銀杏葉片微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)(20151012)

1、編 號(hào)：QT QC 122- 1512浙江佐力藥業(yè)股份有限公司驗(yàn)證文件項(xiàng)目名稱：銀杏葉片微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)方案編號(hào)：QT VP QC 122-1512報(bào)告編號(hào)：QT- VF QC 122-1512證書(shū)編號(hào)：QT- VC QC 122-1512歸檔日期:一、驗(yàn)證方案二、驗(yàn)證報(bào)告三、驗(yàn)證批準(zhǔn)證書(shū)文件編號(hào)：QT VP- QC 122-1512銀杏葉片微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)方案方案起草方案起草人起草日期方案審核方案審核人審核日期審核日期審核日期審核日期方案批準(zhǔn)方案批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期1 驗(yàn)證參加人員及其職責(zé)部門(mén)姓名職責(zé)QC驗(yàn)證方案起草、負(fù)責(zé)實(shí)施QA負(fù)責(zé)取樣，進(jìn)度跟蹤及信息溝通質(zhì)量技術(shù)部驗(yàn)證方案、

2、報(bào)告審核，負(fù)責(zé)驗(yàn)證組織實(shí)施、 評(píng)價(jià)及偏差調(diào)查質(zhì)量技術(shù)部驗(yàn)證方案、報(bào)告審核與批準(zhǔn)2. 概述銀杏葉片是我公司生產(chǎn)的口服固體片劑， 主要用于活血化瘀通絡(luò)。用于瘀血阻絡(luò)引起的胸 痹、心痛、中風(fēng)、半身不遂、舌強(qiáng)語(yǔ)謇；冠心病穩(wěn)定型心絞痛、腦梗死見(jiàn)上述證候者。其處方為單位處方批生產(chǎn)量銀杏葉提取物40 g50kg微晶纖維素27.6g34.4kg淀粉100.8g126kg蔗糖20.8g26kg硬脂酸鎂0.8g1kg30聽(tīng)醇72g90 kg制成1000片125萬(wàn)片主要工藝為原輔料過(guò)篩，稱量，混合制粒，沸騰干燥，整粒，總混，壓片，包衣， 鋁塑包裝，外包。經(jīng)前期方法確認(rèn)，本品不具有抑菌性（見(jiàn)銀杏葉片微生物方法檢查驗(yàn)證

3、 報(bào)告編號(hào)VP-QC-026）,確認(rèn)檢查方法為：取本品10g，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖 液至100ml，溶解，混勻，制成1： 10均勻供試液。細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢查：取 1： 10供試液按常規(guī)法檢查（平皿法）。3. 驗(yàn)證目的由于中國(guó)藥典2015年版四部1100生物檢查法之1105、1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢 查法與2010年版規(guī)定的方法和條件有所變化，現(xiàn)對(duì)新版藥典規(guī)定的檢查法適用性進(jìn)行確 認(rèn)，以確認(rèn)所采用的方法適合本產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。4. 接受標(biāo)準(zhǔn)4.1需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌試驗(yàn)組各試驗(yàn)菌回收率在 50%-200%若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的 供試液制備方法及計(jì)數(shù)

4、方法進(jìn)行本產(chǎn)品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，可選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行本產(chǎn) 品的檢查。4.2控制菌（大腸埃希菌）試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按本供試液制備方法和控制菌檢查方法進(jìn)行本品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)設(shè)計(jì)新的方法消除本品的抑菌活性，并重新進(jìn)行確認(rèn)。5. 驗(yàn)證前準(zhǔn)備5.1樣品來(lái)源：浙江佐力藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。5.2培養(yǎng)基：購(gòu)買市售所需培養(yǎng)基，培養(yǎng)基有：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（北京三藥），麥康凱液體培養(yǎng)基 （北京三藥），麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（北京三藥）等。5.3.菌種：藥檢所購(gòu)

5、買。大腸埃希菌（CMCC（ B）44102）、枯草芽胞桿菌（CMCC（B）63501 ）、 金 黃色葡 萄球菌（CMCC（B）26003 ）、白色 念珠菌（CMCC（F）98001 ）、黑曲 霉 （CMCC（F）98003）、銅綠假單胞菌（CMCC（B）10104 ）。5.4 .儀器與試驗(yàn)材料：蒸汽滅菌器、凈化工作臺(tái)、無(wú)菌隔離艙、集菌培養(yǎng)器（每套3聯(lián)管）、接種環(huán)、試管、刻度吸管、移液管、量筒、酒精燈、75%酒精、鑷子等。5.5.環(huán)境監(jiān)測(cè)無(wú)菌隔離艙內(nèi)及物體表面擦拭消毒， 系統(tǒng)能正常啟動(dòng)并保持良好運(yùn)行，塵埃粒子和沉降菌 檢測(cè)結(jié)果符合百級(jí)潔凈級(jí)別要求。5.6 .參與人員已經(jīng)培訓(xùn)并能充分理解驗(yàn)證方法及

