驗科根據(jù)各自用途要求與特點進行選用，特此說明。2011年4月14日凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：主題內(nèi)容目 錄生效日期：第3頁共64頁序號主題內(nèi)容代號頁號1PC戲驗室的設置及管理PCR-0172PC戲驗室工作制度PCR-0283PC戲驗室內(nèi)務管理制度PCR-

2、0394PC戲驗室人員的配置及管理PCR -04105PC戲驗室清潔程序PCR -05126PCRfe本唯一標識編號規(guī)則PCR -06137PC磯 因擴增實驗室的要求PCR -07148PCRt棄物的處理程序PCR -08179基因擴增檢測及結果分析PCR -091810臨床標本的保存操作程序PCR -102111標本的采集運送接收程序PCR -112212PCRfc物防護措施PCR -122413PC戲驗室化學試劑配PCR -132514PC戲驗室記錄管理制度PCR -142615PCRS急處理程序PCR -152816PCR式劑的質(zhì)檢標準操作程序PCR -163017PCRW耗品進購質(zhì)檢貯

3、存程序PCR -173118PCRg內(nèi)質(zhì)量控制操作程序PCR -183319PCRg間質(zhì)量控制操作程序PCR -193520PCRm度校準標準操作程序PCR -203621核酸擴增熒光儀操作維護規(guī)程PCR -213722干式恒溫器操作維護規(guī)程PCR -224323離心機操作維護規(guī)程PCR -2345凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：主題內(nèi)容目 錄生效日期：第4頁共64頁24冰箱操作維護規(guī)程PCR -244725生物安全柜操作維護規(guī)程PCR -254926移液器操作維護規(guī)程PCR -265127沙眼衣原體核酸擴增熒光檢測PCR -275428乙肝病毒核酸擴增熒光檢測PCR -

4、285629丙肝病毒核酸擴增熒光檢測PCR -295830結核桿菌核酸擴增熒光檢測PCR -306031局速冷凍離心機操作維護規(guī)程PCR -3162附錄表格檢驗科基因檢測實驗室平囿圖市一醫(yī)/001實驗室主要負責人簡歷表市一醫(yī)/002PC戲驗室工作人覽表市一醫(yī)/003PCRF增接收標本記錄表市一醫(yī)/004拒收標本記錄本市一醫(yī)/005標本超低溫保存記錄表市一醫(yī)/006PCR式齊購買記錄表市一醫(yī)/007試劑驗收記錄表市一醫(yī)/008PCR特殊耗材驗收記錄表市一醫(yī)/009普通耗材驗收記錄表市一醫(yī)/010室間質(zhì)評記錄表市一醫(yī)/011PCR內(nèi)質(zhì)控記錄表市一醫(yī)/012室內(nèi)質(zhì)控圖市一醫(yī)/013PC戲驗室環(huán)境溫濕

5、度記錄表市一醫(yī)/014冰箱溫度質(zhì)控圖市一醫(yī)/015儀器使用記錄表市一醫(yī)/016儀器設備維護和校準記錄表市一醫(yī)/017凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：主題內(nèi)容目 錄生效日期：第5頁共64頁紫外消毒車消善記錄表市一醫(yī)/018應急處理登記表市一醫(yī)/019PCR1血標本處理交接表市一醫(yī)/020垃圾處理記錄表市一醫(yī)/021實驗室清潔消毒記錄表市一醫(yī)/022PCR僉驗報告單市一醫(yī)/023耗材進購記錄表市一醫(yī)/024試劑耗材供應#-覽表市一醫(yī)/025凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：主題內(nèi)容修訂頁生效日期：2011-4-14第6頁共64頁序號文件編號蟲他需更改的內(nèi)容更改

6、內(nèi)容批準人批準日期1234567891011121314151617181920凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-01主題內(nèi)容PCR實驗室的設置及管理生效日期：2011-4-14第7頁共64頁PC改驗室的設置及管理1 .目的：建立實驗室的合理設置和科學管理，防止實驗污染，保證檢測結果的可靠性。2 .適用范圍：本程序適用于分子診斷室的設置、工作流程和日常管理等。3 .負責人：4 .細則：4. 1分子診斷室為檢驗科下設的專業(yè)實驗室，從事臨床標本的基因擴增檢測及相關科研工作。4. 2本實驗室采用實時熒光定量 PCR術作為臨床基因診斷的主要手段，實驗室分為三個區(qū)：

7、 試劑準備區(qū)（第一區(qū)）、標本處理區(qū)（第二區(qū)）、擴增分析區(qū)（第三區(qū)）。每一工作區(qū)配備專用的設備、儀器、輔助設施、耗材、清潔用品、辦公用品、專用工作服，并有明顯的區(qū)分標識。各區(qū)標簽顏色：紅色（第一區(qū)）、白色或綠色（第二區(qū)）、藍色（第三區(qū)）；專用工作服：粉紅色（第一區(qū)）、白色（第二區(qū)）、藍色（第三區(qū)）。標本 的接收則在檢驗科標本接收處進行。4. 3各工作區(qū)專用的儀器設備、辦公用品、工作服、實驗耗材和清潔用具等，不可混用。4. 4各工作區(qū)配置、功能和內(nèi)務管理見各相關SOPt件。4. 5嚴格遵守從“試劑準備區(qū)一標本處理區(qū)一擴增分析區(qū)”的單一流向制度，不得逆向進入前一工作區(qū)。4. 6非本實驗室工作人員，未

