角膜損傷對BMSC增殖的影響

1、角膜損傷對BMSC增殖的影響     健全的眼表上皮連同一個穩(wěn)定的角膜前淚膜是維持角膜生理功能的組織解剖學基礎。角膜上皮結構完整、功能正常對視力有重要影響。臨床常見的疾病，如酸堿化學傷、自身免疫性疾病、炎癥等，均可造成眼表不同程度的損傷，嚴重的可以導致眼表組織的廣泛破壞，引起持續(xù)的角膜上皮缺損，最終導致失明。目前同種異體角膜移植是角膜性失明主要的治療手段，但角膜移植手術通常會因嚴重的免疫排斥反應而失敗，且適合的供體組織十分短缺。盡管大量研究證實角膜緣干細胞可作為種子細胞分化為角膜上皮細胞1-2，但細胞來源的有限性使其應用受到限制。到目前為止，國內外已有很

2、多學者研究證實骨髓間充質干細胞(bone marrowme senchymal stemcell，BMSC)可以向角膜上皮細胞轉分化，但是誘導培養(yǎng)的類角膜上皮細胞傳代后增殖能力明顯降低，大部分細胞在傳代后死亡3-4。本實驗建立持續(xù)性角膜上皮缺損模型，旨在觀察BMSC在組織損傷后體內病理生理環(huán)境下增殖能力的變化，若能獲得增殖能力較強的BMSC，則作為后續(xù)實驗的種子細胞，誘導分化為類角膜上皮細胞，以期待獲得更具優(yōu)勢的種子細胞，用于組織工程角膜。1材料與方法11實驗動物與分組健康雄性Wistar大鼠(購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心)40只，4周齡，體質量200210g，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。術前經熒光素鈉染色

3、裂隙燈下檢查，角膜無異常。隨機分為8組，每組5只，按每天處死一組大鼠的先后順序分別命名為缺損組(A、B、C、D、E、F、G)和對照組。12主要試劑和儀器DMEM/F12(Hyclone，USA)，胎牛血清(四季青，中國)，胰蛋白酶(Gibco，USA)，EDTA(乙二胺四乙酸二鈉，AMRESCO分裝)，RNase(MBI，USA)，碘化丙啶(Sigma，USA)，CO2培養(yǎng)箱(HealForceHF121UV)，LEOCADMILHC型倒置顯微鏡(Leica公司，德國)，手術顯微鏡LEICAMEL53型(WILDLEITZ公司，瑞士)，裂隙燈顯微鏡、角膜環(huán)鉆(蘇州明仁醫(yī)療器械廠)。13方法13

4、1大鼠持續(xù)性角膜上皮缺損模型的建立腹腔注射3gL1戊巴比妥鈉(30mgkg1)全身麻醉缺損組大鼠，待其角膜反射消失后，用碘伏消毒大鼠左眼，并鋪無菌洞巾，開瞼器開瞼，4gL1鹽酸奧布卡因滴左眼進行眼表麻醉，在眼科手術顯微鏡下用直徑35mm的環(huán)鉆于角膜中部做表層壓痕，熒光素鈉染色后用生理鹽水沖洗，顯露環(huán)痕后用半銳度月形刀刮去環(huán)內全部上皮，然后用熒光素鈉染色，在裂隙燈顯微鏡下觀察并拍照，如呈直徑35mm均勻著色圓盤狀上皮缺損區(qū)，即造模成功。術后生理鹽水沖洗，涂金霉素眼膏，氧氟沙星滴眼液滴術眼，3次d1，預防感染。為了達到實驗需要，每天按照上述方法對缺損組大鼠左眼行角膜上皮刮除術，建立持續(xù)性角膜上皮缺

5、損模型。第1次術后1d處死缺損組A組大鼠，然后對剩余缺損組大鼠左眼行角膜上皮刮除術;第2次術后1d處死缺損組B組大鼠，然后對剩余缺損組大鼠左眼行角膜上皮刮除術，依此類推連續(xù)7d，并在無菌條件下獲取各組BMSC。132BMSC的分離與培養(yǎng)將大鼠以3gL1戊巴比妥鈉過量麻醉處死后用體積分數75%乙醇全身浸泡消毒10min。于超凈臺上無菌條件下分離出股骨和脛骨，剔除肌肉和骨膜，將骨骺端剪去，暴露出兩端骨髓腔，用5mL注射器抽取完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，將沖洗液收集到無菌離心管中，并用滴管反復吹打制成單細胞懸液，900rmin1離心5min，棄去上清液，重懸以109L1的細胞密度接種于25cm2的培養(yǎng)

6、瓶中，置37、含體積分數5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2d后首次全量換液，以后每3d全量更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞達70%80%融合時用25gL1胰酶消化，按體積比12比例進行傳代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長狀況。133流式細胞儀檢測陽性表達率取第3代生長狀態(tài)良好的BMSC，胰酶消化后制成單細胞懸液，用PBS離心洗滌2次，900rmin1離心5min，每管依次加入抗大鼠抗體CD29、CD34、CD44、CD45，4孵育30min，加入熒光標記的二抗，4孵育30min。體積分數10%甲醛固定，流式細胞儀測定各類抗原的陽性表達率。134BMSC成脂誘導分化取第3代生長狀態(tài)良好的BMSC，按