6、操作步驟。6. 參考文獻(xiàn)：中國(guó)藥典2015版四部通則1105、1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法7. 菌液制備方法7.1接種金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物少許至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基一 上,接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30E35°C培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物少許至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20C25 C培養(yǎng)2448小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每 1ml含菌數(shù)小于 100cfu的菌懸液，28C保存，備用(注配制好的菌懸液應(yīng)盡快使用，盡可能在 24小時(shí) 內(nèi)使用)。7.2接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂

7、培斜面培養(yǎng)基上，20T25C培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用接種環(huán)輕輕 將抱子洗脫。然后用一支10ml無(wú)菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無(wú)菌紗布包扎，吸出抱子菌 液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)小于100cfu的抱子懸液，28C保存，備用。7.3注意事項(xiàng)菌懸液配制的稀釋過(guò)程中，每一級(jí)稀釋液混合震蕩必須充分。由于菌種為具有特殊活性的生物，菌種的狀態(tài)、接種量及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)最終菌懸液配制濃度 都有影響，因此試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按照已確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。制備好的原菌懸液以當(dāng)天使用為宜。自我保護(hù)

8、，防止感染。7.4菌液計(jì)數(shù)方法每次制備菌液量約100ml，將制備好的菌液充分搖勻，用滅菌移液管吸取1ml，置適宜的滅菌試管中，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，然后 充分搖勻，作為10-1倍稀釋菌液，再?gòu)?0倍稀釋菌液管吸取1ml，置適宜的滅菌試管中， 加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，充分搖勻，作為10-2倍 稀釋菌液，依次稀釋，制備一系列稀釋菌液，將各稀釋菌液取1ml，涂布于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)平皿中， 每種菌液作平行樣，30E35E培養(yǎng)1824小時(shí)，計(jì)數(shù)，取菌液濃度在小于

9、 100cfu/ml稀釋級(jí)的菌液 作為供試菌懸液。白色念珠菌、黑曲霉菌液取1ml分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿 中，每種菌液作平行樣，20C25C培養(yǎng)2448小時(shí)，計(jì)數(shù)。生抱梭菌培養(yǎng)應(yīng)在厭氧培 養(yǎng)專用袋中培養(yǎng)。每稀釋取樣時(shí)，移液管須更換，每步稀釋菌液應(yīng)充分混勻，吸取體積要 準(zhǔn)確。宜選取10-410-8稀釋級(jí)菌液計(jì)數(shù)。8. 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證驗(yàn)證試驗(yàn)分3組，三批分次獨(dú)立試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照組試驗(yàn)的菌回收率。8.1供試品溶液制備取銀杏葉片10g，置適宜三角瓶中，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（可適當(dāng)均 勻加熱，溫度不超過(guò)45C） 100ml,振搖，制成1:10供試品溶液。如需稀釋時(shí)，

10、用同一 稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。8.2試驗(yàn)組取供試品溶液1ml和適量試驗(yàn)菌（使每 ml供試液含菌量不大于100cfu ），注入直徑 90mm勺無(wú)菌平皿中，每個(gè)平皿注入 15-20ml溫度不超過(guò)45C熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng) 基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每株試驗(yàn)菌平行2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度 30 C35 E 培養(yǎng)3天（其中接種白色念珠菌和黑曲霉的培養(yǎng) 5 天）;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20T25T 培養(yǎng)5天，計(jì)數(shù)。8.3菌液組取稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液，對(duì)各試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收 試驗(yàn)。

