腎缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激

1、第卷第期Aug.2010（）文章編號(hào)：·論著·腎缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激胡紅林，王共先（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，江西南昌330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江西南昌330006）（）過(guò)程中腎細(xì)胞凋亡情況與腎組織氧化應(yīng)激反應(yīng)水平。方法用摘要：目的探討腎缺血再灌注損傷鉗夾小鼠雙側(cè)腎蒂的方法建立腎動(dòng)物模型，腎后檢測(cè)腎功能，免疫印跡法分析腎組織中、和蛋白的表達(dá)情況，法分析腎小管凋亡情況，并作腎組織病理形態(tài)學(xué)檢查。定量分析灌注后腎組織中總抗氧化能力（）和超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽還原酶（）、過(guò)氧化氫酶（）等抗氧化酶的變化。結(jié)果致腎功能明顯損害，與對(duì)照

2、組相比，缺血組腎組織中激活的蛋白剪切片段和蛋白的表達(dá)升高，蛋白表達(dá)降低。法顯示，腎小管細(xì)胞、凋亡明顯增加。病理形態(tài)學(xué)顯示，腎小管細(xì)胞出現(xiàn)片狀壞死。腎臟病理組織學(xué)評(píng)分明顯升高，腎組織降），而、及等抗氧化酶的變化無(wú)顯著性（）。結(jié)論腎臟低，差異均有顯著性（中腎小管細(xì)胞凋亡增加，總抗氧化能力降低，腎小管細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是腎的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡；氧化應(yīng)激；動(dòng)物模型關(guān)鍵詞：腎缺血再灌注損傷；中圖分類號(hào)：文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Apoptosisandoxidativestressduringrenalischemia-reperfusioninjuryinBALB/cmiceHUHong-lin1,WANGGong

3、-xian2(1.DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Abstract:【Objective】Toexploretheroleofapoptosisandoxidativestressduringrenalischemia-reperfusioninjury（IRI）inBALB/cmice.【Methods】Renalarteriesofmicewerebilaterallyclampedwithmicro-arteryclampsfor45mintomakemodelofr

4、enalIRI.Theanimalsweresacrificedat24hpost-operatively.Renalfunction(serumcreatinineandbloodureanitrogen)andpathologyofthekidneyswereexamined.Theexpressionofcaspase-8,caspase-totalantioxidantcapacity(TAC)aswellassuperoxidedismutase(SOD),glutathionereductase(GSH),catalase(CAT)【Results】Comparedwithcont

5、rolgroupat24hafteroperation,levelsofserumcreatinineandweredetermined.bloodureanitrogenwereremarkablyincreasedinIRIgroup(P<0.01),typicalacutetubularnecrosiswithsevereinflammatorycellsinfiltrationwerefoundincorticomedullaryjunctionareaundermicroscope,histologicalscorefortubulardamageinIRIgroupwasmu

6、chhigherthanthatofcontrolgroup(P<0.01).Theexpressionofcleavedcaspase-8P20,caspase-3P11andbaxwasupregulatedsignificantlyandtheexpressionofbcl-2wasdownregulatedinIRIgroupcomparedwithcontrolgroupat24hafteroperation(P<0.05).TheTUNEL-positivecellswereincreasedsignificantlyinIRIgroup.RenalTACactivit

7、ywasreducedinIRIgroup(P<0.01).TherewasnodifferenceinthelevelofrenalSOD,GSH,CATbetweenIRIgroupandcontrolgroup(P>0.05).【Conclusion】TheapoptosisofrenalcellsisincreasedandrenaltotalantioxidantcapacityisdecreasedduringrenalIRI.ApoptosisandoxidativestressplayimportantrolesduringrenalIRI.Keywords:ren

8、alischemia-reperfusioninjury;apoptosis;oxidativestress;animalmodel收稿日期：通信作者王共先，：，：·2279·中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志第卷凋亡和氧化應(yīng)激在器官缺血再灌注損傷（，）的發(fā)生、發(fā)展中起著本研究對(duì)小鼠腎時(shí)腎細(xì)胞重要的作用。凋亡情況與腎組織抗氧化活性的變化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，以探討腎的發(fā)生機(jī)制。法檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡上述石蠟包埋后的腎臟制作切片，采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記法（法）檢測(cè)缺血組和對(duì)照組腎細(xì)胞的凋亡情況，具體步驟按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（美國(guó)公司，產(chǎn)品目錄）。在熒光顯微鏡下連續(xù)觀察每張切片的個(gè)皮髓交

