2016年版植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)

1、北京農(nóng)學(xué)院自編教材指導(dǎo)書(shū)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)（2016版）李奕松姬謙龍馬蘭青葛秀秀楊明峰王文平趙筱萌編北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院2016.2目錄實(shí)驗(yàn)室特別提醒實(shí)驗(yàn)一質(zhì)壁分離法測(cè)定細(xì)胞滲透勢(shì)4實(shí)驗(yàn)二小液流法測(cè)定植物組織水勢(shì)5實(shí)驗(yàn)三葉綠體色素的提取分離理化性質(zhì)及定量測(cè)定7實(shí)驗(yàn)四植物根系活力的測(cè)定（TTC法）10實(shí)驗(yàn)五過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定12實(shí)驗(yàn)六植物硝酸還原酶（NR）活性的測(cè)定14實(shí)驗(yàn)七植物細(xì)胞膜透性的測(cè)定16實(shí)驗(yàn)八植物光合速率的測(cè)定17實(shí)驗(yàn)室特別提醒1、 實(shí)驗(yàn)室紀(jì)律要求1. 按照規(guī)定，穿好實(shí)驗(yàn)服進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。2. 不允許將食品和飲用水帶進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。3. 按照教師指定的實(shí)驗(yàn)臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不允許

2、私自調(diào)換位置。4. 實(shí)驗(yàn)課中禁止大聲喧嘩、跑動(dòng)和打鬧。2、 實(shí)驗(yàn)安全注意事項(xiàng)5. 注意電源使用安全，禁止?jié)袷职尾宀孱^。6. 水浴鍋鍋蓋開(kāi)啟關(guān)閉時(shí)，注意避免蒸汽燙傷。7. 注意抽氣泵安全使用。8. 注意使用分光光度計(jì)時(shí)參比液體樣品不能滿(mǎn)溢灑漏。3、 實(shí)驗(yàn)課程要求9 .提前預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)內(nèi)容，熟悉實(shí)驗(yàn)原理和步驟。10 .檢查臺(tái)面用具是否完好，若否，須報(bào)告進(jìn)行補(bǔ)充調(diào)整。11 .清洗器皿程序：“自來(lái)水一去污粉一自來(lái)水一去離子水”12 .實(shí)驗(yàn)原始結(jié)果記錄需要指導(dǎo)教師審查簽字。13 .實(shí)驗(yàn)后填寫(xiě)儀器使用記錄。14 .實(shí)驗(yàn)完畢清潔實(shí)驗(yàn)器皿和臺(tái)面、地面衛(wèi)生。15 .離開(kāi)實(shí)驗(yàn)課堂需要得到指導(dǎo)教師批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)一質(zhì)壁分

3、離法測(cè)定細(xì)胞滲透勢(shì)一、原理：在生活細(xì)胞和外界溶液構(gòu)成的滲透體系中，水分總是從高水勢(shì)一方流向低水勢(shì)一方。將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間以后，有的細(xì)胞吸收水分，細(xì)胞膨脹；有的失去水分，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離。如果在某一溶液中細(xì)胞脫水達(dá)到平衡時(shí)剛好細(xì)胞處在臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的壓力勢(shì)等于零，外界溶液的滲透勢(shì)等于細(xì)胞滲透勢(shì)，故此外界溶液稱(chēng)為該組織的等滲溶液，其濃度稱(chēng)之為該組織的等滲濃度。根據(jù)公式即可計(jì)算出該組織細(xì)胞液的滲透勢(shì)。在實(shí)際測(cè)定時(shí)，由于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)難以在顯微鏡下直接觀(guān)察到，所以一般均以細(xì)胞初始質(zhì)壁分離狀態(tài)作為判斷組織等滲濃度的標(biāo)準(zhǔn)。如果細(xì)胞質(zhì)壁分離較為明顯，可根據(jù)

4、引起質(zhì)壁分離的溶液濃度，與相鄰的不引起質(zhì)壁分離的溶液濃度，取其平均值，求出組織等滲濃度，并計(jì)算出溶液的滲透勢(shì)，即為該組織細(xì)胞的滲透勢(shì)。二、材料與設(shè)備：1 .植物材料：洋蔥鱗莖、大蔥、蠶豆葉片或其它植物葉片。2 .設(shè)備：顯微鏡1臺(tái)、培養(yǎng)皿7套；滴管；載玻片、蓋玻片各5片；鑷子1把；單面刀1片；濾紙適量。3 .試劑：1.00mol/L蔗糖溶液，0.03%中性紅溶液.三、實(shí)驗(yàn)步驟：1 .以1.00mol/L蔗糖溶液為母液,依照公式CiVi=C2V2配制0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mol/L蔗糖溶液各10ml于干燥清潔的小培養(yǎng)皿內(nèi)備用。注意蓋上培養(yǎng)皿蓋，防止蒸發(fā)濃縮。2 .用刀片在

