目的基因克隆

1、一、目的基因克隆的策略有哪些？其理論依據(jù)什么？如何根據(jù)具體條件，如目的性狀的特點，已知控制目的性狀的基因的信息合理選擇基因克隆的方法？ 1、主要有以下幾個克隆的策略：(1) PCR法分離目的基因：從蛋白質(zhì)的一級序列分析得到核酸序列的相關(guān)信息， 設(shè)計簡并引物，通過對 mRNA進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以cDNA為模板，然后 將目的基因通過PCR方法擴增，或者直接從基因組 DNA擴增的方法。(2)核酸雜交的方法：通過對蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析，設(shè)計簡并引物，通過 核酸雜交的方法從基因文庫中篩選得到目的基因。(3)免疫學(xué)篩選法分離目的基因：利用免疫學(xué)原理，通過目的蛋白的特異抗體 與目的蛋白的專一結(jié)合，從

2、表達文庫中分離目的蛋白基因。2、若控制該性狀的目的蛋白質(zhì)不容易分離純化，這 PCR方法比較適宜，若蛋白 質(zhì)分離純化容易，且有現(xiàn)成的基因文庫，則后兩種方法較為簡單。二、蛋白組學(xué)方法克隆目的基因的理論依據(jù)是什么？有哪些技術(shù)環(huán)節(jié)？要用到哪 些技術(shù)？1、理論依據(jù)：以分離純化的目的蛋白為研究起點，通過對目的蛋白的一級結(jié)構(gòu) 分析，獲得起碼的氨基酸序列信息后，反推可能的 DNA序列，然后設(shè)計引物， 從cDNA中將目的基因擴增出來，或者設(shè)計核酸探針，通過雜交技術(shù)將目的基 因從基因文庫中篩選出來?；蛲ㄟ^抗體抗原免疫反應(yīng)從表達文庫中將該基因分離 出來。2、技術(shù)環(huán)節(jié)是確定并制備出高純度的蛋白質(zhì)。3、所需要的實驗技術(shù)

3、有：蛋白質(zhì)的雙向電泳技術(shù)，由第一向的等電聚焦電泳和 第二向的SDS-PAGE電泳組成；蛋白質(zhì)氨基酸序列分析。三、基因組學(xué)方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特點？如何選擇恰當(dāng)?shù)幕?組學(xué)方法克隆目的基因？1、基因文庫篩選方法通過對基因文庫的篩選將目的基因分離出來， 一般有兩種方法：核酸雜交法，原 理是分子雜交；PCR篩選法，通過PC R方法將目的基因分離出來，對于以混 合形式保存的文庫，先將文庫分成幾份，每份為一個 反應(yīng)池”進行PCR反應(yīng)， 待選出陽性池后，將陽性池的混合克隆稀釋，然后等量分置96孔板中，進行橫向池及縱向池的P C R反應(yīng)，然后將陽性菌落群進行稀釋，重復(fù)上述工作，直到 篩出陽性單

4、克隆。2、圖位克隆目的基因利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行精細定位， 利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進行 精細定位，用獲得的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選基因文庫的方法。主要有染色體步移法、染色體登陸、跳查和連接法；外顯子捕捉和 cDNA直選法等。 3、插入突變分離克隆目的基因由重組DNA技術(shù)衍生出的插入突變，可人為地造成某一待研究基因的突變， 并 可根據(jù)由此帶來的表型特征的改變分析該基因的功能。 基因插入突變的方法主要 有：插入失活突變；T- DNA標(biāo)簽；轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽。4、相鄰片段的體外克隆(1) Panhandle PC砒在限制酶消化的DNA 3/端加一個與未知序列上游已知序列互補的單鏈引物，