9、界處視野（×），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。免疫印跡法檢測(cè)腎臟中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)將置于冰箱保存的腎臟取出，裂解后制作成細(xì)胞裂解液，考馬斯亮蘭法（法）行蛋白定量，每個(gè)樣本取含總蛋白的細(xì)胞裂解液，采用常規(guī)法檢測(cè)、和蛋白的表達(dá)，應(yīng)用冷光影像分析儀（，日本公司）顯像，以軟體定量分析蛋白條帶，并使用肌動(dòng)蛋白（）作為內(nèi)參照。所用抗體均購(gòu)自美國(guó)公司。腎臟抗氧化酶活性和總抗氧化能力檢測(cè)將置于冰箱保存的腎臟取出裂解后制作成蛋白懸液，考馬斯亮蘭法（法）行蛋白定量。采用化學(xué)比色法檢測(cè)腎臟中超氧化物歧化酶（）、谷胱甘肽還原酶（）及過(guò)氧化氫酶（）的變化，采用終點(diǎn)比色法檢測(cè)腎臟中總抗氧化能力（）。試劑盒均購(gòu)自美國(guó)公司。統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)處理應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±）表示，計(jì)量資料組間差異采用檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)方法，計(jì)數(shù)資料組間差異采用檢驗(yàn)。為差異有顯著性。材料與方法實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雄性小鼠，周齡，體重，均由巴黎第五大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院免疫實(shí)驗(yàn)室提供，微型動(dòng)脈夾由法國(guó)公司生產(chǎn)。腎模型小鼠術(shù)前禁食，應(yīng)用三溴乙醇溶液（）腹腔內(nèi)注射麻醉。腎缺血組：沿腹正中線做的切口，逐層分離皮膚、腹膜，進(jìn)入腹腔，將腸道推向一側(cè)，找到腎蒂后用無(wú)損傷微型動(dòng)脈夾迅速阻斷左、右腎蒂，可見(jiàn)腎臟由鮮紅變紫黑雙側(cè)腎蒂阻斷后，去除動(dòng)色，表示夾閉成功。脈夾，恢復(fù)血流灌注，可見(jiàn)腎臟迅速由紫黑色變?yōu)轷r紅，恢復(fù)原來(lái)顏色，術(shù)畢分層縫

11、合關(guān)閉腹腔。術(shù)后小補(bǔ)充水與飼料。術(shù)中鼠于的環(huán)境保暖，應(yīng)用生理鹽水使小鼠保持充分的水化。對(duì)照組（假手術(shù)組）：同法打開(kāi)腹腔并找到腎蒂，但不夾閉腎蒂。血清生化指標(biāo)檢測(cè)和收集腎臟標(biāo)本腎臟灌注后，經(jīng)眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血離心后吸取血清，檢，、測(cè)血清肌酐（）和尿素氮（）。采血后引頸法處死小鼠，取出腎臟。其中個(gè)腎臟置于中性甲醛溶液中固定做病理組織學(xué)檢測(cè)，另個(gè)腎臟用液氮迅速冷凍，置于冰箱保存以備后續(xù)相關(guān)檢測(cè)。腎臟病理組織學(xué)檢測(cè)腎臟行縱軸冠狀面切開(kāi)，置于中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，制作切片，常規(guī)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管壞死情況。每只小鼠腎臟切片隨機(jī)選取皮髓交界處個(gè)視野觀察，根據(jù)腎小管壞死程度，采用等的半定量病

12、理評(píng)估法評(píng)分：評(píng)分越高說(shuō)明腎小管壞死越嚴(yán)重（最高分），分：正常腎臟，分：最少壞死（的腎小管壞死），分：輕度壞死（的腎小管壞死），分：中度壞死（的腎小管壞死），分：重度。壞死（的腎小管壞死）結(jié)果血清生化指標(biāo)變化小鼠經(jīng)歷雙側(cè)腎臟缺血，再灌注后血清肌酐和尿素氮如圖所示。缺血組的血清肌酐和尿素氮均明顯升高，與對(duì)照組相比，差異有顯著性（）。腎臟病理組織學(xué)評(píng)估對(duì)照組（假手術(shù)組）腎臟形態(tài)、大小及色澤正常；缺血組腎臟稍腫大，剖面見(jiàn)皮質(zhì)蒼白，髓質(zhì)淤血暗紅。染色光鏡檢查顯示：對(duì)照組腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，僅見(jiàn)局部腎小管上皮細(xì)胞變性；缺血組腎組·2280·第期胡紅林，等：腎缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡

13、和氧化應(yīng)激血清肌酐（）覮缺血組（）對(duì)照組（）織見(jiàn)大量小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，部分小管上皮細(xì)胞刷狀緣扁平、皺縮、核深染及裸露。嚴(yán)重者可崩解脫落以及細(xì)胞核濃縮、碎裂及見(jiàn)上皮細(xì)胞壞死、核溶解。部分腎小管管腔擴(kuò)張，壞死，崩解的上皮細(xì)胞可脫落入腎小管管腔內(nèi)，呈模糊的顆粒樣結(jié)構(gòu)。病變往往呈片狀或灶狀。腎間質(zhì)見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。再灌注后代表性染色圖如圖和所示。腎小管病理?yè)p傷評(píng)分結(jié)果如圖所示。缺血組病理評(píng)分均顯著高于對(duì)照組，差異有顯著性（）。覮缺血組（）對(duì)照組（血清尿素氮（）法檢測(cè)腎細(xì)胞凋亡缺血組腎細(xì)胞凋亡明顯增加，法顯示腎缺血再灌注后，缺血組腎組織中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（綠色熒光）明顯增多，而對(duì)照組未見(jiàn)明顯陽(yáng)性細(xì)胞。

14、代表性的圖片和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)如圖、及所示。達(dá)缺血組和對(duì)照組腎臟中未活化的腎臟中和蛋白的表覮與對(duì)照組相比，圖小鼠經(jīng)歷雙側(cè)腎臟缺血，再灌注后血清肌酐（）和尿素氮（）變化、蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，而缺血組中活化的蛋白剪切片段（）、（）表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比，兩組之腎小管病理?yè)p傷評(píng)分覮）缺血組（對(duì)照組（）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)）（每×視野缺血組（）對(duì)照組（）、分別為缺血組和對(duì)照組腎臟染色代表性圖片，箭頭所示為腎小管片狀壞死，為腎小管病理?yè)p傷評(píng)分。、分別為缺血組和對(duì)照組腎臟檢測(cè)代表性圖片，綠色熒光代表凋亡細(xì)胞核，為陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析圖。（×）（覮與對(duì)照組相比，）圖小鼠雙側(cè)腎缺血，再灌注后腎臟病理

15、組織學(xué)評(píng)估和腎細(xì)胞凋亡間的差異有顯著性（）（圖）。腎臟中和蛋白的表達(dá)缺血組腎臟蛋白的表達(dá)明顯降低，蛋白表達(dá)明顯升高，與對(duì)照組相比，兩組之間的差異有顯著性（）（圖）。腎臟中抗氧化活性與對(duì)照組相比，缺血組腎臟中、和的變化無(wú)顯著性（）（圖、）。相反，·2281·中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志第卷片段缺血組對(duì)照組缺血組對(duì)照組片段）缺血組（對(duì)照組（）（相對(duì)密度）（相對(duì)密度）缺血組對(duì)照組缺血組對(duì)照組片段（相對(duì)密度）覮（片數(shù)相對(duì)密度）（缺血組對(duì)照組缺血組對(duì)照組、為檢測(cè)的代表性條帶圖片。、分別代表、和剪切片段、剪切片段（覮與對(duì)照組相比，）的條帶經(jīng)軟體定量分析的條帶密度與內(nèi)參照的條帶密度的比值的統(tǒng)計(jì)分析圖

16、。圖小鼠雙側(cè)腎缺血，再灌注后腎臟中、蛋白的表達(dá)缺血組對(duì)照組缺血組對(duì)照組（相對(duì)密度）（相對(duì)密度缺血組（）對(duì)照組（）缺血組（）對(duì)照組（）、為、及其各自內(nèi)參照的檢測(cè)代表性蛋白條帶圖片。、分別為和的條帶經(jīng)軟體定量分析的條帶密度與其內(nèi)參照的條帶密度的比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。）與對(duì)照組相比，；）與對(duì)照組相比，圖小鼠雙側(cè)腎缺血，再灌注后腎臟中、蛋白的表達(dá)腎臟（·）腎臟（·）腎臟（·）腎臟（·）對(duì)照組（）缺血組（覮缺血組（）對(duì)照組（）缺血組（）對(duì)照組（）缺血組（）對(duì)照組（）覮與對(duì)照組相比，圖小鼠雙側(cè)腎缺血，再灌注后腎臟中（）、（）、（）和（）的變化·2282