5、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮上劃出邊長(zhǎng)為5mm的小方格，用鑷子剝?nèi)?nèi)表皮數(shù)塊浸入盛有0.03%中性紅溶液的小培養(yǎng)皿內(nèi)，染色3min，取出后放入盛有自來(lái)水的小培養(yǎng)皿內(nèi)，沖洗中性紅留存在細(xì)胞間隙、細(xì)胞壁等上面的浮色，用濾紙吸干內(nèi)表皮上的多余水分。3 .在盛有不同濃度蔗糖溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)分別放入染過(guò)色并漂洗后的內(nèi)表皮數(shù)塊。20min后，按從高濃度到低濃度蔗糖溶液的順序各取出內(nèi)表皮小塊，依次開(kāi)始鏡檢，繪圖記錄質(zhì)壁分離情況，求出組織細(xì)胞的等滲溶液濃度。四、結(jié)果計(jì)算：由所得到的組織細(xì)胞的等滲濃度和測(cè)定時(shí)的室溫，用下式計(jì)算植物細(xì)胞的滲透勢(shì)。Ws=-iCRT(MPa)Ws：為細(xì)胞滲透勢(shì)，以MPa表示。i：為溶液的等滲系數(shù)(蔗

6、糖溶液的i=1)。C：等滲溶液的濃度(mol/L)。T:為絕對(duì)溫度，T=(273+tC)K,t為實(shí)驗(yàn)時(shí)的室溫。R:為氣體常數(shù)，R=0.008314(LMPa/molk)實(shí)驗(yàn)二小液流法測(cè)定植物組織水勢(shì)一、原理水勢(shì)表示水分的化學(xué)勢(shì)，水分從水勢(shì)高處流向低處。植物體細(xì)胞之間、組織之間以及植物體和環(huán)境之間的水分移動(dòng)方向都由水勢(shì)決定。當(dāng)植物細(xì)胞或組織分別放在一系列濃度遞增的溶液中時(shí)，如果植物組織的水勢(shì)小于溶液的滲透勢(shì)，則組織吸水而使外界溶液濃度變大；反之，則組織水分外流而使外界溶液濃度變小。若植物組織的水勢(shì)與溶液的滲透勢(shì)相等，則二者水分保持動(dòng)態(tài)平衡，所以外界溶液濃度不變，而外界溶液的滲透勢(shì)即等于所測(cè)植物組

7、織的水勢(shì)。溶液濃度不同，比重不同，當(dāng)兩個(gè)不同濃度的溶液相遇時(shí)，稀溶液由于比重小而上浮，濃溶液則由于比重較大而下沉。取浸過(guò)植物組織的溶液一小滴(為了便于觀(guān)察可先染色)，放在原來(lái)濃度的溶液中，觀(guān)察液滴升降情況即可判斷濃度的變化，如小液滴不動(dòng)，則表示溶液浸過(guò)植物組織后濃度未變，即外界溶液的滲透勢(shì)等于組織的水勢(shì)。二、材料與設(shè)備：1 .植物材料：胡蘿卜肉質(zhì)根或其它作物的葉片。2 .設(shè)備：青霉素小瓶或小試管（12X10mm）6支（均具塞）；大試管（15X150mm）6支（具塞）；10ml移液管2支；1ml移液管2支；毛細(xì)滴管6支；打孔器1個(gè)；溫度計(jì)1支；解剖針1支；鑷子1把。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、以1.00m

8、ol/L蔗糖溶液為母液,依照公式C1V1=C2V2配制一系列不同濃度的蔗糖溶液（0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L）于6支干凈、干燥的大試管中，各管加塞，并編號(hào)。按編號(hào)順序在試管架上排成一列，作為對(duì)照組。2、另取6支干凈、干燥的青霉素小瓶，編定序號(hào)，按順序放在試管架上，作為實(shí)驗(yàn)組。然后由對(duì)照組的各試管中分別取溶液1ml移入相同編號(hào)的實(shí)驗(yàn)組試管中，加塞，備用。3、取胡蘿卜肉質(zhì)根（或剪下具有代表性的新鮮葉片）立即用打孔器打園片。注意實(shí)驗(yàn)材料的取樣部位一定要一致，若為葉片組織要避開(kāi)大的葉脈部分。迅速將適量植物材料放在青霉素小瓶（或小試管）中。一般胡蘿卜肉質(zhì)根放入8片（厚約1m

9、m）左右，葉片材料放入20片左右。搖動(dòng)小瓶，使植物材料浸入到溶液中。注意這個(gè)過(guò)程操作要快，防止水分蒸發(fā)。放置20min。在此期間搖動(dòng)小瓶2-3次，使組織和溶液之間進(jìn)行充分的水分交換。4、20min后，分別在各小瓶中加入甲烯蘭粉末少許，搖勻，使溶液為藍(lán)色。按濃度依次分別用毛細(xì)吸管吸取少量藍(lán)色溶液，輕輕插入相應(yīng)濃度的試管中，伸至溶液中部，小心緩慢地放出藍(lán)色溶液一小滴，慢慢取出毛細(xì)管（注意避免攪混溶液）。觀(guān)察并記錄液滴的升降情況：如果有色液滴向上移動(dòng)，說(shuō)明浸過(guò)植物組織的蔗糖溶液濃度變小，植物組織失水，表明植物組織的水勢(shì)高于該濃度溶液的滲透勢(shì)；如果有色液滴向下移動(dòng)，說(shuō)明浸過(guò)植物組織的蔗糖溶液濃度變大，