5、從而使經(jīng)變性后產(chǎn)生的單鏈 DNA分子內(nèi)聚合，導(dǎo)致已知 DNA定位于未知相鄰 DNA側(cè)翼區(qū)段。引物設(shè)計是該技術(shù)運用的關(guān)鍵所在，所需引物包含一個與已知 序列上游互補的單鏈引物和兩對位于該單鏈引物兩側(cè)與已知序列一致的引物。(2) Cassette PCRfe利用Cassette及Cassetted物特異性快速擴增cDNA及基因組DNA未知區(qū)域的 一種有效方法。由于Cassette的5/端沒有磷酸基，在目標(biāo)DNA的3/端和Cassette 的5/端的連接部位形成缺口，在第一次 PCR反應(yīng)的第一循環(huán)時，從引物C1開 始的延伸反應(yīng)在連接部位終止，從而控制了非特異性的擴增。只有從引物S1開始延伸合成的DNA

6、鏈，才能成為引物C1的模板，進行DNA的擴增反應(yīng)。再用 內(nèi)側(cè)引物(引物C2,引物S2)進一步進彳T第二次PCR反應(yīng)時，能高效特異性地擴增 目的DNA?？寺∧康幕虻姆椒ǎ喝裟康幕虻男蛄形粗?，則采用相鄰片段的體外克隆的方法； 若目的基因的序列 已知，有現(xiàn)成的基因文庫，則采用基因文庫篩選方法較好；若有合適的分子標(biāo)記， 則用圖位克隆的方法較好；若需研究目的分子的功能，則采用插入突變分離克隆 目的基因的方法較好。四、功能基因組學(xué)策略克隆目的基因的方法有哪些？各有什么特點？如何解決其 中的假陽性克隆問題？1、RT-PCR擴增這種方法專一性強，但是操作過程比較麻煩，特別是mRNA很不穩(wěn)定、生存時問短，所

7、以要求的技術(shù)條件較高。2、mRNA差異顯示技術(shù)該方法以RT-PCR和DNA凝膠電泳為基礎(chǔ)，實驗簡便，靈敏度高，耗時短，可 同時比較多個樣品間基因表達的差異， 可同時檢測到上調(diào)和下調(diào)的基因，但這種 方法對低豐度的mRNA檢出率低，得到的絕大多數(shù)差異條帶僅含 3'UTR短片段 信息，這些區(qū)域的序列結(jié)構(gòu)相對保守，得不到特異的基因且容易出現(xiàn)假陽性。 假陽性的鑒定：(1) Northern雜交：通常是將序列膠中回收的片段再次擴增后作探針進行 Northern雜交檢測，確定陽性片段后再進行克隆。(2) Northern雜交并回收特異 cDNA片段(3) DNA部分序列分析法：先對10個菌落的cDN

8、A插入序列進行部分序列分 析，通過比較選出不同菌落，再對其進行序列分析以證實其異質(zhì)性。3、PCR法構(gòu)建減法cDNA文庫(SSH)該法通過2次雜交和2次PCR,使假陽性率可降到6%,且靈敏度高。用SSH可 一次同時分離幾十至幾百個差異基因，使效率大增。但由于 SSH需mRNA量大 (幾微克)，對mRNA來源困難的材料不利。因為 SSH對不同材料或材料間存在 的小片段缺失不能有效檢測，所以研究材料的差異不能太大。4、基因表達的序列分析(SAGE)目前，高通量地研究基因表達譜的方法主要有兩種，即生物芯片和基因表達序列分析(serial analysis of gene expression SAGE

9、)?；蛐酒軝z測的基因必須 是已知的基因，放在芯片上幾種基因的探針就只能檢測這幾種基因的表達譜；相比之下，SAGE能以遠高于DNA芯片的精確度和重復(fù)性來檢測在病理條件下基因表達譜的改變，而不必考慮所檢測的基因是已知的還是未知的。因此在檢測疾病相關(guān)的新基因，特別是無法用基因芯片進行檢測的低表達量致病基因時， SAGE是目前的最佳手段，無可取代。5、cDNA末端快速克隆(RACE)RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段 cDNA片段，通過往兩端延伸擴增 從而獲得完整的3'端和5'端的方法。與篩庫法相比較，此方法是通過 PCR技術(shù) 實現(xiàn)的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時

