微生物浸入試驗(yàn)

1、.類別：技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗(yàn)證編碼：部門：生產(chǎn)技術(shù)部頁(yè)碼：共4頁(yè)，第1頁(yè)1.目的：1.1.通過(guò)微生物侵入試驗(yàn)確認(rèn)凍干生產(chǎn)線中壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)是否完好。2.編制依據(jù)：2.1 .藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范2010年版2.2 .中國(guó)藥典2010年版二部3.支持性文件：標(biāo) 題文件編號(hào)存放地點(diǎn)4.概述：4.1. 微生物侵入試驗(yàn)是對(duì)容器/密封系統(tǒng)完好性的挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，取西林瓶，裝入培養(yǎng)基，在正常生產(chǎn)線上壓塞、扎蓋。此后，將容器密封面侵入高濃度運(yùn)動(dòng)菌液中，取出、培養(yǎng)并檢查是否有微生物侵入，以確認(rèn)容器密封系統(tǒng)完好性。此同時(shí)，需作陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，確認(rèn)培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力。5.范圍：

2、本確認(rèn)方案適用于本公司凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗(yàn)證。6.實(shí)驗(yàn)材料大豆胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基（SCDM/2）、銅綠假單胞菌(ATCC 9027) 、革蘭染色、含0.5的過(guò)乙酸的70異丙醇、凍干粉針生產(chǎn)線西林瓶、膠塞、鋁蓋、凍干粉針生產(chǎn)線壓塞機(jī)及軋蓋機(jī)、盛菌懸液的容器、固定西林瓶支架等。7.時(shí)間安排年 月 日 年 月 日類別：技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗(yàn)證編碼：部門：生產(chǎn)技術(shù)部頁(yè)碼：共4頁(yè)，第2頁(yè)8.試驗(yàn)步驟8.1.試驗(yàn)用培養(yǎng)基的制備。8.1.1.在生產(chǎn)線上取足夠量按相應(yīng)清潔滅菌規(guī)程制備好的西林瓶、灌裝已滅菌的SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉湯)培養(yǎng)基，在凍干生產(chǎn)線上抽真空、壓塞

3、及扎蓋將西林瓶密封。8.1.2.將密封良好的西林瓶取出，每一西林瓶倒轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與容器內(nèi)表面充分接觸，并小心去除至少50個(gè)試樣的鋁蓋，注意不要破壞其密封口（將去鋁蓋時(shí)不慎損壞容器密封性的所有試樣剔除），在3035下豎放培養(yǎng)14天。8.1.3.接受標(biāo)準(zhǔn)：在培養(yǎng)期內(nèi)，各試樣不生長(zhǎng)菌。8.2.確認(rèn)培養(yǎng)基促菌生長(zhǎng)能力-營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)8.2.1.所有試樣培養(yǎng)14天均不長(zhǎng)菌時(shí)，隨機(jī)取出20個(gè)帶蓋試樣，每個(gè)試樣內(nèi)接種0.1ml的銅綠假單胞菌ATCC 9027，菌液濃度：10100CFU/0.1ML8.2.2.在3035下培養(yǎng)7天，或培養(yǎng)至所有試樣都呈陽(yáng)性結(jié)果。8.2.3.若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣中，

4、微生物生長(zhǎng)良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力合格。8.2.4.可是使用革蘭染色和紫外燈下肉湯呈藍(lán)綠色熒光的性質(zhì)，來(lái)鑒定并確認(rèn)試樣容器內(nèi)生長(zhǎng)的菌為接入的銅綠假單胞菌。8.3.挑戰(zhàn)菌懸浮液的制備8.3.1.從銅綠假單胞菌ATCC 9027的新鮮斜面上取一整環(huán)培養(yǎng)物，分別接入含6ml無(wú)菌培養(yǎng)基的試管中，在3035下培養(yǎng)1618小時(shí)。8.3.2.將每管的培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)入含600ml相同培養(yǎng)基（SCDM/2）的容器內(nèi)，于3035下培養(yǎng)2224小時(shí)。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，能明顯見(jiàn)容器內(nèi)培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。8.3.3.在挑戰(zhàn)試驗(yàn)開始時(shí)，挑戰(zhàn)用菌懸液濃度（活菌數(shù)）必須達(dá)到：1*106CFU/ml。8.3.4培養(yǎng)結(jié)束后的菌懸

5、液即可用來(lái)作壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)系統(tǒng)完好性試驗(yàn)。8.4.微生物侵入試驗(yàn)本試驗(yàn)需在生物安全柜內(nèi)或其他不影響生產(chǎn)環(huán)境的地方進(jìn)行。類別：技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗(yàn)證編碼：部門：生產(chǎn)技術(shù)部頁(yè)碼：共4頁(yè)，第3頁(yè)8.4.1.將新鮮的銅綠假單胞菌ATCC 9027菌懸液倒入合適的盆中，用金屬支架固定試樣容器，使試樣倒置在菌懸液中。8.4.2.將50個(gè)經(jīng)過(guò)凍干線的抽真空、壓塞、扎蓋的西林瓶的試樣倒置入菌懸液中，該組試樣記為A組。同時(shí)，將25個(gè)去除鋁蓋的試樣容器倒置入菌懸液中，該組試樣記為B組。（試樣容器內(nèi)的無(wú)菌培養(yǎng)基應(yīng)充分接觸封口內(nèi)表面，樣品的頸部及封口的外表面應(yīng)完全浸泡在懸液中）。8.4.3