8、經(jīng)許可不得入內(nèi)；進修、實習或其他科室人員因科研活動需要，進入實驗區(qū) 域（試劑準備區(qū)、標本處理區(qū)、擴增分析區(qū)）需首先熟悉本程序的各項規(guī)定并嚴格遵守執(zhí)行，在本實驗室人員監(jiān)督指導下進行。4 . 7實驗完畢后做好清潔消毒工作。5 .本文涉及以下圖表：1.實驗室設計平面圖凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-02主題內(nèi)容PCR實驗室工作制度生效日期：20060808第8貞共64貞PCR實驗室工作制度1 .目的：保持良好的工作環(huán)境，以確保檢測結果的可靠性，防止交叉污染，防止差錯、事故及糾紛的 發(fā)生。2 .適用范圍：所有本實驗室人員。3 .負責人：4 .細則：4. 1本

9、實驗室進行臨床基因擴增檢測及相關實驗工作，不得進行其它實驗操作。4. 2各區(qū)的用品不得混用。4. 3在各區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套和帽子，嚴格按照操作規(guī)程。4. 4試劑準備區(qū)只能進行試劑的貯存及配制等相關操作（見相關SO以件）。4. 5標本處理區(qū)只能進行臨床標本的保存，核酸提取、保存及其加入至擴增反應管和測定RNA寸cDNAW合成（見相關SOPt件）。4. 6擴增分析區(qū)只能進行 DNA或cDNA的擴增、實時熒光 PCRF增產(chǎn)物的分析（見相關 SOPt件）。4. 7進行實驗時嚴格執(zhí)行本實驗室的各項操作規(guī)程，及時做好各種操作記錄，力求準確、可靠。實驗完 畢，做好清潔、整理及分析統(tǒng)計等工作

10、。4. 8室內(nèi)儀器由專人負責，未經(jīng)許可，不得隨意使用或挪用；愛護使用儀器，定期進行保養(yǎng)與維修。4. 9愛護醫(yī)院財產(chǎn)，注意安全；離開實驗室前應關好門窗，檢查水、電等。凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-03主題內(nèi)容PCR實驗室內(nèi)務管理制度生效日期：2011-4-14第9貞共64貞PC改驗室內(nèi)務管理制度1 .目的：保證實驗室日常內(nèi)務管理及清潔工作順利進行。2 .適用范圍：實驗室相關人員及醫(yī)院相關清潔工人。3 .負責人：4 .細則：4. 1非本室工作人員未經(jīng)允許不得進入實驗室。4. 2各區(qū)的用品不得混用。4. 3實驗人員要有強烈的時間觀念，按時上下班，不遲到、

11、早退。4. 4進入實驗室的工作人員必須遵守實驗室的單一流向的規(guī)定，禁止逆向走動。4. 5所有儀器（如PCRT增儀）須有專人負責，并有使用維護記錄；實驗人員必須熟悉儀器性能 后方允許操作，并嚴格遵守操作規(guī)程。4. 6所有試劑進購、配制、質(zhì)檢、使用均要有記錄，未經(jīng)允許不得隨意帶出本實驗室。4. 7每天了解儀器運轉情況及試劑使用情況，確保儀器整潔安全，試劑合格使用。4. 8各區(qū)的各種清潔消毒均應有記錄，工作衣消毒時注意各區(qū)應分開進行處理。4. 104. 9注意保持實驗室衛(wèi)生整潔，嚴禁在室內(nèi)抽煙、吃零食，非實驗操作人員應盡量少入。下班前檢查門、窗、水、電，節(jié)假日應指定人員負責檢查實驗室的儀器、設備。凱

12、里市第二人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-04主題內(nèi)容PCR實驗室人員的配置及管理生效日期：2011-4-14第10貞共64貞PCRS驗室人員的配置及管理1 .目的：保證實驗室有足夠數(shù)量的合格的具備開展該類實驗能力的實驗人員。2 .適用范圍：適用于實驗室人員配置、管理、培訓及考核。3 .負責人：4 .細則：5 . 1 人員要求4. 1. 1 本實驗室工作人員應為醫(yī)學檢驗專業(yè)或相關專業(yè)畢業(yè)，具有中級以上技術職稱或?qū)？埔陨蠈W歷。4. 1. 2實驗室工作人員應參加衛(wèi)生部或省臨檢中心舉辦的PCR技術培訓，并取得合格證。4. 1. 3對于新進入本室的人員，如尚未取得PCR技

13、術培訓合格證，應在實驗室有培訓合格證的上級技術人員的指導下進行實驗工作，實驗報告由有資格人員出具，并應在最短的時間內(nèi)取得上崗 培訓合格證。4. 2 人員配置4. 2. 1 實驗室應根據(jù)工作需要配備足夠的工作人員，目前實驗室有主管技師2人、技師1人，3人都已獲得培訓合格證，視工作量的增加和業(yè)務發(fā)展需要，會適當增加工作人員。4. 2. 2 各級技術人員履行相應的工作職責。4. 3 人員培訓及考核4. 3. 1 實驗室負責人或負責人指定人員參加每年衛(wèi)生部PCR室間質(zhì)評總結會。4.3.2 實驗室工作人員每 12年至少參加1次PCR技術的省級或國家級繼續(xù)教育項目，參加相關學術交流會議。4. 3. 3 安

14、排未取得上崗培訓合格證的工作人員在合適的時間內(nèi)參加技術培訓。4. 3. 4 科室不定期組織實驗室內(nèi)部實驗人員學習、更新核酸擴增方面的相關知識，提升自身的理 論學習水平。特別是在標本接收區(qū)采血、接收標本的人員，需定期對其進行有關核酸擴增技術，標 本采集、保存、運輸?shù)戎R的培訓。一些科室的送檢標本由該科室的人員送到標本接收區(qū)，對這些 臨床醫(yī)護人員也要定期進行有關核酸擴增技術，標本采集、保存、運輸?shù)戎R的培訓。4. 3. 5本實驗室工作人員每年進行考核一次，考核內(nèi)容：a）日常工作質(zhì)量b）室內(nèi)質(zhì)控測評c）室間質(zhì)控測評凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-04主題內(nèi)容

