畢赤酵母發(fā)酵-ppt課件

1、 題目題目 Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisom biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris 畢赤酵母不同發(fā)酵進(jìn)程中乙醇氧化酶啟動(dòng)子和過氧物酶體生物合成 的調(diào)控規(guī)律 文章來源：Journal of biotechnology 1背景介紹 2實(shí)驗(yàn)材料和方法 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 4結(jié)論與分析 1.2過氧物酶體(Peroxisome)：遍布于真核生物的細(xì)胞器中, 用來去除有害物質(zhì). 它們用外表的單層膜與細(xì)胞的原生質(zhì)分隔開來, 膜上有功能

2、重要的膜蛋白, 用以向細(xì)胞器中輸入蛋白質(zhì)和促進(jìn)細(xì)胞分裂. 與溶酶體不同的是, 過氧物酶體不是由分泌通路產(chǎn)生, 而是通過先漲大后分裂的自我復(fù)制過程產(chǎn)生, 當(dāng)然也有證據(jù)顯示新的過氧物酶體可以直接產(chǎn)生. 過氧物酶體是由比利時(shí)細(xì)胞學(xué)家德迪夫(Christian de Duve)在1965年發(fā)現(xiàn)的. 1.1醇氧化酶AOX1基因啟動(dòng)子作為甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子,在Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白中得到廣泛應(yīng)用。P.pastoris中的轉(zhuǎn)錄因子通過特異的順式作用元件與啟動(dòng)子相互作用而影響基因的轉(zhuǎn)錄,因此通過調(diào)節(jié)AOX1基因啟動(dòng)子的活性可以控制下游基因的表達(dá) 背景介紹 1. 3GFP-SKL（過

3、氧化物酶體定位蛋白）,該載體含有融合了過氧化物酶體定位信號(hào)1(PTS1)的綠色熒光蛋白報(bào)告分子GFP-SKL編碼基因 成功地用于描述不同 時(shí)間進(jìn)程的AOX1啟動(dòng)子和過氧物酶體生物合成因素的特征 1.4泛素蛋白（細(xì)胞液中的短周期熒光蛋白）泛素(ubiquitin)是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的小蛋白。它的主要功能是標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解。當(dāng)附有泛素的蛋白質(zhì)移動(dòng)到桶狀的蛋白酶的時(shí)候，蛋白酶就會(huì)將該蛋白質(zhì)水解二：實(shí)驗(yàn)材料和方法2.1：質(zhì)粒的構(gòu)建表達(dá)GFP- SKl pGLY11245或pGLY13173 轉(zhuǎn)化YGLY27355或YGLY31884 YGLY14836生產(chǎn)單克隆IgG1抗體

4、 表達(dá)Ub-R-GFP pGLY10148轉(zhuǎn)化 YGLY19309或YGLY29325 生產(chǎn)單克隆IgG1抗體 2.2：轉(zhuǎn)化：畢赤酵母感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化的方法（參見nvitrogen公司的Pichia酵母表達(dá)手冊(cè)）2.3：補(bǔ)料分批培養(yǎng)條件 研究了三種不同發(fā)酵條件下的PpAOX1啟動(dòng)子（ YGLY29325 ）和過氧化物酶體生物合成（ YGLY31884 ）的調(diào)控。 誘導(dǎo)階段分批補(bǔ)料條件 ML:甲醇的起始供應(yīng)速率為2.6gl/lh然后在0.0063/h的基礎(chǔ)上以冪指的形式增加 SML:甲醇培養(yǎng)20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培養(yǎng)8h作為一個(gè)周期共培養(yǎng)3個(gè)周期 OL:甲醇進(jìn)料保持反應(yīng)器中甲