10、植物組織吸水，表明植物組織的水勢(shì)低于該濃度溶液的滲透勢(shì)；如果液滴靜止不動(dòng)，則說(shuō)明植物組織的水勢(shì)等于該濃度溶液的滲透勢(shì)。在測(cè)定中，如果在前一濃度溶液中液滴下降，而在后一濃度溶液中液滴上升，則該組織的水勢(shì)為前后二種濃度溶液滲透勢(shì)的平均值。四、結(jié)果計(jì)算記錄液滴靜止不動(dòng)的試管中蔗糖溶液的濃度。由所得到的等滲濃度和測(cè)定的室溫，按下式計(jì)算植物組織的水勢(shì)。Ww=-iCRT（MPa）Ww為植物組織水勢(shì)，以MPa表示。i：為溶液的等滲系數(shù)（蔗糖溶液的i=1）。C：為等滲溶液的濃度：（mol/L）。T:為絕對(duì)溫度：T=（273+tC）K,t為實(shí)驗(yàn)時(shí)的室溫。R:為氣體常數(shù)：R=0.008314（LMPa/molk）

11、實(shí)驗(yàn)三、葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)及定量測(cè)定I.葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)一、原理：葉綠體中含有綠色素（葉綠素a和b）和黃色素（胡蘿卜素和葉黃素）。這兩類(lèi)色素能溶于有機(jī)溶劑，且各種色素的脂溶性不同。根據(jù)它們?cè)谟袡C(jī)溶劑（如乙醇、甲醇、丙酮等）中的溶解特性，可將它們從葉子中提取出來(lái)。葉綠素是一個(gè)雙羧酸的脂，在堿的作用下，可發(fā)生皂化反應(yīng)。在酸性條件下，葉綠素啉環(huán)中央的鎂可被氫取代，于是葉綠素成為褐色的去鎂葉綠素。葉綠素中的鎂也可被銅、鋅等金屬離子取代，此時(shí)葉綠素仍可保持綠色。葉綠素在光照下會(huì)發(fā)出暗紅色的熒光。二、材料與設(shè)備：1. 植物材料：新鮮植物葉片。2. 設(shè)備：研缽一套；漏斗一個(gè)；剪子一把；細(xì)玻

12、璃棒一支；燒杯（50ml）1支；20ml刻度試管5支；5ml刻度試管2支；25ml刻度吸管2支；酒精燈；石棉網(wǎng)；鐵三腳架；濾紙適量。3. 試劑：丙酮；CaCO3;80%丙酮；苯；醋酸酮粉末；50%醋酸；KOH-甲醇溶液（20克KOH溶于100ml甲醇中）三、實(shí)驗(yàn)步驟：1. 色素的提取取洗凈新鮮的植物葉子5克，剪碎放入到研缽中，加入少量碳酸鈣和石英砂，再少量多次加入丙酮共10ml，研磨至丙酮染成深綠色，將丙酮提取液濾入小燒杯內(nèi)，再用10ml丙酮重復(fù)研磨，過(guò)濾，濾液待用。2. 理化性質(zhì)的測(cè)定1）熒光現(xiàn)象取葉綠素提取液，放入試管中，在反射光下觀(guān)察，溶液的顏色為暗紅色，這是葉綠素輻射熒光的現(xiàn)象；在透射

13、光下為綠色，是由于葉綠素分子不吸收綠色光的原因。2）皂化作用用移液管吸取葉綠素提取液5ml,放入到一大試管中，再加入1.5ml20%KOH-甲醇溶液，搖勻。緊接著加入5ml苯，馬上搖勻。沿試管璧加入蒸餾水1ml，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)試管，靜置于試管架上，可看到溶液逐漸分成兩層，上層是苯溶液，其中溶有黃色的類(lèi)胡蘿卜素，下層為稀的丙酮溶液，其中溶有綠色的皂化的葉綠素a和bo3）取代作用H+和Cu2+對(duì)葉綠素分子中Mg2+的取代用移液管吸取葉綠素提取液5ml，放入試管中，加入50%醋酸數(shù)滴（或濃HCL12滴），搖勻，可觀(guān)察到溶液由綠色變成褐色，此時(shí)葉綠素分子中的Mg2+被H+取代，為去鎂葉綠素。之后將溶液倒一半

14、于另一試管中，加醋酸酮粉末少許，微微加熱，則溶液顏色又變成綠色，此時(shí)去鎂葉綠素分子中的H+被Cu2+取代，為銅代葉綠素。將兩試管中的溶液進(jìn)行比較。11. 葉綠素的吸收光譜與定量測(cè)定一、原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆兆贤夥止夤舛扔?jì)的使用，學(xué)習(xí)測(cè)定葉綠素的含量及吸收光譜的測(cè)定方法。根據(jù)葉綠素對(duì)可見(jiàn)光有特定的吸收光譜，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)下測(cè)定其光密度，利用公式計(jì)算葉綠素的含量。該法不但精確度高而且能在未分離的情況下，分別測(cè)定葉綠素a和葉綠素b的含量。已知葉綠素a、b在紅光區(qū)的最大吸收峰分別位于663nm和645nm,又已知在波長(zhǎng)663nm下葉綠素a、b的80%丙酮溶液的比吸收系數(shù)為82.04和9.72