15、PCR實驗室人員的配置及管理生效日期：2011-4-14第11貞共64貞d）在抱怨處理中的表現(xiàn)4. 3. 6本實驗室工作人員實行嚴格獎懲制度，有下列表現(xiàn)者可受獎：a）工作質(zhì)量高，質(zhì)控測評成績優(yōu)秀者b）有科研能力，并有一定數(shù)量和質(zhì)量的論文發(fā)表c）有獨創(chuàng)性工作成果，經(jīng)鑒定認可者d）受到有關部門或群眾嘉獎者有下列情況者將受到懲處：a）工作質(zhì)量問題較多，質(zhì)控測評成績不合格；b）不遵守規(guī)章制度并造成一定影響；c）不求上進。4. 3. 7本實驗室工作人員獎懲方法分精神及物質(zhì)兩類，經(jīng)實驗室上報醫(yī)院及有關部門批準后執(zhí)行。4. 3. 8本實驗室工作人員均建立業(yè)績檔案，實行能進能出制度，不斷吸收高質(zhì)量人員，加強培

16、訓和提高，對于不適合本室工作的人員要及時調(diào)離。4. 4人員管理4. 4. 1實驗室建立所有工作人員的技術檔案，包括：學歷、任職資格、發(fā)表論文、研究成果、培 訓等相關材料復印件。4 . 4. 2技術檔案分文本檔案和電子檔案，文本檔案每年更新1次，電子檔案隨時更新。5 .本文涉及以下表格實驗室主要負責人簡歷表PCR實驗室工作人員一覽表培訓申請表年度培訓計劃表培訓記錄表員工培訓履歷表人員檔案卡凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-05主題內(nèi)容PCR實驗室清潔程序生效日期：2011-4-141第12頁共64頁PCR實驗室清潔程序1 .目的：保證實驗室環(huán)境的整潔，防止污

17、染。2 .適用范圍：適于實驗室工作環(huán)境、實驗臺面、工作服、移液器等的清潔消毒工作。3 .負責人：操作人：4 .細則：4. 1實驗室地面必須平整、干凈，通道要利于通行，沒有無用的物品阻礙。4. 2合理規(guī)劃實驗室內(nèi)物品，做到擺放整齊、有序，無用的或使用效率低的物品放置到儲存處， 常用的物品要容易尋找到。4. 3抽屜、柜子、文件類物品要作好標記，以方便識別。4. 4實驗結束后用2%X二醛對臺面進行清潔，并用移動紫外燈進行消毒。4. 5每天對使用過的移液器用 75%酉精進行擦拭。每周1次對移液器咀進行 75%酉精浸泡15分鐘左 右，若使用過程中發(fā)生污染應隨時浸泡處理。4. 6實驗過程中如發(fā)生標本或試劑

18、外濺，應立即用2娥二醛滴上，濾紙蓋上半小時，然后用酒精擦洗，并用移動紫外燈消毒。4. 7每天實驗前開啟各區(qū)的通風系統(tǒng)，各區(qū)實驗結束后，分別打開傳遞窗紫外燈、 移動紫外燈（對實驗臺面消毒）、天花板紫外燈消毒實驗室，每次開啟3060分鐘。4. 8待紫外燈消毒時間足夠后，依次關閉各區(qū)紫外燈并記錄。4. 9依次清潔三個區(qū)的實驗臺面和地面，各區(qū)清潔消毒工具均專用，不可混用，注意按照單一方 向流程的原則來進行清潔。4. 10處理好各區(qū)廢棄物，交醫(yī)院集中處理。4. 11每周將工作服交院洗衣房洗滌消毒，不同實驗區(qū)的工作服隔開洗滌。5.本文涉及以下表格實驗室清潔消毒記錄表垃圾處理記錄表凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科

19、 PCR室作業(yè)指導書文件編號：PCR -06主題內(nèi)容PCR標本唯一標識編號規(guī)則生效日期：2011-4-14第13貞共64貞PCRfc本唯一標識編號規(guī)則1 .目的：保證標本編號的唯一性，也是準確發(fā)放報告的基礎。2 .適用范圍：使用核酸擴增熒光檢測實驗室所開展的四種檢測項目：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、結核 桿菌、沙眼衣原體。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 1按檢測日期分類標記根據(jù)標本送檢的日期，每天的標本對應標記一種唯一的代號。如當天為2011年3月1日，則編為110301。6 . 2按檢測類型分類標記根據(jù)檢測項目的不同，每種檢測項目對應標記一種唯一的代號。如乙型肝炎病毒標記為B,丙型

20、肝炎病毒標記為HC結核桿菌標記為 T,沙眼衣原體為 Co7 . 3按驗單接收順序編號在同種檢測類型的驗單中，按驗單順序編號。如第一個檢測乙型肝炎病毒的驗單編為B01,第二個檢測乙型肝炎病毒的驗單編為 B02,第三個檢測結核的驗單編為 B03等。 4. 4特殊標本的編號如有特殊情況，應在標記前面增加特異字母區(qū)別開，如住院的單和門診的單、其它醫(yī)院送來的單和本醫(yī)院的單要區(qū)分開等。8 . 5編號步驟a）對當天送來的標本， 根據(jù)編號的基本原則編號， 每個樣本的每個檢測項目對應一個唯一的編號（如110301T04）。b）用筆在每張檢驗申請單和對應的樣品管上作好相同的標記。c）做好標本的接收記錄，每個樣本的

