肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測課件

1、肺炎肺炎(F IY N)支原體及耐藥位點核酸檢測支原體及耐藥位點核酸檢測第一頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測1流行病學分析2肺炎支原體耐藥現狀3 大環(huán)內酯抗生素耐藥機制目錄CONTENT5肺炎支原體耐藥與臨床3 體內誘導耐藥株第二頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測第三頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測Part 141肺炎支原體及耐藥突變(tbin)檢測項目(xingm)簡介第四頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測 p1302第五頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測兒童(r tng)肺炎支原體肺炎 社區(qū)獲得性肺炎社區(qū)獲得性肺炎(Community

2、acquired pneumonia,CAP)肺炎支原體肺炎肺炎支原體肺炎 (Mycoplasma pneumoniae,MP)MP 占CAP的1040%。支原體支原體：是介于細菌與病毒之間的微生物。已發(fā)現(fxin)約60種，14種可致病.致呼吸道感染：肺炎支原體最常見，沙眼衣原體次之。第六頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測實驗室診斷實驗室診斷(zhndun)：病原學檢查病原學檢查包括包括：培養(yǎng) 血清學（特異性：Ag、Ab；非特異性）、 核酸診斷技術（PCR ）分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)： （1）咽喉、鼻咽、胸水或體液中分離培養(yǎng)出MP是診斷MP感染的可靠標準。 （2）需1014天或更長，早期

3、(zoq)診斷意義不大，用于回顧性診斷和研究。 （3）快速培養(yǎng)敏感性和特異性均不高，價值有限。1.兒童肺炎支原體肺炎診治專家共識(n sh). 中華實用兒科臨床雜志.2015，30（17）：1304第七頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測病原學檢查病原學檢查(jinch)：血清學：血清學特異性診斷特異性診斷：檢測抗原和抗體 1. 1.明膠顆粒凝集試驗明膠顆粒凝集試驗（PA）：檢測IgM和 IgG混合抗體。 單次抗體滴度1:160，診斷近期感染參考價值。 恢復期和急性期雙份抗體滴度：4倍/4倍以上增高/減低時，確診價值 2.2.酶聯(lián)免疫吸附試驗酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：可分別(fn

4、bi)檢測IgM和IgG， 單次MP-IgM陽性：對診斷MP的近期感染有價值。 恢復期和急性期IgM或IgG抗體滴度呈4倍或者4倍以上增高或減低時，可以確診為MP感染。 非特異性診斷非特異性診斷：冷凝集試驗冷凝集試驗（CA），參考價值。 MP感染時陽性率僅為50%左右； 腺病毒、巨細胞病毒、EB病毒等感染也可誘導血清冷凝集素的產生。1.兒童社區(qū)獲得性肺炎管理指南(zhnn). 中華兒科雜志.2013，51（10）：7452.成人肺炎支原體肺炎診治專家共識，中華結核和呼吸雜志，2010,33（9）：643第八頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測病原學檢查病原學檢查(jinch)：血清學：

5、血清學MP-IgM：(1) 病程病程：感染后早期抗體，一般感染后45天出現，檢測太早可假陰性。持續(xù) 13個月甚至更長；(2)年齡年齡： 嬰幼兒免疫功能不完善，產生抗體能力低，可出現假陰性或者低滴度的抗體，評價結果時需考慮患兒的病程及年齡。(3) 廠家及方法廠家及方法：試劑盒生產廠家和檢測方法不同，判斷(pndun)的陽性結果值有所差異。第九頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測病原學診斷(zhndun)：核酸診斷(zhndun)技術方法：RT-PCR、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術、RNA恒溫擴增實時熒光檢測（SAT）技術等。優(yōu)點：（1）特異性強、敏感、快速，可用于早期診斷。（2）核酸擴

6、增技術不受年齡、抗體產生能力、病程早晚(zown)及用藥因素干擾，感染早期檢測率最高。注意：與感染后攜帶狀態(tài)鑒別。 有研究顯示，MP感染后1個月，其DNA的檢出率仍然高達50%， MP-DNA持續(xù)攜帶的中位數時間為7周，個別達7個月之久。聯(lián)合檢測：血清學和核酸檢測聯(lián)合，提高檢出率。第十頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測小結(xioji)無論是分離培養(yǎng)， 血清學檢測， 還是分子生物學檢測， 都存在各自的局限性， 目前學者多推薦采用 2 種或 2 種以上診斷方法相結合，以提高診斷的準確性。針對不同的診斷方法，具體分析實驗中出現的結果不一致現象，適當調整試驗方法， 綜合考慮臨床、 經濟性以

7、及可操作性等問題，探索并制定(zhdng)出更適合于臨床的快速、 準確、 經濟的診斷方法， 必將推動 MP 感染臨床診斷和治療的進一步發(fā)展。 第十一頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測治療肺炎支原體肺炎常用(chn yn)抗菌藥物：大環(huán)內酯類 氟喹諾酮類四環(huán)素類抗感染治療的療程通常需要10-14天，部分難治性病例的療程可延長至3周左右用藥治療第十二頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測大環(huán)內酯類大環(huán)內酯類：首選(shu xun)機理機理：與MP核糖體的特殊靶位的蛋白質結合，阻斷(z dun)轉肽酶作用，感染mRNA移位，選擇性抑制MP蛋白質合成。種類種類： 第一代：紅霉素 第二代