15、，在波長(zhǎng)645nm下分別為16.75和45.60。其關(guān)系式：D663=82.04Ca+9.72CbD645=16.75Ca+45.6Cb（2）D663、D645:分別為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm的光密度。Ca、Cb:分別為葉綠素a、b的濃度，單位為mg/L解方程（1）（2）得：Ca=12.7D6632.59D645.（3）Cb=22.9D6454.67D663.（4）Ca與Cb相力口，既得葉綠素總量CtCt=Ca+Cb=20.3D645+8.03D663（5）根據(jù)葉綠素a、b在652nm處有相同的比吸光系數(shù)（34.5）,即可在此波長(zhǎng)下測(cè)定光密度（D652）而求出葉綠素總濃度Ct：D

16、6521000XCt（mg/L）=.（6）34.52 .材料和設(shè)備：1 .實(shí)驗(yàn)材料：菠菜葉片2 .設(shè)備：756紫外分光光度計(jì)，電子天平，研缽一套，漏斗一個(gè)，25ml容量瓶一個(gè)3 .試齊J:80%丙酮，CaCO3粉末3 .實(shí)驗(yàn)步驟：1 .葉綠素提取液的置備：稱(chēng)取新鮮干凈的葉片（去主脈）0.1克，剪碎，放入研缽中，加入少量CaCO3粉末和石英砂，加入80%丙酮，仔細(xì)研磨成勻漿，再加入適量丙酮，繼續(xù)研磨至組織殘?jiān)優(yōu)榘咨o止片刻，將提取液過(guò)濾至25ml容量瓶中，再用80%丙酮沖洗研缽和濾紙，將色素沖洗干凈，最后用80%丙酮定容至25ml,搖勻、待用。2 .光密度測(cè)定與吸收光譜掃描：以80%丙酮做對(duì)

17、照，按下列步驟輸入程序：1）開(kāi)機(jī)：依次打開(kāi)外部電源（如穩(wěn)壓器卜主機(jī)電源。2）儀器自檢：當(dāng)打開(kāi)儀器電源時(shí)，儀器便進(jìn)入自檢程序，自檢各項(xiàng)都“OK”后，進(jìn)入選擇工作方式界面；預(yù)熱半小時(shí)后進(jìn)行以下操作。3）光度測(cè)量未知葉綠素a、b總濃度的測(cè)定：3.1 進(jìn)入光度測(cè)量（652nm,）：在選擇工作方式界面中按鍵進(jìn)入光度測(cè)量。3.2 參數(shù)設(shè)置：按F1鍵進(jìn)行參數(shù)設(shè)置：選測(cè)光方式為“Abs”，按RETURN|鍵退出；按F2鍵進(jìn)入測(cè)量模式；按|goto入j入測(cè)量樣品波長(zhǎng)值。3.3 校零：在第一樣品池中放入?yún)⒈热芤海碅UTOZERO鍵，儀器進(jìn)行自動(dòng)校零，校完后取出參比溶液。3.4 測(cè)量：將取出的參比溶液倒掉，換上樣

18、品溶液，放入第一樣品池內(nèi)，按|STARTSTOP|即可測(cè)量樣品Abs值。4）光譜測(cè)量4.1 進(jìn)入光譜測(cè)量：在選擇工作方式界面中按鍵進(jìn)入光譜測(cè)量。4.2 參數(shù)設(shè)置：按F1進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置：（1）測(cè)量波長(zhǎng)范圍（700-300）;（2）記錄范圍（0-3）;（3）采樣間隔（1nm）;（4）光度方式（一般為Abs）;（5）掃描速度（一般為中速）。參數(shù)設(shè)置完后按RETURN鍵退出參數(shù)設(shè)置。4.3 基線(xiàn)校正：在第一樣品池中放入?yún)⒈热芤?，按AUTOZERO鍵儀器進(jìn)行基線(xiàn)校正，校完后取出參比溶液。4.4 掃描：將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入第一樣品池中，按|STARTSTOP儀器自動(dòng)進(jìn)行掃描。四、葉綠素含

19、量的計(jì)算：按公式（3）、（4）分別計(jì)算葉綠素a、b的濃度，相加既得總濃度，也可按公式（6）直接算出葉綠素總濃度。然后按公式（7）或（8）算出葉綠素總含量：CT（mg/L）提取液總積（L）稀釋倍數(shù)葉綠素含量（鮮重）=X100%（7）樣品鮮重（mg）CT（mg/L）提取液總體積（L）稀釋倍數(shù)(8)葉綠素含量（mg/g）=樣品鮮重（g）實(shí)驗(yàn)四、植物根系活力的測(cè)定（TTC法）一、原理根是植物的重要器官，它不斷生長(zhǎng)，具有吸收水分和礦質(zhì)養(yǎng)分的功能，而且還能進(jìn)行合成代謝，如氨基酸、植物激素等的合成。所謂根系活力是泛指根的吸收、合成代謝等等的能力。根系活力與吸收作用的強(qiáng)弱有直接關(guān)系，與脫氫酶系活性的強(qiáng)弱成正比