21、記錄都應包括以下信息：接收時間、醫(yī)院、科室、送檢醫(yī)生、患者姓名、性別、年齡、標本類別、標本狀態(tài)、送標本者、接收人、檢驗單號、標本唯一統(tǒng)編號等。d）處理好樣品、點樣后，將反應管放入擴增儀上開始擴增。f）擴增得到結果后，先在統(tǒng)計簿上填入結果，作好記錄，再一一把實驗結果填入相應申請單。g）發(fā)放檢驗報告單。5.本文涉及以下圖表：PCRF增接收標本記錄表凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：PCR-07主題內(nèi)容PCR基因擴增實驗室的要求生效日期：2011-4-14第14頁共64頁PC螳因擴增實驗室的要求1 .目的：規(guī)定在各區(qū)內(nèi)所進行的工作及其操作。2 .適用范圍：所有在本區(qū)內(nèi)進行的工作。3

22、 .負責人：操作人：4 .程序：實驗室分四區(qū)：標本接收區(qū)；試劑貯存、準備區(qū)；標本制備區(qū)；擴增區(qū)。進入各區(qū)嚴格按 照單一方向進行，即試劑貯存、準備區(qū)一一標本接收區(qū)一一標本制備區(qū)一一擴增區(qū)。各區(qū)及其設備、物品必須有明確的標記，嚴禁混用。進入PCR驗室的工作人員(含衛(wèi)生員)，都必須遵守實驗室的規(guī)則，尤其嚴格遵守進入 PCR實驗室的唯一流向。不可進入 PCRF增后區(qū)打掃衛(wèi)生，再返回擴增前區(qū)工作。防止非本 室工作人員串崗，進入本室。尤其不得為找人，而逆向誤入PCR實驗室?？倓t(1) PCR實驗室工作人員應具備醫(yī)學檢驗、微生物檢驗基本知識，大專以上學歷， 并受過PCR實驗的基礎知識和技能培訓。(2) PC

23、R實驗室分試劑準備，樣本準備，PCRT增和產(chǎn)物檢測四個室，各室的實驗物 品(含加樣器，試管架，吸頭，記錄紙，筆等) ，不得混用，須貼上標簽予以區(qū) 另I。(3) 實驗室技術人員必須嚴格按照PCR實驗室操作程序進行，包括實驗室擦洗。臺面消毒，離心管，吸頭的無菌滅活準備，儀器使用和廢棄物處理等。(4) 進入實驗室的工作人員必須更換各室不同的工作服(含帽和鞋)，勤換洗工作服，以及遵守實驗室的唯一流向的規(guī)定，嚴禁反向流動。(5) 進入PCR實驗室后區(qū)的物品不許帶進 PCR實驗室前區(qū)。每天實驗開始前，必須 清潔地面和消毒實驗室前區(qū)。實驗結束應紫外線消毒實驗臺面，產(chǎn)物分析室紫 外燈最好徹夜開啟，排風扇應晝夜

24、工作。每天下班前處理好廢物，應關好水、 電、煤氣和門窗。(6) 定期校準和維修 PCR儀、酶標儀及離心機、水浴箱等儀器設備。(7) 實驗室內(nèi)不得飲食、吸煙。4. 1標本接收區(qū)4.1.1 實驗人員進入該區(qū)須穿本區(qū)白色工作服，接收標本須戴一次性手套。4.1.2 記錄實驗室干、濕度，繪制冰箱溫度圖。使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每 項記錄，書寫工整詳細。凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：PCR-07主題內(nèi)容PCR基因擴增實驗室的要求生效日期：2011-4-14第15頁共64頁4.1.3 對送檢的標本實行雙簽制度，并仔細檢查是否符合檢測要求，對有不符合要求的標本及時通知相關科室重

25、新采樣，并作記錄，每份標本需給出唯一性編號。4.1.4 本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封好，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出實驗室。4.1.5 每次實驗結束后，清潔實驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。記錄紫外燈使用情況。4.2 試劑貯存、準備區(qū)4.2.5 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。4.2.6 準備好的試劑送入下一區(qū)，還原實驗臺面，將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將本區(qū)垃圾帶出實驗室。4.2.7 白色工作服留在本區(qū)。4.2.8 本區(qū)維持相對正壓狀態(tài)（開啟緩沖區(qū)的排氣扇）。實驗結束后，清潔實驗臺及地面打開紫外燈消毒30分鐘。4.3

26、 標本制備區(qū)4.3.5 實驗人員進入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用藍色工作服及拖鞋。實驗中須使用一次性帽子，戴手套，手套在實驗過程中疑有污染應立即更換。4.3.6 將傳入本區(qū)的試劑放入冰箱冷凍室試劑存放專區(qū)暫存。記錄實驗室干、濕度，繪制冰 箱溫度圖。4.3.7 將冰箱內(nèi)二周前的標本密封丟入垃圾筐，然后記錄標本的保存情況。4.3.8 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。4.3.9 按試劑盒說明書對標本進行處理，將處理好的標本在超凈工作臺內(nèi)加樣，記錄標本的處理過程。4.3.10 將加樣后的試劑傳送下一區(qū)，還原實驗臺面，關閉所有儀器，記錄儀器使用時間和運 行狀態(tài)。4.3.11 使用過的