8、：阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素； 第三代酮內酯類：泰利霉素（telithromycin）,塞紅霉素（cethromycin)用于MP治療的主要是1、2代，三代尚未用于兒童。兒童社區(qū)(sh q)獲得性肺炎管理指南（2013修訂），中華兒科雜志，2013,51（10）：745第十三頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測大環(huán)內酯類抗生素耐藥形勢嚴峻！大環(huán)內酯類抗生素耐藥形勢嚴峻！自2001年日本首次分離到對大環(huán)內酯類抗生素耐藥的MP后，世界多 國相繼報道出現MP耐藥株，日本及中國MP耐藥率明顯高于其他國家。日本MP對大環(huán)內酯類抗菌藥物的耐藥率達到40%；美國MP耐藥率大約8.3%；多數歐洲(u

9、 zhu)國家，耐藥率低于10%；在中國，有報道住院兒童MP耐藥率80%，成人耐藥率約為69%。第十四頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測我國肺炎支原體對大環(huán)內酯藥物(yow)耐藥嚴重 我國北京、上海兩家醫(yī)院，兒童呼吸道感染患者中肺炎支原體對大環(huán)內酯類抗生素的耐藥率已經(y jing)超過了80%Diagn Microb Infect Dis，2010(in press)/AAC 2009; 53: 21582159 / AAC 2008;52: 348350 Clin Microbiol Infect. 2009 Sep 17. Epub ahead of print /J Clin

10、 Microbiol.2007; 45:35343539 第十五頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測肺炎(fiyn)支原體對于大環(huán)內酯類的耐藥率高達69%356例成人患者中共分離到67株肺炎支原體： CAP患者肺炎支原體的分離率顯著高于急性上呼吸道感染(gnrn)患者 69%(46株) 肺炎支原體對于紅霉素耐藥(MIC值32 g/mL)Clin Infect Dis 2010;51:189194 第十六頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測大環(huán)內脂類抗生素耐藥機制大環(huán)內脂類抗生素耐藥機制(jzh)研究發(fā)現，MP的耐藥機制(jzh)與大環(huán)內酯類抗生素的的結合位點有關，其中在23S

11、rRNA上的2063和2064兩個位點的點突變，是引起 MP對大環(huán)內酯類抗生素耐藥的主要原因。研究顯示，發(fā)生耐藥位點（2063位點和2064位點）突變的MP感染患者與未發(fā)生突變的MP感染患者相比，不僅發(fā)熱時間、住院時間和大環(huán)內酯類藥物的起效時間更長，且肺外并發(fā)癥的發(fā)生率更高，影像學結果顯示病情更嚴重。耐藥突變給臨床治療帶來眾多問題，如患兒的臨床癥狀加重、肺外并發(fā)癥增多、住院時間延長、治療經費增高等。第十七頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測非大環(huán)內酯類：四環(huán)素類四環(huán)素類 包括：包括：多西環(huán)素、米諾環(huán)素/美滿霉素、替加環(huán)素、 作用作用：對MP強大的抑菌活性。 機理機理：作用于MP核糖體3

12、0S亞基，抑制蛋白質合成的肽鏈延長。 副作用副作用：可能使牙齒發(fā)黃或者牙釉質發(fā)育不良等，應用(yngyng)于8歲以上患兒。第十八頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測非大環(huán)內酯類：喹諾酮類喹諾酮類機理機理：與MP的DNA 解旋酶和拓撲異構酶發(fā)生交替作用，干擾和抑制蛋白質合成，對MP有抑制作用。品種品種：呼吸喹諾酮（左氧氟沙星、莫西沙星、吉米沙星）抗MP活性及組織(zzh)穿透性、吞噬細胞內濃度均良好。環(huán)丙沙星抗MP活性好，但組織穿透性差；諾氟沙星、伊諾沙星抗MP活性差。副作用副作用:可能對骨骼產生不良影響，18歲以下兒童使用受到限制。目前在國內外尚未發(fā)現對喹諾酮類、四環(huán)素類耐藥的肺炎支

13、原體菌株報道。成人肺炎支原體肺炎診治專家共識，中華結核和呼吸(hx)雜志，2010,33（9）：643第十九頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測耐藥檢測(jin c)方法體外藥敏方法集患兒的咽拭子標本，接種于MP培養(yǎng)基中，混勻后置于37 二氧化碳孵箱中培養(yǎng)，對培養(yǎng)陽性的MP菌株進行體外藥敏試驗，測定其紅霉素的最小抑菌濃度(MIC)，從而判斷是否為耐藥株。常規(guī)體外藥敏試驗方法是以MP培養(yǎng)為中心，但由于MP對營養(yǎng)條件要求高，培養(yǎng)所需時間較長(至少20天或更長時間)，分離陽性率低，故此方法不能及時的指導臨床治療，僅能作為回顧性的診斷和研究。分子藥敏試驗直接提取所采集咽拭子標本的DNA，運用P