20、。TTC法測(cè)定根系活力就是根據(jù)根系脫氫酶系氧化還原能力強(qiáng)弱而設(shè)計(jì)的。氯化三苯基四氮唑（TTC）是標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位為80mv的氧化還原物質(zhì)。其氧化態(tài)無(wú)色，并溶于水，但被還原后即生成不溶于水的三苯基甲腙，呈紅色，它在空氣中不會(huì)自動(dòng)氧化，相當(dāng)穩(wěn)定，所以可用TTC作為脫氫酶的氫受體.植物根所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸、延胡素酸、蘋(píng)果酸得到加強(qiáng)；而被丙二酸、碘乙酸等所嚴(yán)重抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性，并作為根系活力的指標(biāo)。二、材料與設(shè)備1. 植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或仔細(xì)洗凈泥土的植物幼苗的根。玉米根系發(fā)達(dá)，是較好的實(shí)驗(yàn)材料。2. 設(shè)備：721型分光光度計(jì)；溫箱；電子天平；研缽

21、1套；鑷子1把；漏斗1個(gè)；刻度吸管2ml1支、10ml2支、0.5ml1支；容量瓶10ml1個(gè)、刻度試管20ml6支；燒杯500ml1個(gè)；石英砂適量。3. 試劑1 、乙酸乙酯（分析純）500ml；2、分析純連二亞硫酸鈉（Na2s204）粉末少許；3、1%TTC溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取TTC1.000g,溶于水中，定容至100ml;溶液pH應(yīng)在6.57.5,以pH試紙?jiān)囍?，如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水? 、0.4%TTC溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取TTC0.400g，溶于水中，定容至100ml；5、1/15mol/L磷酸緩沖液（pH=7.0）,配制方法為：A液：稱(chēng)取分析純Na2HP042H2011.8

22、76g溶于蒸儲(chǔ)水中成1000ml,B液：稱(chēng)取分析純KH2P04,9.078g溶于蒸儲(chǔ)水中成1000ml。用時(shí)取A液60ml、B液40ml混合即成。6、1mol/L硫酸：用量筒取出比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪邊加入盛有500mldH2O的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。三、實(shí)驗(yàn)步驟（定量測(cè)定）（1）TTC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：吸取0.25ml0.4%TTC溶液放入10ml刻度試管中，加入少許Na2s204粉末應(yīng)盡量多加一些，以使TTC充分還原，搖勻后立即產(chǎn)生紅色的三苯基甲腙。用乙酸乙酯原液定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.10，0.25，0.50，0.75，1.00ml置10ml刻度試管中，

23、分別加乙酸乙酯4.90，4.75，4.50，4.25，4.00ml，即得到含三苯基甲腙0.01，0.025，0.05，0.075，0.10mg的標(biāo)準(zhǔn)比色系列，以乙酸乙酯做空白作參比，在485nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度。以TTC還原量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。（2）剪取植物根尖1cm部分為實(shí)驗(yàn)材料，稱(chēng)取0.1g,放入刻度試管中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸在溶液內(nèi)，在37下保溫40-60min，植物根尖部分成為紅色。之后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應(yīng)。空白試驗(yàn)為先加硫酸再加入根樣品，其它操作相同。（3）用鑷子將根夾出，沖洗后擦干表面水分，加入

24、少許乙酸乙酯和少量石英砂在研缽內(nèi)研磨，以提取出紅色的三苯基甲腙，把紅色浸提液濾入試管，并用乙酸乙酯洗滌研缽中的殘?jiān)?3次，至到殘?jiān)鼮榘咨Ｈ缓笥靡宜嵋阴⒔嵋憾ㄈ葜?ml。浸提液在485nm下比色，以空白試驗(yàn)（先加硫酸到再加入根樣品操作得到的溶液）作參比，讀出光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出TTC還原量。四、結(jié)果計(jì)算：TTC還原量（mg）TTC還原強(qiáng)度=（mgg-1-min-1）根重（g）x酶促反應(yīng)時(shí)間（min）實(shí)驗(yàn)五、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定一、原理：過(guò)氧化氫酶（CAT）在植物體內(nèi)普遍存在，它能把過(guò)氧化氫分解為水和氧氣。其活性大小以一定時(shí)間內(nèi)分解的過(guò)氧化氫量來(lái)表示。讓酶與定量的底物（過(guò)氧化氫

25、）進(jìn)行定時(shí)的反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，再用碘量法測(cè)定剩余的過(guò)氧化氫量。以鉬酸銨作催化劑，過(guò)氧化氫與碘化鉀在酸性條件下反應(yīng)，放出游離碘。然后用硫代硫酸鈉滴定碘，其反應(yīng)為：H2O2+2KI+H2SO4-I2+K2SO4+2H2Ol2+2Na2s2O3-2NaI+Na2s4。6根據(jù)空白（不加酶液）和測(cè)定（加酶液）二者滴定值之差，即可求出酶分解的過(guò)氧化氫量。酶活性單位為：分解H2O2mg/gmin二、材料與設(shè)備1. 植物材料：小麥或其它植物葉片2. 設(shè)備：電子天平；研缽一套；100ml三角瓶4個(gè)；100ml容量瓶2個(gè)；50ml酸式滴定管1支；恒溫水浴；漏斗1個(gè)；濾紙適量；移液管10ml1支、5ml2支、1ml