11、8.4供試品對(duì)照組取上述供試品溶液1ml注入平皿，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。8.5回收率計(jì)算試驗(yàn)組菌回收率（）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）x 100%菌液組 平均菌落數(shù)9. 控制菌（大腸埃希菌）9.1菌液制備和計(jì)數(shù)方法同7.菌液制備方法9.2供試液的制備8.1供試品溶液制備9.3試驗(yàn)菌取供試品溶液10ml和不大于100cfu的大腸埃希菌至100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基 中，混勻，按微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 （S0P-QC-A-005之大腸埃希菌檢查法檢查， 在規(guī)定的溫度和最短時(shí)間下培養(yǎng)，觀察能否檢出大腸埃希菌的反應(yīng)特征。9.4陰性對(duì)照取相應(yīng)稀釋液10ml替代供試品溶

12、液，同試驗(yàn)菌試驗(yàn)同法操作，應(yīng)能檢出大腸埃希菌 的反應(yīng)特征。10. 總結(jié)與評(píng)價(jià)對(duì)驗(yàn)證過(guò)程及結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估內(nèi)容包括是否嚴(yán)格按既定的方案組織實(shí)施，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)菌株管理是否按進(jìn)行了三次獨(dú)立的試驗(yàn)，培養(yǎng)基的適用性檢查是否進(jìn)行并符合要求, 及試驗(yàn)菌液的制備是否合理，任何偏差是否列入偏差分析并進(jìn)行調(diào)查。11. 再驗(yàn)證計(jì)劃若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。文件編號(hào)：QT- VR- QC 122-1512銀杏葉片微生物限度檢查法適用性試驗(yàn)報(bào)告報(bào)告起草方案起草人起草日期報(bào)告審核報(bào)告審核人審核日期審核日期審核日期審核日期報(bào)告批準(zhǔn)報(bào)告批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期1 驗(yàn)證參加人員及其職責(zé)部門(mén)姓名職責(zé)Q

13、C驗(yàn)證方案起草、負(fù)責(zé)實(shí)施QA負(fù)責(zé)取樣，進(jìn)度跟蹤及信息溝通質(zhì)量技術(shù)部驗(yàn)證方案、報(bào)告審核，負(fù)責(zé)驗(yàn)證組織實(shí)施、 評(píng)價(jià)及偏差調(diào)查質(zhì)量技術(shù)部驗(yàn)證方案、報(bào)告審核與批準(zhǔn)2. 概述銀杏葉片是我公司生產(chǎn)的口服固體片劑，主要用于活血化瘀通絡(luò)。用于瘀血阻絡(luò)引起的胸痹、 心痛、中風(fēng)、半身不遂、舌強(qiáng)語(yǔ)謇；冠心病穩(wěn)定型心絞痛、腦梗死見(jiàn)上述證候者。其處方為單位處方批生產(chǎn)量銀杏葉提取物40 g50kg微晶纖維素27.6g34.4kg淀粉100.8g126kg蔗糖20.8g26kg硬脂酸鎂0.8g1kg30%L 醇72g90 kg制成1000片125萬(wàn)片主要工藝為原輔料過(guò)篩，稱量，混合制粒，沸騰干燥，整粒，總混，壓片，包衣，鋁

14、 塑包裝，外包。經(jīng)前期方法確認(rèn)，本品不具有抑菌性（見(jiàn)銀杏葉片微生物方法檢查驗(yàn)證報(bào)告 編號(hào)VP-QC-026）,確認(rèn)檢查方法為：取本品10g，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100ml，溶解，混勻，制成1： 10均勻供試液。細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)檢查：取1： 10供試液按常規(guī)法檢查（平皿法）。3. 驗(yàn)證目的由于中國(guó)藥典2015年版四部1100生物檢查法之1105 1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查 法與2010年版規(guī)定的方法和條件有所變化，現(xiàn)對(duì)新版藥典規(guī)定的檢查法適用性進(jìn)行確認(rèn)， 以確認(rèn)所采用的方法適合本產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。4. 接受標(biāo)準(zhǔn)4.1需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌試驗(yàn)組各試驗(yàn)菌回收率在 5

15、0%-200%若各試驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行本產(chǎn)品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。若還存在一株 或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，可選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行本產(chǎn)品的檢 查。4.2控制菌（大腸埃希菌）試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按本供試液制備方法和控制菌檢查方法進(jìn)行本品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)設(shè)計(jì)新的方法消除本品的抑菌活性，并重新進(jìn)行確認(rèn)。5. 驗(yàn)證前準(zhǔn)備5.1樣品來(lái)源表1序號(hào)產(chǎn)品批號(hào)規(guī)格生產(chǎn)單位1151201總黃酮醇苷9.6mg萜類內(nèi)酯2.4mg浙江佐力藥業(yè)股份公司2151202總黃酮醇苷9.6mg萜類內(nèi)酯2.4mg浙江佐力藥業(yè)股份公司3151203總