5、醇1，每當(dāng)DO迅速增加，這表明甲醇消耗。 DO級(jí)聯(lián)被打開，關(guān)閉和攪拌速度 被減小到實(shí)現(xiàn)氧氣的限制2.4 GFP表達(dá)的定量和可視化： 約107固定的酵母細(xì)胞經(jīng)PBS洗后用mounting solution重懸制作切片用Axioscope 2 Plus 顯微鏡來觀察OpenLAB軟件來實(shí)現(xiàn)相機(jī)控制和圖像收集Volocity軟件用來量化GFP在細(xì)胞中的強(qiáng)度 2.5抗體效價(jià)的測(cè)定 在培養(yǎng)上清液中于280nm處抗體濃度用二極管陣列檢測(cè)器和蛋白A親和柱與HPLC系統(tǒng)2.6:細(xì)胞裂解 從畢赤酵母細(xì)胞釋放細(xì)胞外的DNA使用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 雙鏈DNA檢測(cè)試

6、劑盒檢測(cè)3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論 通過熒光顯微術(shù) UB - R- GFP和GFP- SKL被正確地定位于細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體，符合預(yù)期 3.1: 3.2:YGLY29325的三種不同的補(bǔ)料分批發(fā)酵條件的取樣數(shù)據(jù)(a) 甲醇限制 (ML); (b) 葡萄糖培養(yǎng)8h甲醇培養(yǎng)(20 h) (SML); (c) 氧氣限制并額外增加1%甲醇（OL）DO (%) ：黑色直線，甘油或葡萄糖：藍(lán)色,甲醇:紅色。細(xì)胞濕重：黑色三角 3.3畢赤酵母AOX1啟動(dòng)子（YGLY29325）根據(jù)三種不同的補(bǔ)料分批條件規(guī)制 - 甲醇 - 限制（ML），切換與葡萄糖和甲醇（SML）和氧氣限制（OL）補(bǔ)料分批條件。 （a） GFP熒光

7、表達(dá)圖像（b）不同誘導(dǎo)時(shí)間的熒光蛋白相對(duì)密度。對(duì)于ML和OL，時(shí)間表示分批階段（T1），甘油補(bǔ)料分批階段誘導(dǎo)前（T2）和誘導(dǎo)期（T3，102小時(shí); T4中，362小時(shí); T5，622小時(shí); T6，842小時(shí)）。對(duì)與SML條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)是在T2，T4和T6 葡萄糖階段，誘導(dǎo)是在T3和T5甲醇階段 3.4：ML，OL，及（b）SML - 過氧化物酶體的生物合成三種不同的培養(yǎng)條件下比較。 SML：切換葡萄糖和甲醇進(jìn)料。在過氧化物酶體中使用GFP-SKL（YGLY31884）進(jìn)行定量測(cè)定。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示在兩個(gè)獨(dú)立的運(yùn)行平均值。星號(hào)（*）表示甲醇階段 3.5三種不同的工藝條件下（YGLY29325）發(fā)酵特

8、性 - ML，OL和SML。 （一）細(xì)胞的密度分布（gWCW/ L）; （二）細(xì)胞列解指數(shù)（毫克 DNA/ L）; （三）抗體效價(jià)（毫克/升）; （d）OL條件下延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間的細(xì)胞密度和抗體效價(jià)。 3.6 在甲醇補(bǔ)料階段的代謝過程（a）甲醇限定（ML）（b）氧受限（OL）條件下補(bǔ)料分批巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)。4結(jié)論與分析 在這項(xiàng)研究中，我們調(diào)查AOX1啟動(dòng)子和過氧化物酶體如何被調(diào)節(jié)以響應(yīng)碳源（例如甲醇）和氧氣分子的可用性 在蛋白質(zhì)生產(chǎn)階段，以更好地了解在畢赤酵母發(fā)酵常用的工藝條件。AOX1啟動(dòng)子是在ML最活躍下，但OL下不太活躍。過氧化物酶體的生物合成顯示對(duì)甲醇的消耗高度依賴。在碳限制補(bǔ)料流加過程中過氧化物酶