26、1支。3. 試劑：1 碳酸鈣粉末。2 1.8mol/L硫酸：取1000ml燒杯1只，加入約500mldH2。，邊攪拌邊加入100ml濃硫酸，冷卻后，用容量瓶定容至1000ml。3 10%鉬酸銨溶液。4 1%淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小燒杯中加約20ml水調(diào)勻，慢慢傾入約80ml沸水中，在攪拌下加熱至重新沸騰，冷卻后貯于滴瓶中。5 0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液：稱(chēng)取NaS2Q-5屋025g溶于新煮沸并冷卻過(guò)的dHaO中，加入約0.1gNa2CO,并稀釋至1L。保存于棕色試劑瓶中，放置暗處，一天后進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定方法：精確稱(chēng)取分析純&Cr2。約0.15g置于500ml三角瓶中，加30ml

27、dH2O溶解，加入2gKI和5ml6mol/L鹽酸，在暗處放置5min，然后用水稀釋至200ml，用0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定，當(dāng)溶液從棕紅色變成淺黃色時(shí)，加入1ml淀粉溶液，繼續(xù)滴至溶液由蘭色變成亮綠色（Cr+離子的顏色）為止，計(jì)算出NaGQ的摩爾濃度。6 0.02mol/L硫代硫酸鈉：吸取20ml標(biāo)定過(guò)的0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液，加入到100ml容量瓶中，加dH2O定容到刻度。注意現(xiàn)用現(xiàn)配。7 0.06mol/L過(guò)氫化氫，取1ml30%勺過(guò)氧化氫用dH2O稱(chēng)釋至150ml。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1 、酶液提取：稱(chēng)取剪碎混勻的新鮮小麥葉片1g置于研缽中，加0.2g碳酸鈣和dH2O2ml

28、，仔細(xì)研磨成勻漿。過(guò)濾至100ml容量瓶中，用dHO稱(chēng)釋至刻度，振蕩片刻，靜置。取10ml溶液再移入另一容量瓶中，加dH2O至刻度，搖勻備用。2 、測(cè)定：取100ml三角瓶4個(gè)，編號(hào)。每瓶加酶液5ml,立即向3、4號(hào)瓶中加入1.8mol/L硫酸3ml，終止酶的活性，作為空白測(cè)定。然后將各瓶放在20水浴中保溫，10min后依次向各瓶加入3ml0.06mol/L過(guò)氫化氫，搖勻并記錄加入時(shí)間，讓酶作用5min，再依次向1、2號(hào)瓶各加入3ml1.8mol/L硫酸。然后4個(gè)瓶各加入1ml20%碘化鉀、3d鉬酸銨及5d淀粉指示劑，用0.02mol/L硫代硫酸鈉滴定到蘭色消失。四、過(guò)氧化氫酶活性的計(jì)算：從空

29、白測(cè)定的硫代硫酸鈉滴定值減去樣品測(cè)定的滴定值，即可求出此期間過(guò)氧化氫酶所分解的過(guò)氧化氫量?？瞻椎味ㄖ担╩l）樣品滴定值（ml）被分解的H2O2量（mg）=x硫代硫酸鈉（mol/L）x34234為H2O2的分子量】被分解H2O2量（mg）ml）測(cè)定時(shí)用酶液（ml）CAT活性（H2O2mg/g-min）=樣品重（g）x時(shí)間（min）實(shí)驗(yàn)六、植物硝酸還原酶（NR）活性的測(cè)定一、原理：硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。其反應(yīng)式為：NO-+NADH+H+->NO2-+NAD+H2O。硝酸還原酶活性高低以生成的亞硝態(tài)氮衡量，酶活性一般以單位時(shí)間每克鮮重植

30、物材料還原生成的亞硝態(tài)氮含量表示，即以NO-ug/g.h為單位。NO-含量的測(cè)定可用磺胺比色法，該方法能測(cè)定的NaNO2濃度為0.5ug/ml。亞硝酸鹽與對(duì)-氨基苯磺酸（或?qū)?氨基苯磺酰胺）及“-蔡胺（或蔡基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。硝酸還原酶活性的測(cè)定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡(jiǎn)單，硝酸還原酶不用從植物組織中提取出來(lái)，其作用產(chǎn)物NO-可以從組織內(nèi)滲透到外界溶液中，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液中NO-含量的增加，即能表明酶活性的大小。硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，當(dāng)向培養(yǎng)介質(zhì)中加入硝酸鹽時(shí)，植物體內(nèi)很快就會(huì)出現(xiàn)硝酸還原酶。二

31、、材料設(shè)備：1. 植物材料：小麥、玉米或其它植物材料的葉片。2. 設(shè)備：分光光度計(jì)；真空抽氣裝置；溫箱；打孔器；電子天平；小三角瓶；試管；移液管5ml的2支、2ml的4支。3. 試劑：1 、0.2mol/L硝酸鉀溶液：溶解10.11g硝酸鉀于dH2O中，定容至500ml。2 、0.1mol/L磷酸緩沖液，PH=7.5A液：0.2mol/LNaH2PO,取NaHPO27.8g,dH2O溶解，配制成1000ml溶液。B液：0.2mol/LNazHPO,取NaHPO71.7g,dH2O溶解，配制成1000ml溶液。取A液16ml、B液84ml,混合，用dHO稀釋至200ml。3、磺胺試劑：1g磺胺（