17、3;第期胡紅林，等：腎缺血再灌注損傷中細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激總抗氧化能力（）明顯降低，與對(duì)照組相比，兩組之間的差異有顯著性（）（圖）。機(jī)制，發(fā)揮抑制凋亡的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白能通過(guò)降低氧自由基活性和抑制氧自由基生成發(fā)揮抗氧化作用，還能維持線粒體的氧化功能。是促凋亡基因，能促進(jìn)細(xì)胞因子缺失而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與可形成二聚體，兩者的比例決定細(xì)胞向存活還是凋亡方向發(fā)展。等研究表明，大鼠腎后比值下降，通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染后，提高比值，可以很好地保護(hù)腎和抑制腎小管細(xì)胞的凋亡。等發(fā)現(xiàn)，基因敲除小鼠對(duì)各種氧應(yīng)激特別敏感、細(xì)胞氧化損傷增加和抗氧化能力下降。本研究證明腎時(shí)腎臟蛋白表達(dá)下調(diào)，而蛋白表達(dá)上調(diào)，比值明顯下降，從而

18、使腎細(xì)胞凋亡增加和抗氧化能力下降。有研究表明，能夠裂解蛋白。在體外從過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，能在蛋白的環(huán)狀區(qū)域處裂解蛋白，末端產(chǎn)物能觸發(fā)細(xì)胞凋亡，裂解產(chǎn)物可進(jìn)一步激活下游的，并導(dǎo)致級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大。腎臟與活性氧（）的產(chǎn)生密切相關(guān)。缺血再灌注時(shí)機(jī)體大量產(chǎn)生，的大量產(chǎn)生，超過(guò)了機(jī)體的清除能力，使體內(nèi)抗氧化活性被消耗，即可直接損傷組織和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，腎時(shí)雖然腎臟中、和等抗氧化酶的變化無(wú)顯著性，但總抗氧化能力（）明顯降低，其差異有顯著性（）。等在大鼠腎模型中也發(fā)現(xiàn)，缺血組和假手術(shù)組腎臟、和等抗氧化酶的變化無(wú)顯著性，而血清中的變化缺血組比假手術(shù)組明顯降低，差異有

19、顯著性（）。機(jī)體總抗氧化能力除了包括、和等抗氧化酶外，還包括一些具有抗氧化活性的非酶類大分子和小分子物質(zhì)（如維生素、維生素、胡蘿卜素、輔酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、尿酸和膽紅素等）。本研究雖然缺血組與對(duì)照組抗氧化酶（、和）無(wú)明顯變化，但可能缺血組的其他具有抗氧化活性的非酶類物質(zhì)消耗降低，而使總抗氧化能力（）明顯降低。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，腎過(guò)程中細(xì)胞凋亡增加和抗氧化能力降低。筆者認(rèn)為，細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激是腎的重要機(jī)制，通過(guò)降低腎細(xì)胞凋亡或提高（下轉(zhuǎn)第頁(yè)）討論腎臟為高灌注器官，對(duì)缺血及缺血再灌注均敏感。腎是缺血性急性腎功能衰竭的重要損傷環(huán)節(jié)，也是腎移植中影響移植腎早期功能恢復(fù)及長(zhǎng)期腎的病理生理

20、機(jī)制非常復(fù)雜，存活的主要因素。至今尚未徹底闡明。大量研究表明，細(xì)胞凋亡增加和自由基生成增多是腎的重要機(jī)制。本研究中，腎缺血組再灌注血清和水平明顯升高，提示腎功能嚴(yán)重受損。另外，腎組織病理形態(tài)學(xué)顯示腎小管明顯壞死，陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多，均說(shuō)明腎模型成功建立。近年來(lái)，蛋白酶家族是細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)，家族被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者。未活化的可分為啟動(dòng)因子（如和）和效應(yīng)分子（如和），啟動(dòng)的激活能導(dǎo)致效應(yīng)的激活。是最主要的效應(yīng)，通過(guò)兩種機(jī)制激活：死亡受體通路或線粒體通路。死亡受體通路是通過(guò)細(xì)胞表面的死亡受體與其相應(yīng)的配體（如和）結(jié)合導(dǎo)致激活而發(fā)生；線粒體通路是通過(guò)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)（如損傷，氧化應(yīng)激）導(dǎo)致激活而發(fā)生。當(dāng)通過(guò)或途徑使激活時(shí)，活化的將被剪切成多個(gè)片段，這些剪切片段可以導(dǎo)致的斷裂和細(xì)胞凋亡的一系列特征的形成。等在小鼠腎模型中發(fā)現(xiàn)，缺血組腎臟中和的表達(dá)明顯升高，經(jīng)干擾后抑制和的表達(dá)，可以較好地保護(hù)腎。本研究結(jié)果表明，缺血組和對(duì)照組的腎臟和的表達(dá)差異無(wú)顯著性（），但剪切的片段