10、間內(nèi)獲得有利用價值的信息， 節(jié)約了實驗所花費的經(jīng)費和時間，且只要引物設(shè)計正確，在初級產(chǎn)物的基礎(chǔ)上可 以獲得大量的感興趣基因的全長。五、基因芯片技術(shù)的基本原理是什么？有哪些類型？基因芯片在基因克隆中有哪 些應(yīng)用？如何利用基因芯片進行基因的功能驗證？1、原理：采用光導(dǎo)原位合成或顯微印刷等方法將大量特定序列的探針分子密集、 有序地固定于經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻片、硝酸纖維素膜等載體上，然后加入標(biāo)記的待測樣品，應(yīng)用已知核酸序列與互補的靶序列雜交， 通過雜交信號的強弱及 分布,來分析目的分子的有無、數(shù)量及序列，從而獲得受檢樣品的遺傳信息。2、類型：由于尚未形成主流技術(shù)，生物芯片的形式非常多，以基質(zhì)材料分，

11、有 尼龍膜、玻璃片、塑料、硅膠晶片、微型磁珠等；以所檢測的生物信號種類分， 有核酸、蛋白質(zhì)、生物組織碎片甚至完整的活細胞；按工作原理分類，有雜交型、 合成型、連接型、親和識別型等。但可分為三種主要類型：(1)固定在聚合物基片(尼龍膜，硝酸纖維膜等)表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標(biāo)記的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術(shù)進行檢測。(2)用點樣法固定在玻璃板上的 DNA探針陣列，通過與熒光標(biāo)記的靶基因雜 交進行檢測。這種方法點陣密度可有較大的提高， 各個探針在表面上的結(jié)合量也 比較一致，但在標(biāo)準(zhǔn)化和批量化生產(chǎn)方面仍有不易克服的困難。(3)在玻璃等硬質(zhì)表面上直接合成的寡核甘酸探針陣列，與熒

12、光標(biāo)記的靶基因雜 交進行檢測。該方法把微電子光刻技術(shù)與 DNA化學(xué)合成技術(shù)相結(jié)合，可以使基 因芯片的探針密度大大提高，減少試劑的用量，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和批量化大規(guī)模生產(chǎn)， 有著十分重要的發(fā)展?jié)摿Α?、基因芯片在基因克隆上的應(yīng)用：(1)研究生物體對逆境的反應(yīng)植物抗逆等基因的篩選是從分子水平上揭示植物生理機制的一項基礎(chǔ)性研究，發(fā)現(xiàn)新基因是培育抗逆新品種的重要前提，如尋找抗病蟲、抗旱、耐寒的相關(guān)基因， 以進行新產(chǎn)品的開發(fā)和品種的改良等， 利用基因芯片可以高通量、快速檢測基因 的差異表達。(2)基因表達水平的檢測基因芯片將已知基因固定于芯片上，將生物體某種生理狀態(tài)下所表達的 mRNA反 轉(zhuǎn)錄為cDNA并作熒

13、光標(biāo)記，然后和芯片進行雜交，通過檢測雜交信號的強度來 分析相關(guān)基因的表達豐度。用基因芯片進行的表達水平檢測可自動、 快速地檢測 出成千上萬個基因的表達情況。(3)基因突變和多態(tài)性分析基因突變是順序上的核甘酸發(fā)生了改變，具突變將會引起相應(yīng)基因的功能喪失或 改變，引起遺傳病。芯片用于檢測分子突變，可以準(zhǔn)確地確定突變位點和突變型， 芯片可以同時檢測多個基因乃至整個基因組的突變，還可以進行基因多態(tài)性分析。(4)基因組DNA序列分析基因芯片技術(shù)用于序列分析提出最早，原理是依據(jù)短的標(biāo)記寡核音探針與靶 DNA雜交，利用雜交譜重建靶DNA序列。(5)利用基因芯片技術(shù)進行后基因組學(xué)研究基因預(yù)報和功能鑒定是測序和