32、或?qū)Π被交撬幔┘?5ml濃鹽酸，用dHO稀釋至100ml。4 、”-蔡胺試劑：0.2ga-蔡胺溶于含1ml濃鹽酸的dHO中，定溶至100ml?；?qū)-蔡胺溶于25ml的冰醋酸中，用dHaO稀釋至100ml。5、亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取AR級(jí)NaNO0.1000g,用dHO溶解、定溶至100ml,取5ml,再用dH2O稀釋至1000ml，即為NO2-含量是5ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)液。三、實(shí)驗(yàn)步驟1 、將新鮮的葉片用水洗凈，吸水紙吸干表面水分，然后用打孔器打成直徑為1cm的園片，稱(chēng)取等量葉園片2份（每份0.20.3g），用dH2O洗滌23次，吸干水分，分別置于含有下列溶液的2個(gè)50ml三角瓶中：（1）0.

33、1mol/L磷酸緩沖液（PH7.5）5ml+dH2O5ml,（2）0.1mol/L磷酸緩沖液（PH7.5）5ml+0.2mol/LKNO35ml。注意將溶液浸沒(méi)植物材料，然后將三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣710min，放氣后，園片即沉于溶液中。將三角瓶置于30溫箱中，不見(jiàn)光，保溫30min。注意取樣前葉子要進(jìn)行一段時(shí)間的光合作用，以積累碳水化合物，如果組織中的碳水化合物含量低，會(huì)使酶的活性降低。2 、NO2-含量測(cè)定：保溫30min結(jié)束后，分別取出1ml反應(yīng)液于試管中，加入磺胺試劑或?qū)Π被交撬?ml，搖勻。再加入.蔡胺13t劑2ml,搖勻。注意各試劑的加入順序。在30c溫箱中保溫3

34、0min,用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)比色，測(cè)定光密度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得NO2-含量，然后計(jì)算酶活性。單位為NO2-ug/g.h。3 、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：取7支試管，編號(hào)，按下表順序添加試劑，每加入一種試劑后注意搖勻。待試劑加完后，將各試管置30c溫箱中保溫30min,立即于520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，讀出光密度，以光密度為縱坐標(biāo)，NO-濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。注意：測(cè)定NO-的磺胺比色法很靈敏，可以檢出低于1ug/ml的NaNO含量，由于顯色反應(yīng)的速度與重氮化作用及偶聯(lián)作用的速度有關(guān)，溫度、酸濃度等都影響顯色速度，同時(shí)也影響靈敏度，但如果標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與樣品的測(cè)定都在相同條件下進(jìn)行則顯色速度相等，彼

35、此可以比較。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的試劑配比試管號(hào)NaN麗準(zhǔn)液(ml)dHO(ml)磺胺試劑（ml）“奈胺(ml)反應(yīng)終了NQ-含量vg/管10122020.10.9220.530.2P0.82121.040.40.6222.050.60.4223.060.80.2224.071.00225.0四、結(jié)果計(jì)算：亞硝酸鹽還原量（“g：在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中以實(shí)驗(yàn)中的吸光度值查硝酸還原酶活性=H-（ggg-1h-1）材料重量（g）x酶促反應(yīng)時(shí)間（h）實(shí)驗(yàn)七、植物細(xì)胞膜透性的測(cè)定一、原理：植物組織受不良環(huán)境條件（如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染）危害時(shí)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能首先受到傷害，使細(xì)胞膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞的內(nèi)含物

36、會(huì)有不同程度的外滲。若將受傷害的組織浸入無(wú)離子水中，其外滲液中電解質(zhì)的含量增加。組織受傷害越嚴(yán)重，電解質(zhì)含量增加得越高。用電導(dǎo)儀測(cè)定外滲液電導(dǎo)度的變化，可反映出質(zhì)膜受傷害的程度。透性變化愈大，電導(dǎo)度愈大，表示受傷害愈重，也就表示抗性愈弱。二、材料與設(shè)備：1 .植物材料：選取小麥或其它作物一定葉位和葉齡的功能葉片。2 .設(shè)備：電導(dǎo)儀1套，真空抽氣裝置1套；50ml三角瓶3只；剪子1把；濾紙適量，打孔器1個(gè)，玻棒2根。3 .試齊J:ddHO或去離子水。三、實(shí)驗(yàn)步驟：1、清洗用具：電導(dǎo)法對(duì)水和容器的潔凈度要求嚴(yán)格，器皿稍有雜質(zhì)即產(chǎn)生電導(dǎo)度的很大誤差。故所用玻璃用具洗凈后，再用自來(lái)水、無(wú)離子水沖洗四、

37、五次。倒置于洗凈而墊有潔凈濾紙的盤(pán)中。2、取樣及處理：分別在正常生長(zhǎng)和逆境脅迫的植株上取同一部位的功能葉若干片，分成2份。用紗布擦凈表面灰塵。將其中一份低溫處理：放在-20C左右的溫度下冷凍20min（或高溫處理：置40c左右的恒溫箱中處理30min）;另一份裹入潮濕的紗布中放置在室溫下作對(duì)照。處理后分別用去離子水沖洗兩次，用潔凈的濾紙吸干，然后用打孔器（1cm2）將葉片打取12個(gè)葉園片，分別放入三角瓶中，準(zhǔn)確加入20ml的無(wú)離子水，浸沒(méi)葉片，然后放入真空抽氣裝置中抽氣約10min,以抽出細(xì)胞間隙空氣，緩緩放氣，水即滲入細(xì)胞間隙，葉子變成透明狀，沉在三角瓶底部，取出三角瓶，放在室溫下保持30m