16、黃酮醇苷9.6mg萜類內(nèi)酯2.4mg浙江佐力藥業(yè)股份公司5.2培養(yǎng)基及適用性檢查表2序號(hào)名稱批號(hào)有效期至生產(chǎn)廠商1胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基1503032018.03.02北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司2沙氏匍萄糖瓊脂培養(yǎng)基1507092018.07.08北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司3沙氏匍萄糖液體培養(yǎng)05.07北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司4胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基1509162018.09.15北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司5麥康凱瓊脂培養(yǎng)03.04北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司6麥康凱液體培養(yǎng)基1509242018.09.23北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司7PH7.0氯化鈉蛋白胨-緩沖液15021120

17、18.02.10北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司上述培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基適用性檢查方法檢查且符合要5.3標(biāo)準(zhǔn)菌種浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院。表3序號(hào)名稱編號(hào)菌種代數(shù)來(lái)源1大腸埃布困CMCC (B) 441025浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院2枯草芽胞桿菌CMCC(B)635013浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院3金黃色葡萄球菌CMCC(B)260035浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院4白色念珠菌CMCC(F)980013浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院5黑曲霉CMCC(F)980033浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院6銅綠假單胞菌CMCC(F)101045浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院5.4儀器與試驗(yàn)材料:主要設(shè)備情況表4序號(hào)設(shè)備名稱型號(hào)狀態(tài)1濕熱火菌

18、柜MJ 78A(B176)正常2生物安全柜BHC-1300 II A2 (B236)正常3細(xì)困培養(yǎng)箱GNP-9160 (B052)正常4霉菌培養(yǎng)箱MJ-250-I(B094)正常5.5環(huán)境監(jiān)測(cè)5.5.1微生物限度檢測(cè)室檢測(cè)情況表5相對(duì)濕度(%)不同潔凈級(jí)別相鄰房間壓差(Pa)消毒、滅菌情況塵埃粒子數(shù)沉降菌數(shù)符合要求> 10按潔凈區(qū)管理制度要求進(jìn)行消毒和火菌符合D級(jí)潔凈度要求符合D級(jí)潔凈度要求結(jié)論符合環(huán)境要求。5.5.2陽(yáng)性菌室潔凈室檢測(cè)情況表6相對(duì)濕度(%)不同潔凈級(jí)別相鄰房間壓差(Pa)消毒、滅菌情況塵埃粒子數(shù)沉降菌數(shù)符合要求> 10按潔凈區(qū)管理制度要求進(jìn)行消毒和火菌符合C級(jí)潔凈

19、度要求符合C級(jí)潔凈度要求結(jié)論符合環(huán)境要求。5.5.3生物安全柜檢測(cè)情況表7型號(hào)風(fēng)速消毒、滅菌情況塵埃粒子數(shù)沉降菌數(shù)生物安全柜BHC-1300 n A2(B236)> 0.35m/s按凈化工作臺(tái)管 理制度要求進(jìn)行 消毒和火困符合A級(jí)潔凈度要求符合A級(jí)潔凈度要求結(jié)論符合環(huán)境要求。6.6參與人員培訓(xùn)參與人員已經(jīng)嚴(yán)格培養(yǎng)，并能正確理解驗(yàn)證內(nèi)容及具體操作。6.7參考文獻(xiàn)：中國(guó)藥典2015版四部通則1105 1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查法7 菌液制備方法7.1接種金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌的新鮮培養(yǎng)物少許至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生抱梭菌的新鮮培養(yǎng)物少許至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中

20、，30°C35°C培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物少許至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20C25C培養(yǎng)2448小時(shí)。取上述培養(yǎng)物用 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于100cfu的 菌懸液，28C保存，備用(注配制好的菌懸液應(yīng)盡快使用，盡可能在 24小時(shí)內(nèi)使用)。7.2接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培斜面培養(yǎng)基上，20C25C培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，用接種環(huán)輕輕將抱子 洗脫。然后用一支10ml無(wú)菌球形毛細(xì)吸管，其管口用無(wú)菌紗布包扎，吸出抱子菌液至無(wú)菌 試管內(nèi)，用含0.05% (ml/m

21、l)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)小于 100cfu的抱子懸液，28C保存，備用(按12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分別計(jì)數(shù)， 考察其菌藪變化情況，確定其貯存期限)。7.3注意事項(xiàng)菌懸液配制的稀釋過(guò)程中，每一級(jí)稀釋液混合震蕩必須充分。由于菌種為具有特殊活性的生物，菌種的狀態(tài)、接種量及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)最終菌懸液配制濃度都 有影響，因此試驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格按照已確定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。制備好的原菌懸液以當(dāng)天使用為宜。自我保護(hù)，防止感染。7.4菌液計(jì)數(shù)方法每次制備菌液量約100ml，將制備好的菌液充分搖勻，用滅菌移液管吸取1ml，置適宜的滅菌試管中，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.

