腫瘤細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(細(xì)胞劃痕法)講義

1、抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶對腫瘤細(xì)胞遷移的影響（細(xì)胞劃痕法）實(shí)驗(yàn)導(dǎo)讀瘤組織的增殖失控、瘤細(xì)胞的分化異常、瘤細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力是惡性腫瘤最基本的生物學(xué)特征，而侵襲和轉(zhuǎn)移又是惡性腫瘤威脅患者健康乃至生命的主要原因。因此研究腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的規(guī)律及其發(fā)生機(jī)制，對惡性腫瘤的防治有重要意義。腫瘤轉(zhuǎn)移是指惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位侵入淋巴管、血管或體腔，至靶組織或靶器官，長出與原發(fā)瘤不相連續(xù)而組織學(xué)類型相同的腫瘤。前者稱為原發(fā)瘤，后者稱為轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤。AmBMBMANGIOGENESISMIGRATIONPROLIFERAHONPRIMARY SARCOMAPRIMARY CARCINOMAANGIOGEN

2、ESISARKtSFINVASION圖1腫瘤轉(zhuǎn)移示意圖但它在不斷增殖演進(jìn)至根據(jù)腫瘤異質(zhì)性理論， 大多數(shù)惡性腫瘤最初雖屬單克隆起源,臨床明顯的腫瘤時(shí)，由于瘤細(xì)胞遺傳性狀的不穩(wěn)定性（來自基因突變或缺失等）而不斷地變異，造成該腫瘤內(nèi)瘤細(xì)胞亞群表型的多樣性，諸如瘤細(xì)胞的侵襲性、生長速率、轉(zhuǎn)移能力，核型乃至對激素的反應(yīng)性和抗腫瘤藥物的敏感性等，這些瘤細(xì)胞亞群具有被此不同的特性即所謂異質(zhì)性。異質(zhì)性與腫瘤轉(zhuǎn)移直接有關(guān)的就是癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能， 癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有高 低之分，具有高轉(zhuǎn)移潛能的筋細(xì)胞易發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，來源于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)“接觸抑制”的概念。通過體外培養(yǎng)正常和惡性結(jié)締組織細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)正常纖維母細(xì)

3、胞在移動(dòng)過程中引起的皺棲腦膜與其他細(xì)胞的表面接觸時(shí)， 往往產(chǎn)生細(xì)胞膜活動(dòng)的抑制和移動(dòng)中細(xì)胞的縮短，然后停止。當(dāng)纖維母細(xì)胞生長過程中在培養(yǎng)皿上融合形成一單層時(shí)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)即顯著受到抑制。間變的肉瘤細(xì)胞則缺乏接觸抑制，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)不會被正常纖維母細(xì)胞所抑制。針對腫瘤轉(zhuǎn)移這一復(fù)雜的過程，人們研制了各種抗轉(zhuǎn)移藥物，如血小板凝集抑制劑、 管生成抑制因子、內(nèi)皮穩(wěn)定因子、干擾素一a以及其他化學(xué)藥物。細(xì)胞劃痕法是測定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性的方法之一。其借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上，劃痕致傷，然后加入藥物觀察其抑制腫瘤細(xì)胞遷移的能力。下圖即為劃痕實(shí)驗(yàn)的示意圖，圖中可見，在細(xì)胞層上出現(xiàn)一道空痕（

4、A ）,當(dāng)加入藥物后,由于藥物的作用使細(xì)胞遷移受到抑制（B），而未加入藥物的細(xì)胞保持了原有的遷移能力，在一段時(shí)間后通過遷移將劃痕掩蓋 （C）。ABC圖2實(shí)驗(yàn)結(jié)果（A表示在單層細(xì)胞上劃出的一道痕；B表示加入抑制劑，為陽性對照組;表示未加入抑制劑，為陰性對照組）、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基本原理2了解測定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性的方法一一細(xì)胞劃痕法二、實(shí)驗(yàn)原理腫瘤細(xì)胞在體外仍具有遷移的能力， 本實(shí)驗(yàn)借鑒體外細(xì)胞致傷愈合實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?利用細(xì)胞 劃痕法測定了腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)特性。三、儀器和試劑1）細(xì)胞系及其培養(yǎng)：肝腫瘤細(xì)胞 HepG22）24 孔板，移液器，倒置顯微鏡，3）主要試劑： PBS，DMEM 培養(yǎng)液，

5、0.25%胰酶，胎牛血清， 5-氟尿嘧啶溶液（ 1ug/ml ）四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 5-氟尿嘧啶溶液的配制精密稱取 10mg 用滅菌蒸餾水溶解， 定容于 100ml 容量瓶，精密移取 1ml 溶液， 稀釋至 100ml ，即得 1ug/ml 5-氟尿嘧啶溶液。2. 制備單層細(xì)胞將細(xì)胞密度為510X 105個(gè)/mL的Hep G2細(xì)胞鋪于24孔板（每孔500 uL）上，加入 含10%胎牛血清的RMPI.1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)1624 h,使形成單層細(xì)胞。3. 劃痕以五氟尿嘧啶（5- Fu）為例，首先配制1血/此的母液，取45此該母液用PBS稀釋 至1.1 mL ,得到濃度為 40/ML的5-Fu溶液。

6、用 10 uL 移液槍槍頭（或者無菌牙簽）在單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕，用PBS 清洗 3次，然后加入上面配好的 5 Fu溶液，平行兩個(gè)樣本，孵育 24 h后換成含10%胎牛血清的 RMPI.1640 培養(yǎng)液，孵育 24 h。4. 觀察并拍照吸去培養(yǎng)液，用 PBS 清洗 3 次后，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。五、注意事項(xiàng)：1. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意細(xì)胞生長狀況，選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種濃度。對不同的細(xì)胞要觀察細(xì)胞的貼 壁率等，確定實(shí)驗(yàn)時(shí)細(xì)胞的接種數(shù)量和培養(yǎng)時(shí)間，保證培養(yǎng)終止時(shí)密度適當(dāng)。2 在用 PBS 緩沖液沖洗時(shí)， 注意貼壁慢慢加入， 以免沖散單層貼壁細(xì)胞， 影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié) 果。3 在藥物的篩選過程中，其

7、對細(xì)胞遷移能力的影響也是重要的一方面。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過程中需 要選擇適當(dāng)?shù)年栃詫φ战M和陰性對照組。六、思考題1. 如何用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證化學(xué)物質(zhì)能恢復(fù)或者增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力？2. 如何避免化學(xué)物質(zhì)濃度過高造成的細(xì)胞毒性對實(shí)驗(yàn)的影響？七、參考文獻(xiàn)：1司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正； 細(xì)胞培養(yǎng) ；興界圖書出版公司； 2004年3月第 1版2 Mary Birch, Stephen Mitchell, and Ian R. Hart.Isolation and Characterization of Human Melanoma Cell Variants Expressing High and Low Levels of CD44. CANCER RESEARCH 1991;51: 6660-6667.3何賢峰， 楊述華 等.唑 來膦酸 對骨肉瘤 細(xì)胞生物學(xué)行 為的影 響 . 腫