14、CR方法擴增與大環(huán)內酯類抗生素耐藥有關的靶位基因，擴增產物進行DNA測序，測得序列與NCBI登錄的MP標準株M129的相應基因序列作比對，檢測耐藥基因的變化。此方法能直接檢測臨床標本中的MP及其耐藥性，具有特異性強、敏感性高、快速等優(yōu)點，應用在分離難度大、耗時長的MP更有意義，有非常廣泛的應用前景。實時PCR檢測方法法國Peuchant O等應用實時PCR檢測MP的耐藥性，制定了一種雙重實時PCR檢測與大環(huán)內酯類耐藥有關的23S rRNA的6種突變和一種單一實時PCR鑒定A2063G突變。這兩種方法依賴于熒光共振能量轉移結合熔解曲線分析，、并直接適用于檢測呼吸道I臨床標本。但兩種實時PCR方法

15、的局限性在于，對每種探針來講，檢測低限均為10拷貝ml。該方法具有特異性強、準確、快速等優(yōu)點，但由于對實驗室條件和技術人員要求較高、經濟耗費高等原因，尚不適宜廣泛應用第二十頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測第二十一頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測檢測檢測(jin c)(jin c)MP-DNAMP-DNA及耐藥突變位點意義及耐藥突變位點意義m采用熒光PCR技術，可以一步檢測，同時解決兩大問題，明確病原體的同時確定是否耐藥，即時給出用藥指導。意義：m1、直接檢測病原體，早期、快速、特異診斷；有利于臨床癥狀分析及病情監(jiān)測； 2、對患者進行MP耐藥基因突變檢測，不僅可以輔助臨床

16、醫(yī)生及時診斷和監(jiān)測病情，同時有利于指導醫(yī)生合理用藥，避免濫用抗生素 ， 3、有利于選擇合理治療方案，針對性治療；有利于預判病程發(fā)展，向病人及家屬解釋(jish)病程情況 第二十二頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測耐藥MP感染(gnrn)的治療抗生素治療對于耐藥MP感染來說，目前可應用為紅霉素、阿奇霉素序貫療法，即紅霉素靜滴37天，口服阿奇霉素3天，停4天，7天為一個療程，根據病情按此方案重復24次，此治療方案不良反應小、依從性好，效果滿意。對于重癥病例也可聯(lián)合使用利福平和大環(huán)內酯類藥物，兩者對MP有著協(xié)同的抑蔚作用(zuyng)。如患兒年齡大于8歲，使用大環(huán)內酯類藥物治療效果不滿意時

17、，可使用四環(huán)素類藥物如米諾環(huán)素，因其作用機制不同，故對耐藥MP有一定療效。第二十三頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測耐藥MP感染(gnrn)的治療中醫(yī)藥治療中醫(yī)認為肺炎屬于溫病范疇，肺炎的發(fā)生、發(fā)展、轉歸與毒無不相關，因此治療肺炎的首要措施是祛邪解毒；同時肺為多氣多血之臟，易出現氣郁血瘀，可加用活血化瘀藥。故肺炎的治療主要以清熱解毒及活血化瘀為主。中藥的作用機制有別于大環(huán)內酯類抗牛素，而且單味藥本身含多種成分并具有多種藥理作用，雖不十分(shfn)清楚，但I臨床上已取得良好的療效，故挖掘我同中醫(yī)藥偉大寶庫，探索有效的中藥，也是耐藥MP肺炎防治工作的當務之急。第二十四頁，共二十九頁。肺

18、炎支原體及耐藥位點核酸檢測耐藥MP感染(gnrn)的治療免疫治療目前研究認為MP肺炎是由于病原體本身及其激發(fā)的免疫反應共同所致。對耐藥MP感染且具有多種肺外并發(fā)癥的重癥病例，及時、早期(zoq)、短程應用腎上腺皮質激素是必要的，這對阻止炎性反應的發(fā)展、減輕感染中毒癥狀、預防和控制哮喘及其他并發(fā)癥等有重要臨床價值，可縮短治療療程和減少后遺癥。其應用指征為：急性期病情嚴鶯的MP感染；肺部病變遷延而出現肺不張、肺間質纖維化、支氣管擴張及肺外并發(fā)癥者。對于有明顯免疫功能缺陷、藥物性免疫抑制或伴心肺功能障礙者，尤其當MP感染后合并或繼發(fā)混合感染，造成機體組織損傷較迅速且較嚴重時，作為補充療法可應用丙種球蛋白或免疫調節(jié)劑進行積極的支持治療。丙種球蛋白有增強機體自身免疫力、減輕炎性反應的作用。第二十五頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測Part 2小結(xioji)第二十六頁，共二十九頁。肺炎支原體及耐藥位點核酸檢測小結小結(xioji)(xioji)肺炎支原體肺炎是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原病原體核酸基因檢測可以快速準確輔助臨床醫(yī)生對患者感染病原體進行診斷，判斷患者的病情(bngqng)，合理使用抗生素，避免抗生素耐藥發(fā)生?？筂P治療：大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類、利福平。第二十七頁，共二十