27、離心管、吸頭須置于盛有10%84液的廢液缸中，實驗結束后方丟入垃圾袋，患者樣品應按有生物傳染性危險品對待。4.3.12 將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，將垃圾帶出本區(qū)。4.3.13 將藍色工作服留在本區(qū)。4.3.14 本區(qū)應避免不必要的走動，同時維持相對正壓狀態(tài)，實驗結束后，清潔實驗臺及地面打開紫外燈消毒 30分鐘。4.4 擴增產(chǎn)物檢測區(qū)4.4.5 實驗人員進入該區(qū)須在緩沖區(qū)更換專用粉色工作服及拖鞋。凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科PCR室作業(yè)指導書文件編號：PCR-07主題內(nèi)容PCR基因擴增實驗室的要求生效日期：2011-4-14第16頁共64頁4.4.6 記錄實驗室

28、干、濕度，繪制冰箱溫度圖。4.4.7 使用帶有本區(qū)標識的記錄本、紙和筆，每項記錄，書寫工整詳細。4.4.8 將傳入本區(qū)加樣后的試劑上機擴增。4.4.9 擴增完成后，記錄檢測結果，及時發(fā)放報告單，記錄儀器使用時間和運行狀態(tài)。4.4.10 將本區(qū)所有廢棄物分類裝入垃圾袋，封口，在垃圾筐上套好新的垃圾袋，然后將垃圾 帶出實驗室。4.4.11 將粉色工作服留在本室再離開實驗室4.4.12 嚴禁本區(qū)物品帶至其他區(qū)，該區(qū)需維持負壓狀態(tài)，排氣扇24小時排氣，實驗結束后清潔該區(qū)打開紫外燈照射，最好整夜消毒，記錄紫外燈使用情況。5.本文涉及以下表格PCR實驗室環(huán)境溫濕度記錄表冰箱溫度質(zhì)控圖實驗室清潔消毒記錄表垃

29、圾處理記錄表紫外消毒車消毒記錄表凱里市第二人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-08主題內(nèi)容PCR廢棄物的處理程序生效日期：20060808第17頁共64頁PC穗棄物的處理程序1 .目的：保證實驗室、實驗人員和外部環(huán)境的安全。2 .適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用化學試劑（ NaOH EDTA乙醇、生理鹽水等）、 實驗室廢棄物的處理；3 .負責人：操作人：4 .細則：4.1 科室職責應對本室工作人員講明本程序在預防交叉、實驗室污染及切斷傳播途徑中的重要性，并要求嚴格執(zhí)行。4.2 實驗室所有垃圾，裝入專用污物袋內(nèi)，各區(qū)備有：生活垃圾袋（黑色）及生物污染垃圾 袋（黃色

30、）。使用過的一次性消耗品（如試管、吸頭、離心管、等），先放入10項氯酸鈉溶 液中浸泡24小時后，再放入黃色垃圾袋內(nèi)， 使用過的手套、鞋套等直接放入黃色垃圾袋 內(nèi)交醫(yī)院集中處理。4.3 夾取標本的工具，如鉗、鐐、接種環(huán)、吸管等，用后均應消毒清潔， 進行微生物檢驗時， 應重新滅菌，金屬工具可燒灼滅菌或消毒液浸泡；玻璃制品干熱或壓力蒸汽滅菌。4.4 一次性塑料痰盂，用2娥二醛3浸泡24小時后，放入黃色垃圾袋內(nèi)交醫(yī)院集中處理。4.5 廢棄標本如血、尿、胸水、腹水、腦脊液、唾液、胃液、腸液、關節(jié)腔液等用10%84液浸泡24小時后，交醫(yī)院集中處理。4.6 盛標本的容器，若為一次性使用的紙質(zhì)容器及其外面包被

31、的廢紙，放入污物袋里交醫(yī)院處理；對可再次使用的玻璃、塑料或搪瓷容器，煮沸15分鐘或加入10啾氯酸鈉溶液浸泡 2 4小時，消毒液每日更換，消毒后用洗滌劑及流水刷洗，瀝干，用于微生物培養(yǎng)采樣者，用壓力蒸汽滅菌后備用。4.7 廢棄標本及其容器裝入黃色垃圾袋內(nèi)、封閉，交醫(yī)院污物處理中心處理。4.8 日常生活垃圾如紙屑等按一般垃圾交醫(yī)院處理。5 .本文涉及以下表格PCR1血標本處理交接表凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-09主題內(nèi)容基因擴增檢測及結果分析生效日期：20060808第18貞共64貞基因擴增檢測實驗及結果分析1、目的：保證擴增及結果分析的標準化、規(guī)范

32、化。2 .適用范圍：適用于本室使用的普通離心機。3 .負責人：肖靜 操作人：胡可存 蔣藝勤4、標準程序：4.1 基因擴增檢測標準程序：擴增反應前須先在樣本輸入模板上按照事先排好的標本位置 進行設置。每次實驗除待檢標本，還需包括：陰性對照、陽性對照、室內(nèi)質(zhì)控品各一份，一 組陽性標準品（4個梯度108、106 105、104）。4.1.1 打開電腦電源開關，進入 Windows NT界面。4.1.2 接著打開PCR電源開關，預熱 5分鐘。4.1.3 雙擊電腦桌面的 ABI Prism 5700 SDS Software圖標進入程序設置界面。4.1.4 單擊“文件”菜單中的“新建”命令，（或單擊工具

33、欄中的“新建”按扭）。在測定、容器和模板中做相應的選擇，點擊OK4.1.5 應用檢測管理程序，并將其添加到樣品板文檔中。4.1.6 檢測反應管，4.1.7 根據(jù)當次實驗所需條件編輯時間和溫度。運行樣品板文檔。4.2 結果分析標準程序：應按以下步驟進行： 全部曲線一一陰性對照一一陽性對照一一陽性室內(nèi)質(zhì)控品一一陽性標準品一一逐個分析（標出陽性標本和可疑標本）一一調(diào)整參數(shù)，獲得較好的標準曲線，顯示 定量結果一一登記，發(fā)報告。4.2.1 整體曲線的觀察：將所有曲線選中進行整體觀察1）觀察是否存在污染情況（包括標本污染和試劑污染），特別應注意大量曲線在同一 Ct值出現(xiàn)上漲的情況。2）觀察是否有光路傳導阻