6、. 實(shí)驗(yàn)開始時(shí)取一份菌懸液，平板計(jì)數(shù)每毫升所含的活菌數(shù)，并通過(guò)革蘭染色方法確認(rèn)微生物是銅綠假單胞菌。8.4.4.將A組及B組試樣容器在菌懸液中持續(xù)浸泡約4小時(shí)。8.4.5.浸泡結(jié)束時(shí)，利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)菌懸液的濃度。從菌懸液中取出試樣，擦干試樣容器外的殘余菌懸液，然后用含0.5的過(guò)乙酸的70異丙醇消毒容器外表面。8.4.6.取裝滿培養(yǎng)基的有鋁蓋和去鋁蓋的樣品各兩個(gè)，作為陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照試樣不經(jīng)過(guò)菌懸液的浸泡，其外表用含0.5的過(guò)乙酸的70異丙醇消毒，后接入10100CFU銅綠假單胞菌ATCC 9027。8.4.7.將消毒后所有的試樣放在塑料袋中，在3035下培養(yǎng)7天。在操作過(guò)程中不要損壞無(wú)鋁

7、蓋試樣膠塞的密封性。8.4.8.培養(yǎng)7天后，對(duì)每一試樣進(jìn)行觀察檢查，有微生物生長(zhǎng)記作“+”，無(wú)微生物生長(zhǎng)記作 “”。將結(jié)果記錄在凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性試驗(yàn)結(jié)果記錄。. v.類別：技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性驗(yàn)證編碼：部門：生產(chǎn)技術(shù)部頁(yè)碼：共4頁(yè)，第4頁(yè)8.4.9.如果容器中長(zhǎng)菌，利用革蘭氏染色法鑒定所長(zhǎng)菌為銅綠假單胞菌；如果容器中不長(zhǎng)菌，則從浸過(guò)菌懸液的A組取10個(gè)試樣，B組取5個(gè)試樣，分別進(jìn)行微生物營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)。注1：在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中所有的營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)必須都合格，這樣試樣的挑戰(zhàn)試驗(yàn)才有效果。注2：挑戰(zhàn)試驗(yàn)所用菌懸液需經(jīng)過(guò)滅菌后丟棄。注3：在培養(yǎng)期內(nèi)，發(fā)現(xiàn)任何帶蓋試樣長(zhǎng)菌時(shí)，

8、則試驗(yàn)無(wú)效，須棄去全部試樣，重新從頭開始。9.接收標(biāo)準(zhǔn)9.1.微生物營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)9.1.1.若7天內(nèi)，所有接種銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長(zhǎng)良好，則容器內(nèi)培養(yǎng)基的促菌生長(zhǎng)能力可判為合格。使用革蘭氏染色鏡檢，并置于紫外燈下，培養(yǎng)基呈藍(lán)綠色熒光，則確定試樣品容器內(nèi)生長(zhǎng)的菌為所接入的銅綠假單胞菌，即為陽(yáng)性。9.1.2.若7天內(nèi)，所接種的銅綠假單胞菌的試樣品中，微生物生長(zhǎng)不良好或鑒別后受其他的污染，則試驗(yàn)失敗，需重新做營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)。9.2.微生物侵入試驗(yàn)9.2.1挑戰(zhàn)試驗(yàn)中A組和B組如果長(zhǎng)菌，需記錄長(zhǎng)菌的試樣數(shù) ，在A組中如出現(xiàn)長(zhǎng)菌試樣則需經(jīng)過(guò)以下要求進(jìn)一步調(diào)查。9.2.2.仔細(xì)去除微生物生長(zhǎng)的容器的蓋和塞，檢查容器封口是否有缺損，造成微生物入侵，將檢查到試樣容器口缺損的應(yīng)當(dāng)詳細(xì)的記錄。9.2.3. 如果任何挑戰(zhàn)試驗(yàn)中長(zhǎng)菌的容器不是由于容器封口明顯的物理性缺損所致，則說(shuō)明容器/密封系統(tǒng)挑戰(zhàn)試驗(yàn)失敗。. v.表1：微生物營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)檢測(cè)記錄接種日期接種人接入菌種培養(yǎng)天數(shù)檢查觀察結(jié)果檢查人復(fù)核人表2：凍干生產(chǎn)線壓塞、扎蓋密封系統(tǒng)完好性試驗(yàn)結(jié)果記錄加塞扎蓋時(shí)間營(yíng)養(yǎng)性試驗(yàn)結(jié)論試樣浸泡時(shí)間試樣培養(yǎng)時(shí)間浸泡前菌液濃度浸泡