7、20×106L1的密度均勻接種于六孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞達100%融合時，移去舊的培養(yǎng)液，每孔加入2mL成脂誘導液A(DMEM+體積分數10%FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素、IBMX、地塞米松、吲哚美辛)開始誘導。3d后更換為成脂誘導液B(DMEM+體積分數10%FBS、雙抗、谷氨酰胺、胰島素)進行維持，24h后再更換為成脂誘導液A，如此進行3個循環(huán)。此時細胞內空泡出現較多，但比較小，再用成脂誘導液B維持4d，小空泡融合變大。吸去誘導液B，40gL1多聚甲醛固定，油紅O染色，倒置顯微鏡下拍照。135BMSC的細胞周期檢測分別取對照組和缺損組第3代生長狀態(tài)良好的BMSC，胰酶消化后制成

8、單細胞懸液，用PBS離心洗滌2次，900rmin1離心5min，棄上清，用4預冷的體積分數70%乙醇重懸固定，20冰箱放置備用。用前離心去除固定液，加100LRNase，37水浴30min，再加入400L碘化丙啶染色液混勻，4避光30min，流式細胞儀檢測細胞周期。14統(tǒng)計學方法實驗獲取的數據用SPSS170統(tǒng)計學軟件進行計量資料的單因素方差分析，并進一步行多個樣本均數間的兩兩比較SNK-q檢驗，檢驗水準=005。2結果21大鼠角膜上皮缺損情況造模后0h隨機選取1只缺損組大鼠，對其左眼行熒光素鈉染色，裂隙燈顯微鏡下觀察顯示缺損區(qū)均勻著色，形狀為規(guī)則的圓盤狀;造模后24h再次對其左眼行熒光素鈉染

9、色，裂隙燈顯微鏡下觀察顯示:角膜上皮缺損區(qū)面積明顯縮小，但尚未愈合(圖1)。22BMSC形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡下觀察48h可見部分細胞貼壁，外觀呈紡錘形或多角形，有良好折光性;細胞培養(yǎng)至第7天數量明顯增多，形態(tài)變?yōu)殚L而扁平的梭形(圖2);細胞培養(yǎng)第10天極性明顯，細胞排列緊密，呈漩渦狀或魚群狀排列。23BMSC表面標記物的表達流式細胞儀檢測結果顯示，BMSC的CD29、CD44均呈高表達，陽性率分別為9957%、9835%;而CD34、CD45陽性表達率則極低，分別為120%、258%，符合BMSC的特征(圖3)。24BMSC成脂誘導分化鑒定BMSC加入成脂誘導劑后16d，誘導而成的脂肪細胞

10、中出現串珠樣脂滴，經油紅O染色呈鮮紅色(圖4)。25各組BMSC細胞周期檢測結果流式細胞儀檢測所得數據(表1)經單因素方差分析，結果示B組、D組S期及G1期細胞百分數與A、C、E、F、G組及對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(均為P005)，但B、D組S期及G1期細胞百分數差異均無統(tǒng)計學意義(均為P005)，A、C、E、F、G組及對照組間S期及G1期細胞百分數均值差異均無統(tǒng)計學意義(均為P005)。統(tǒng)計學分析結果顯示:B組S期細胞所占比例較對照組平均增加近13%，D組增加近14%;S期為DNA合成復制期，反映細胞群體增殖能力，說明B、D組BMSC增殖能力顯著提高。3討論組織損傷發(fā)生時，BMSC會在炎癥

11、反應所釋放的細胞因子(如IL-1、IL-9、IL-12、粒細胞集落刺激因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子等)的作用下自身增殖5，隨后被動員到外周血循環(huán)中，并向損傷組織處遷移、識別和定位，在損傷組織微環(huán)境的作用下定向分化為相應組織的成熟細胞，實現組織的修復;而通過各種途徑引入體內的外源性BMSC，也會定向聚集至損傷處，發(fā)揮治療作用。很多學者現已證實體內BMSC的動員遷移是由于體內動員劑的趨化作用所引起，如粒細胞集落刺激因子6、基質細胞衍生因子-17、單核細胞趨化蛋白-18等。在正常的機體內，這些動員劑的含量維持在較低水平，不發(fā)揮遷移趨化作用，當組織損傷發(fā)生時，會引發(fā)炎癥、缺血、缺氧等病變，進而使動員

12、劑的含量上調，發(fā)揮遷移趨化作用。本實驗制作了角膜上皮持續(xù)損傷模型，細胞周期檢測結果顯示:對照組BMSCS期細胞和G1期細胞百分數的均值分別為400%±240%、9285%±361%;在角膜上皮持續(xù)損傷的第3天和第5天BMSCS期細胞百分數的均值分別增加到16.76%±449%、1795%±277%，G1期細胞百分數的均值分別降低為7226%±881%、71.33%±530%，與對照組細胞的差異均有統(tǒng)計學意義，說明在角膜上皮持續(xù)損傷的第3天和第5天BMSC增殖能力明顯提高。角膜上皮損傷后的愈合過程是多重因素參與的復雜過程，包括上皮細胞黏

13、附、遷移，角膜緣干細胞增殖分化，炎癥反應等等。角膜上皮持續(xù)損傷的第3天和第5天BMSC增殖能力明顯增高很可能就是因為機械損傷所引發(fā)的炎癥反應所致，由于炎癥反應會釋放各種生長因子、細胞因子、趨化因子等，這些因子的分泌在損傷的第3天達到高峰，間接或直接刺激BMSC增殖，由于損傷持續(xù)存在，炎癥反應所釋放的各種因子會被消耗，導致第4天BMSC的增殖能力下降，隨后由于損傷的加劇，炎癥反應更加強烈，于第5天釋放更多的炎癥因子，再次刺激BM-SC，使其增殖能力增強。BMSC又稱骨髓基質干細胞，對骨髓中的造血干細胞不僅有機械支持作用，還能分泌多種生長因子(如IL-6、IL-11、巨噬細胞集落刺激因子及干細胞因子等)來支持造血9-10，BMSC的首次增殖為造血干細胞提供