34、滯或電壓波動等機器原因形成的異常曲線。4.2.2 陰性對照的分析陰性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陰性標本。作用：用以監(jiān)測實驗室和前處理過程中是否存在污染。4.2.3 陽性對照的分析陽性對照：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知陽性標本。作用：用以監(jiān)測實驗能否正常檢出陽性標本，避免假陰性的出現(xiàn)。凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-09主題內(nèi)容基因擴增檢測及結果分析生效日期：20060808第19貞共64貞4.2.4 室內(nèi)質(zhì)控品的分析室內(nèi)質(zhì)控品：試劑中加入與待檢標本進行同樣處理的已知濃度室內(nèi)質(zhì)控品。作用：用以監(jiān)控日常實驗的精密度。4.2.5

35、 陽性標準品的分析1）各梯度曲線的分布是否均勻，若各梯度曲線均未分開，則表明陽模稀釋可能存在問題，提示實驗中存在較大人為誤差。2）觀察各曲線的 Ct值是否在平日的正常位置。情況1:若出現(xiàn)低拷貝標準品做不出，而各曲線Ct值均后移，則判斷是否為試劑擴增效率下降（如試劑過期或保存條件不合格）。情況2:出現(xiàn)低拷貝標準品做不出，而高拷貝曲線Ct值均正常，則提示可能存在低拷貝陽性標準品的降解情況。3）每日必做104標準品，用作以下三方面監(jiān)控：一是否存在操作誤差，如加樣量過少等 原因?qū)е?04標準品未能檢出；二是否存在稀釋后的梯度放置過久，低拷貝標準品降解的情 況；三是若高拷貝標準品出現(xiàn)Ct值后移，且能排除

36、情況 1、2,則判斷是否為試劑靈敏度下降。4.2.6 單個曲線的判斷：逐個分析每條曲線，判斷曲線的陰陽性或?qū)倏梢汕€。（可疑標本是指曲線在25個Ct值后出現(xiàn)上漲且平臺趨勢不明顯或上漲幅度比較低的標本?？梢蓸吮疽诙熘刈觯瑑纱谓Y果一致則報陽性，否則結果報陰性。 ）曲線觀察內(nèi)容：在基線選擇28時觀察熒光強度（是否有三期特征）。并分別在Delta Rnvs.Cycle 、Ct vs.Well Number 和Rn vs.Cycle 這三種擴增圖形式下分析數(shù)據(jù)。4.2.7 得出定量結果：調(diào)節(jié)基線和閾值以得到一較好的標準曲線。電腦據(jù)此曲線給出陽性 結果值。此時應排除某些陰性標本因熒光曲線假性上揚而得出

37、的假陽性結果和某些弱陽性 標本因終末熒光值過低而顯示的假陰性。4.2.8 發(fā)放報告：及時登記檢測結果記錄，發(fā)放臨床報告。4.3 實驗結果無效的判斷標準：出現(xiàn)下述四種情況中的任何一種或多種，當次實驗結果不可 發(fā)，查找原因，重做實驗。4.3.1 陰性對照出現(xiàn)擴增。4.3.2 陽性對照無擴增。4.3.3 大批甚至所有的標本都擴增了。4.3.4 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測結果出現(xiàn)失控情況，實驗失控的具體標準詳見室內(nèi)質(zhì)控標準操作程序。4.4 實驗結果有效的判斷標準：達到下列要求后，當次實驗有效，可以發(fā)放結果。凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-09主題內(nèi)容基因擴增檢測及結果

38、分析生效日期：20060808第20貞共64貞4.4.1 陰性對照沒有擴增，陽性對照擴增。4.4.2 陽性標準品梯度曲線平滑均勻，斜率、截距和相關系數(shù)三個參數(shù)的數(shù)值均在范圍內(nèi)。4.4.3 室內(nèi)質(zhì)控血清檢測結果處于在控狀態(tài)，具體標準詳見5.本文涉及以下表格室間質(zhì)評記錄表PCR室內(nèi)質(zhì)控記錄表室內(nèi)質(zhì)控圖凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導 書文件編號：ABCD-3-PR-10主題內(nèi)容臨床標本的保存操作程序生效日期：20060808第21人共64人臨床標本的保存操作程序1 .目的：臨床標本正確保存，以便必要時復查。2 .適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3 .負責人：操作人：4 .程序：

39、5 . 1處理前的標本保存a） HBV全血標本可4 c下短期（24h內(nèi)）保存，長期保存則需分離出血清（血漿），保存于-20 C下。d） HCV在1小時內(nèi)分離血清，吸取 200口，加入20u Rnasin，保存于-20 C。盡可能快的提取 RNAc） TB:痰或胸腹水、腦脊液、膿液標本用于TB檢測的短期保存可置于 4c下，長期保存則于-20 C下。d） CT:標本短期（24h內(nèi)）保存置于4c下，長期保存則需在-20C下。4. 2報告發(fā)出后的標本保存：a）提取的核酸標本當天檢測可置4c保存，如當天不檢測應置 -20 C保存。報告發(fā)出后第二天丟棄。b）原始血清/血漿樣本在報告發(fā)出后放入低溫冰箱-20