22、9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，然后充分搖勻， 作為10-1倍稀釋菌液，再?gòu)?0倍稀釋菌液管吸取1ml，置適宜的滅菌試管中，加 PH7.0無(wú) 菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，充分搖勻，作為10-2倍稀釋菌液，依 次稀釋，制備一系列稀釋菌液，將各稀釋菌液取1ml，涂布于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，接種于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)平皿中，每種菌液作平行樣，30 C35 C培養(yǎng)1824小時(shí)，計(jì)數(shù)，取菌液濃度在小于100cfu/ml稀釋級(jí)的菌液作為供試菌懸液。白色 念珠菌、黑曲霉菌液取1ml分別接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿中，每種菌液作平行樣， 20C25C培養(yǎng)2448小時(shí)

23、，計(jì)數(shù)。生抱梭菌培養(yǎng)應(yīng)在厭氧培養(yǎng)專用袋中培養(yǎng)。每稀釋取 樣時(shí)，移液管須更換，每步稀釋菌液應(yīng)充分混勻，吸取體積要準(zhǔn)確。宜選取10-410-8稀釋級(jí)菌液計(jì)數(shù)。記錄按無(wú)菌檢查標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP QC A-043)之菌液制備及活菌計(jì)數(shù)記錄(SOP-QC-A-043-R-02)填寫(xiě)。記錄及結(jié)果見(jiàn)附件。8. 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證驗(yàn)證試驗(yàn)分3組，三批分次獨(dú)立試驗(yàn)，并分別計(jì)算供試品組和對(duì)照組試驗(yàn)的菌回收率。8.1供試品溶液制備取銀杏葉片10g，置適宜三角瓶中，加PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(可適當(dāng)均勻 加熱，溫度不超過(guò)45C) 100ml，振搖，制成1:10供試品溶液。如需稀釋時(shí)，用同一稀釋 液將供試液進(jìn)一步

24、10倍系列稀釋。配制記錄見(jiàn)本微生物檢查記錄。附件。8.2試驗(yàn)組產(chǎn)品批號(hào)：151201試驗(yàn)菌枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉平行81796571838977817668均值8068867972試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行71696468均值7066產(chǎn)品批號(hào)：1512.2試驗(yàn)菌枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉平行76826672817976847468均值7969808071試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行68647266均值6669產(chǎn)品批號(hào)：151203試驗(yàn)菌枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉平行73796971847877737179均值

25、7670817575試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行73756569均值74678.3菌液對(duì)照組產(chǎn)品批號(hào)：151201試驗(yàn)枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉菌平行93977381919782929288均值9577949784試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行78847981均值8180產(chǎn)品批號(hào)：151202試驗(yàn)菌枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉平行91957381919782929288均值9377949784試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行85798478均值8281產(chǎn)品批號(hào)：151203試驗(yàn)菌枯草芽胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌銅綠假單胞菌黑曲霉平行91957684

26、919783879288均值9380948584試驗(yàn)菌白色念珠菌黑曲霉平行87898878均值88838.4供試品對(duì)照組 供試品本底菌數(shù)。產(chǎn)品批號(hào)151201151202151203需氧困總數(shù)霉菌及酵母菌總數(shù)需氧困總數(shù)霉菌及酵母菌總數(shù)需氧困總數(shù)霉菌及酵母菌總數(shù)平行0 00 00 00 00 00 0均值0000008.5試驗(yàn)菌株回收率計(jì)算試驗(yàn)組菌回收率（）=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）x 100%菌液組平均菌 落數(shù)。試驗(yàn)組菌回收率（）產(chǎn)品批號(hào)151201151202151203平均回收率（%）枯草芽胞桿菌回收率84.284.981.783.6金黃色葡萄球菌回收率88.389.687.588.5白色念珠菌回收率需氧困91.585.186.287.6霉菌及酵母菌86.4