38、in,間或搖動(dòng)幾次。3、測(cè)定：將電導(dǎo)儀的電極插入三角瓶中，測(cè)定外滲液的電導(dǎo)值，記錄其初始電導(dǎo)值（Si）。之后，將三角瓶放入沸水浴中5min,以殺死組織。待冷至室溫后，再次測(cè)定外滲液的電導(dǎo)值（及）。四、結(jié)果計(jì)算：按下式計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)度：相對(duì)電導(dǎo)度（L）=Sl/S2相對(duì)電導(dǎo)度的大小表示細(xì)胞受傷害程度。由于對(duì)照（在室溫下）也有少量電解質(zhì)外滲，故可按下面公式計(jì)算由于高溫或低溫脅迫而產(chǎn)生的外滲,稱(chēng)為傷害度。傷害度（%=（Lt-Lck）/（1-Lck）X100%式中：Lt處理葉片的相對(duì)電導(dǎo)度；Lck對(duì)照葉片的相對(duì)電導(dǎo)度。實(shí)驗(yàn)八、植物光合速率的測(cè)定1. TPS-1便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)一、原理：1 .測(cè)定CO

39、2和H2O的值是通過(guò)測(cè)定參比氣體（進(jìn)入葉室氣體中的CO2和H2O濃度）和流出葉室氣體中的CO2和H2O濃度（分析氣）的濃度差值來(lái)實(shí)現(xiàn)的。CO2對(duì)紅外線(xiàn)的最大吸收波長(zhǎng)是4.26pm.。TPS利用這一吸收特點(diǎn)測(cè)定CO2的濃度。水蒸氣壓是由一個(gè)電容傳感器測(cè)定的。2 .儀器測(cè)定參數(shù)：光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、葉片溫度、細(xì)胞間隙CO2濃度、大氣濕度、大氣溫度、大氣CO2濃度、光合有效輻射、光一光合響應(yīng)曲線(xiàn)、CO2光合響應(yīng)曲線(xiàn)。并且可以通過(guò)這些響應(yīng)曲線(xiàn)計(jì)算出RuBP竣化效率、表觀(guān)量子產(chǎn)量、光補(bǔ)償點(diǎn)、CO2補(bǔ)償點(diǎn)、光飽和點(diǎn)、CO2飽和點(diǎn)、RuBP最大再生速率以及光合作用氣孔限制值等一些非常有用的生理生態(tài)

40、參數(shù)。二、材料與設(shè)備：1 .材料：綠色植物葉片TPS-1是以開(kāi)放式氣路系統(tǒng)原理設(shè)計(jì)的光合作2 .設(shè)備：英國(guó)PP公司TPS-1便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)。用測(cè)定系統(tǒng)，主要由主機(jī)和葉室兩部分組成。三、操作步驟：打開(kāi)TPS前，請(qǐng)進(jìn)行以下檢查：1 .如果TPS與葉室連用，在打開(kāi)電源之前要確定葉室與TPS-1系統(tǒng)是否正確連接，如果正確連接，開(kāi)機(jī)后TPS-1系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)檢測(cè)。2 .檢查吸收管中的化學(xué)試劑，必要時(shí)應(yīng)更換（參考吸收管和化學(xué)試劑的環(huán)境條件部分）。正式開(kāi)機(jī)操作：第一步：打開(kāi)TPS-1系統(tǒng)電源：大約7秒鐘后顯示主菜單（如果顯示CHECKSUMERROR或MEMORYCORRUPT請(qǐng)查閱錯(cuò)誤信息部分）：1

41、REC2CAL3DMP4CLR5CLK6DIAG第二步：按1鍵REC后顯充.一SETPLC1:BROAD2 :UNIVERSAL第三步：選2鍵UNIVERSAL后，顯示：1REC:M2INT:001FLO:300第四步：當(dāng)屏幕顯示如上時(shí)，按Y鍵后，顯示:1:LIGHT=SUN(orLAMP)第五步：按2鍵后，屏幕顯示為2.leafarea=9991: LIGHT=SUN(orLAMP)2: LEAFAREA=?.?第六步：設(shè)置好測(cè)量葉面積后按"Y鍵進(jìn)入測(cè)量狀態(tài)；屏幕顯示:Cnnnn+/-nnnQnnnnHnn.n+/-nn.nTnn.n：IC:為參比CO2濃度，以ppm為單位(00002500);+/-nnn：為分析氣與參比氣CO2濃度差值，以ppm為單位；Q:為光量子通量密度，以Wmolm-2s-1為單位(00002500);H:為參比水蒸氣壓，以毫巴為單位(00.075.0);+/-nn.n為分析氣與參比氣水蒸氣壓之間的差值，以毫巴為單位；T:為葉室溫度，以