40、C保存1個星期，以備復查。超過 1個星期保存期的標本由室負責人酌情處理，一般按生物傳染性物品交醫(yī)院統(tǒng)一處理。c）血清/血漿標本放置低溫冰箱保存時須有記錄，按編號順序存放，并由專人負責管理。4 . 3特殊標本的處理：對暫不檢測的項目和規(guī)定時間外收到的零散樣本，要隨時登記和交班，以免漏檢，遺失和延誤檢驗。對特殊樣本或特殊病人的樣本，實行“首接”負責制，所謂特殊樣本是指難于采集的樣本，以及特殊病 人的樣本一律實行“首接”負責制，無論那位工作人員，一旦收到樣本后，均須負其責任，不得以任何 借口推托，及時和正確保管和轉送樣本到有關實驗室或有關人員，同時作交班記錄和雙簽名。對于做長 期病情動態(tài)考察的病人標

41、本一律置于 -20 C下長期保存，使用時再按需取出檢測。5 .本文涉及以下圖表：PCRT增接收標本記錄表拒收標本記錄本標本超低溫保存記錄表凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-11主題內(nèi)容臨床標本采集運送接收程序生效日期：20060808第22貞共64貞臨床標本的采集、運送、接收程序1 .目的：規(guī)范臨床待檢標本的正確采集、送檢和處理。2 .適用范圍：分子診斷室的所有臨床檢測標本。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 1標本的采集4. 1. 1標本由臨床各科室接受過臨床基因擴增檢測有關標本采集、保存、運輸知識培訓的醫(yī)護人員采集并 送至實驗室。4.1.2標

42、本采集要求a）血液標本：用2ml真空采集管或1.5ml高壓滅菌離心管采集血液標本，血標本采集后在2小時內(nèi)送達實驗室（HC原用EDTAt凝的血漿）。離心（檢驗單與標本一道）后用一次性吸管吸取血清或血漿加 入經(jīng)消毒的1.5ml的離心管中，編號。b）痰標本：用帶蓋的無菌一次性塑料瓶收集清晨第一口痰標本送檢。（對于無痰或少痰的患者，可用45c加溫的100g/L NaCl水溶液霧化吸入或改變體位以使痰液易于咳出；對于小兒可以輕壓胸骨柄上 方以誘導咳痰，用消毒棉拭子刺激喉部引起咳嗽反射，用棉拭子采集標本。）標本在室溫下保存不能超過24小時。c）生殖道拭子：尿道或陰道分泌物由醫(yī)生用專用取樣拭子（滅菌，一次性

43、）采集樣本，及時送檢。采 集生殖道拭子標本，要求男性病人在采樣前2小時內(nèi)不能排尿，采樣時，將棉拭子伸入男性尿道及女性宮頸口 23cm,轉動一周以獲得上皮細胞。d）尿液：由病人自留尿液于無菌封閉的杯中送檢。e）腦脊液和胸腹水：由臨床醫(yī)生采集后放入消毒的試管中及時送檢。注意：所有上述用于臨床標本采集的容器如試管或離心管，均應使用前高壓滅菌和密封。4. 2標本的運送標本采集后，密閉、標（貼）姓名，應盡可能快的送至檢測實驗室，如運送時間需2小時以上，必須用冰盒送至實驗室。標本中如加入了適當?shù)姆€(wěn)定劑，如用于RNAM定加入4mol/L異硫鼠酸月瓜鹽（GITC）的血清（漿）標本和用于DNAM定的EDTA抗凝

44、血等，則可在室溫下運送或郵寄。5. 5接收4. 5. 1嚴格對各類樣本的查對和雙簽制度，對病房各樣本及時進行驗收，查對，不符合要求的樣本一律退 回，并有書面記錄。4. 5. 2分類驗證凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-11主題內(nèi)容臨床標本采集運送接收程序生效日期：20060808第23貞共64貞4. 5. 2. 1 一般內(nèi)容進入實驗室的樣本在進行編號、離心前，工作人員應再次認真查對姓名，聯(lián)號，住院號，病區(qū)床號，項目等。對不符合要求者應作記錄，并及時通知采樣科室，正確及時地補采樣，以免延誤病人的檢測結果報告。對書寫不清楚的申請單，當事者要及時與病房聯(lián)系（

45、可電話），明確受檢者姓名，住院號，性別，年齡，病區(qū)，床號和檢驗項目等；并作相應記錄。4. 5. 2. 2 按檢測項目驗證標本a） HBV所需標本類型為未溶血的血清或血漿，注意血漿標本所用的抗凝劑，用EDTA-K,不可使用肝素。標本為全血時應及時分離出血漿保存。b） HCV同上，但標本為血清時，要在1小時內(nèi)分離出血清用于檢測。c） TB:晨起第一口深部痰（不能為唾液）、胸腹水、腦脊液、膿液或穿刺液。d） CT尿道或陰道分泌物。4. 5. 2. 3實驗室人員對標本進行查驗，出現(xiàn)下表中不合要求的情況時，應拒收標本，登記并告知相關科室。類別拒收原因1未正確使用抗凝劑的標本造成凝血的標本2嚴重溶血3嚴重

46、脂血4采血量不足（血清v 200uL、全血v 1mD5檢測項目TB的標本是唾液而不是晨痰6標本容器破裂，標本被污染7標本的病人姓名、年齡、性別等與檢驗單不相符8RNA檢測，采樣時間超過 2小時9其他可能嚴重影響檢驗結果的原因4. 5. 2. 4拒收程序a）對拒收的不合格標本應在拒收標本記錄本上登記。b）填寫不合格標本處置單，并隨同申請單送返送檢科室。c）必要時電話告之相關科室醫(yī)生或護士。5. 本文涉及以下圖表：PCRT增接收標本記錄表PCRT增拒收標本記錄表凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-12主題內(nèi)容PCR生物安全防護措施生效日期：20060808第