14、對基因組進行注釋的結(jié)果，基因組測序完成后，研究未知基因的功能是一個十分引人的后基因組研究課題。(6)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測廣泛收集用于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的啟動子、目的基因(如抗病基因、抗蟲基因等)和標(biāo)記 基因的EST序列，制成基因芯片，可以對轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品進行檢測。4、基因功能驗證首先進行序列分析，根據(jù)基因序列中特異的片段設(shè)計探針， 制備出代表該生物所 有基因的寡核甘酸或DNA陣列，即DNA芯片。然后將不同條件下從某生物中轉(zhuǎn) 錄出來的所有mRNA標(biāo)記，與DNA芯片雜交，通過分析雜交位點及信號強弱， 可 得知在不同條件下各組基因是否表達及各自表達的程度。根據(jù)表達圖譜進行不同條件下基因表達的對比分析，可找出在環(huán)境

15、條件變化時，哪些基因表達發(fā)生了變 化，從而分析其生理功能，找出與該生理功能相關(guān)的功能基因。六、簡述生物信息學(xué)技術(shù)在基因克隆和基因結(jié)構(gòu)與功能分析中的應(yīng)用，舉例說明。1、核酸序列的同源性檢索GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的EST序列有數(shù)百萬個之多，由于EST代表著一段表達 基因序列，這樣就可用其與公共數(shù)據(jù)庫進行同源性檢索， 檢索與其同源的核酸序 列。典型分析是采取 NCBI的Blast軟件對 GenBank中的非冗余數(shù)據(jù)庫(non-redundant database,nr 進行查詢。2、比較基因組分析達爾文的進化論給比較基因組學(xué)提供了理論依據(jù)。動物進化從低等到高等，動物與動物之間存在著親緣關(guān)系。這種

16、關(guān)系可以從基因序列上反映出來。親緣關(guān)系越 近，其基因序列的同源性就越高?？梢愿鶕?jù)已經(jīng)親緣關(guān)系較大的動物的基因序列 來擴增目的基因的序列。3、利用Unigene數(shù)據(jù)庫進行電子克隆從NCBI的UniGene數(shù)據(jù)庫中進行檢索，得到相應(yīng)的 UniGene編號。獲得待分 析序列的UniGene編號以后，就可以將與 UniGene Cluster的所有核酸序列下載 到本地，利用SequencherTM或其他的序列裝配軟件進行組裝。形成較長的新生 序列°4、cDNA序列的開放閱讀框分析基于遺傳密碼表，可通過計算機方便分析核酸序列的讀碼框。通過 NCBI的 ORF巾nder,輸入cDNA序列，計算機

17、將按照六種相位翻譯成蛋白質(zhì)。5、基于核酸序列的電子基因定位對核酸序列進行電子基因定位(即基因的染色體定位)，通過所定位區(qū)帶的相鄰 基因或者基因簇間接提示該基因的功能，是核酸分析的一個重要方面。6、基于序列同源性分析的蛋白質(zhì)功能預(yù)測相似的序列很可能具有相似的功能。因此，蛋白質(zhì)的功能預(yù)測最為可靠的方法是 進行數(shù)據(jù)庫相似性檢索。富而不驕，莫若富而好禮?！比缃裎覀儾蝗备徊毁F只能是土豪，你可以一夜暴富，但是貴氣卻需要三代以上的培養(yǎng)?？鬃诱f土豪，但是我們?nèi)鄙儋F族。高貴是大庇天下寒士俱歡顏的豪氣與悲憫之懷，高貴是位卑未敢忘憂國的壯志與擔(dān)當(dāng)之志高貴是先天下之憂而憂的責(zé)任之心。精神的財富和高貴的內(nèi)心最能養(yǎng)成性格的高貴，以貴為美，在不知不覺中營造出和氣的氛圍；以貴為高，在潛移默化中提升我們的素質(zhì)。以貴為尊，