47、24貞共64貞PC性物安全防護措施1 .目的：預防工作人員在實驗過程中被感染或污染。2 .適用范圍：適用于本室所有工作人員。3 .負責人：操作人：4 .細則：4. 1實驗人員在實施生物防護措施時，應嚴格遵守各項相應的規(guī)章制度，建立起強烈的生物防護意識。4. 2每天更換廢液缸的2峨二醛溶液，并保證 2%X二醛溶液用量為廢液缸內(nèi)總液量的五分之一左右。配置消毒液時，正確量取足量的消毒劑（用量杯，保證濃度），水的用量也要正確，缸體密封性良好。4. 3實驗臺面日常清潔時使用 75%勺酒精擦拭。4. 4每區(qū)每次實驗后紫外燈照射 3060分鐘，如有需要可延長照射時間。4. 5所有來自病人的血液或體液標本均應

48、視作傳染源，因此在標本的采集、運輸過程中，標本容器應 完好無泄漏。4. 6處理標本時應穿工作服、戴手套，以免沾上皮膚。如手或其它部位的皮膚沾上血液或體液標本以 及試劑，應立即沖洗干凈。有下列情況之一者，需另外消毒：手接觸有傳染性的微生物，水龍頭、 水池肥皂可能被污染，工作服可能被大量細菌污染。消毒劑可用“84”消毒液。4. 7在實驗過程中，病人標本（血液、體液）或試劑不慎濺入眼內(nèi)應立即用清水洗。4. 8實驗過程中在使用針具等銳器時，盡量小心防止受傷。若被銳器刺破時，應立即脫下手套，盡量 擠壓傷處，使血流出，然后用碘酒、酒精消毒，必要時進行預防補救措施。4. 9 在實驗過程中病人標本（血液、體液

49、）外漏時，應立即用2%戈二醛滴上，濾紙或紗布蓋上半小時,然后用酒精擦洗，并用紫外燈消毒。4. 10實驗完畢離開時，應脫下所有該實驗區(qū)個人防護裝備。4. 11實驗完畢后應對實驗室進行紫外消毒。4 . 12遇有意外事故應立即報告科室負責人，當事人應立即注射相關疫苗或進行預防性治療，并進行醫(yī) 學觀察，嚴重者應報告院技術負責人。5 .本文涉及以下表格紫外消毒車消毒記錄表實驗室清潔消毒記錄表凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-13主題內(nèi)容PCR實驗室化學試劑配制程序生效日期：20060808第25貞共64貞PC改驗室化學試劑配制程序1 .目的：保證實驗中用到的各種

50、溶液符合實驗要求。2 .適用范圍：核酸擴增熒光檢測實驗室常用溶液：4%NaOHm、75%酉精、消毒劑（三氯異氧尿酸或二氯異氧尿酸鈉）、2%X二醛溶液等。3 .負責人：操作人：4 .程序：5 . 4化學試劑的配制：4. 4. 1用具：干燥潔凈的250ml量桶一只，1000ml量桶一只，1000ml燒杯一只，三角燒瓶兩只，天平一架， 100ml塑料試劑瓶、2000ml廣口瓶各一只。4. 4. 2配制步驟：4. 4. 2. 1 配制 4%NaO皤液：a）用天平稱取4克分析純的NaOH固體，置于一只三角燒瓶中。b）用250ml量桶準確取100ml水，緩緩注入盛放 NaOHK體的三角燒瓶中。c）搖蕩三角

51、燒瓶使 NaOHK體充分溶解。d）然后緩緩傾倒入 100ml塑料試劑瓶中密封保存?zhèn)溆谩?. 4. 2. 2配制消毒劑:a） 一般桌面、器具和地面的消毒只要使有效氯達到500mg/L,即可達到消毒作用。b）消毒劑為粉狀（20克/袋），如配制一升的消毒劑溶液，則取500g,倒入燒杯中，緩緩加入 1000ml水充分溶解，備用。c）如需加大消毒力度，則有效氯濃度加大。4. 4. 2. 3配制75%酉精溶液：a） 一般常規(guī)消毒的 75%酉精由醫(yī)院藥劑科提供。b） RN碾取的75%酉精的配制，i3t劑盒提供 DEPCK,酒精用分析純的無水酒精，根據(jù)當天的標本數(shù)量 進行配制。4. 4. 2. 4配制2娥二醛

52、溶液：a）準確量取戊二醛原液 20ml倒入1000ml燒杯中。b）量取980ml水，緩緩倒入1000ml燒杯中，混勻，加至 2000ml廣口瓶中備用。注意事項：每份配制好的溶液保質(zhì)期為14天凱里市第二 人民醫(yī)院檢驗科 PCR室作業(yè)指導書文件編號：ABCD-3-PR-14主題內(nèi)容PCR實驗室記錄管理制度生效日期：20060808第26貞共64貞PCR實驗室記錄管理制度1、目的：確保檢驗資料的記錄、保存狀態(tài)在控2、適用范圍：實驗過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)、文本資料的記錄3.負責人：操作人：4、工作程序：4.1 書面記錄文件的管理：4.1.1 本實驗室的書面記錄包括：001 ABCD人民醫(yī)院檢驗科基因檢測實驗室平面圖 編號ABCD/001002實驗室主要負責人簡歷表 編號ABCD/002003PCR實驗室工作人員一覽表 編號ABCD/003004PCR擴增接收標本記錄表 編號ABCD/004005拒收標本記錄本 編號ABCD/005006標本超低溫保存記錄表 編號ABCD/006007PCR試劑購買記錄表 編號ABCD/007008試劑驗收記錄表 編號ABCD/008009PCR室特殊耗材驗收記錄表 編號ABCD/009010普通耗材驗收記錄表 編號ABCD/010011室間質(zhì)評