酶組織化學(xué)-劉學(xué)光

1、酶組織化學(xué)酶組織化學(xué)劉劉學(xué)學(xué)光光復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì)酶是生物體內(nèi)具有催化作用的特殊蛋白質(zhì) 一般催化劑的共性：一般催化劑的共性： 1. 1. 用量少而催化效率高用量少而催化效率高 2. 2. 不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點不改變化學(xué)反應(yīng)的平衡點 3. 3. 可降低反應(yīng)的活化能可降低反應(yīng)的活化能 作為生物催化劑的特性：作為生物催化劑的特性： 1. 1. 催化效率高：催化效率高： 比其他催化反應(yīng)高比其他催化反應(yīng)高10107 7-10-101313倍倍 2. 2. 高度專一性高度專一性 3. 3. 易失活易失活 4. 4. 酶活力受調(diào)節(jié)控制酶

2、活力受調(diào)節(jié)控制 5. 5. 酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān)酶的催化活力與輔酶、輔基及金屬離子有關(guān) 酶的酶的分類分類、命名、命名1.1.習(xí)慣命名法：習(xí)慣命名法：底物，所催化的反應(yīng)性質(zhì)，來源，其他特點2.2.國際系統(tǒng)命名法：國際系統(tǒng)命名法：酶的底物 + 催化反應(yīng)的性質(zhì)3.3.主要分類：主要分類：催化反應(yīng)的性質(zhì)，六個大類（1）氧化還原酶:氧化還原反應(yīng)（2）移換酶：功能基團的轉(zhuǎn)移反應(yīng)（3）水解酶：水解反應(yīng)（4）裂合酶：從底物上移去一個基團而形成雙鍵，或其逆反應(yīng)（5）異構(gòu)酶：同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)變（6）合成酶：連接酶 催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)且由兩種物質(zhì)（雙分子）合成一種物質(zhì)的反應(yīng)酶組織化學(xué)

3、酶組織化學(xué)( Enzyme Histochemistry) 通過細胞內(nèi)固有的酶催化底物的作用，并借助顯色反應(yīng)，通過細胞內(nèi)固有的酶催化底物的作用，并借助顯色反應(yīng)，在切片或涂片上顯示組織或細胞中內(nèi)源性酶的活性及定位在切片或涂片上顯示組織或細胞中內(nèi)源性酶的活性及定位。 特點特點 （1）原位檢測）原位檢測：組織定位組織定位 （2）顯示顯示酶活性酶活性 發(fā)展歷史發(fā)展歷史l Klebs(1868)年&Struve(1872)證明中性多核白細胞過氧化酶存在l1939年前，研究細胞內(nèi)的氧化反應(yīng)1939年，Takamatsu、Gomori 堿性磷酸酶（硫化鈷反應(yīng) 、銀反應(yīng)） 隨后：磷酰胺酶、 ATP酶、 脂酶、

4、酯酶等 金屬鹽法，硫化鈷法，偶氮色素法，偶氮色素四唑鹽法，磷酸化酶組織化學(xué)證明法l 電鏡酶組織化學(xué)：酶更精準的定位 1955年 Scheldon、 Brandes 金屬沉淀法 1967年 Seligman 鋨黑化法l 免疫組織化學(xué)：抗原抗體反應(yīng)+酶反應(yīng) 1970年 Sternberger 酶標(biāo)抗體法 基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識（一）細胞內(nèi)的酶的特性（一）細胞內(nèi)的酶的特性 * * 水溶性，易擴散，難溶或不溶于有機溶劑水溶性，易擴散，難溶或不溶于有機溶劑 * * 有機溶劑不同程度降低酶的活性有機溶劑不同程度降低酶的活性 * * 易受溫度影響，對熱耐受性弱易受溫度影響，對熱耐受性弱 * * 對干燥耐受性強對干

5、燥耐受性強（二）酶的定位（二）酶的定位 在細胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在于特定部位在細胞內(nèi)或超微結(jié)構(gòu)中存在于特定部位 漿膜漿膜 5-核苷酸酶核苷酸酶 細胞膜細胞膜 ATPase 線粒體線粒體 1. 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng) 細胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)細胞內(nèi)的酶催化分解合適的底物，生成中間產(chǎn)物，即：初反應(yīng)物物，即：初反應(yīng)物(primary reaction product, PRP)。2. 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) 其中之一再與輔助物經(jīng)一步或二步反應(yīng)，生成其中之一再與輔助物經(jīng)一步或二步反應(yīng)，生成有色不溶水有色不溶水的的終反應(yīng)物終反應(yīng)物(final reaction product, FRP) 沉積沉積在在

6、原位原位以顯示酶的存在和活性大小。以顯示酶的存在和活性大小。酶組織化學(xué)的基本原理酶組織化學(xué)的基本原理Artifact PRP彌散彌散 定位不準確定位不準確 受受3個因素影響：個因素影響： 1. 底物在酶催化下水解的速度底物在酶催化下水解的速度 快快 2. PRP在緩沖液中的彌散系數(shù)在緩沖液中的彌散系數(shù) 小小 3. PRP與輔助物反應(yīng)的速度與輔助物反應(yīng)的速度 快快 輔助物濃度一般輔助物濃度一般1 mg/ml 一般原則一般原則 最大限度保存酶活性、防止彌散、保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性最大限度保存酶活性、防止彌散、保證反應(yīng)產(chǎn)物的特異性 1. 標(biāo)本標(biāo)本處理及制片不能影響酶活性和分布處理及制片不能影響酶活性和

7、分布 2. 底物對酶有特異性：酶抑制劑底物對酶有特異性：酶抑制劑/激動劑檢測特異性激動劑檢測特異性 3. 底物和輔助試劑滲透好：迅速底物和輔助試劑滲透好：迅速，同步同步 4. 輔助試劑不能影響酶活性和其它反應(yīng)劑的滲透輔助試劑不能影響酶活性和其它反應(yīng)劑的滲透 5. PRP與輔助試劑反應(yīng)要快與輔助試劑反應(yīng)要快 FRP必需是水不溶、有色且穩(wěn)定的物質(zhì)必需是水不溶、有色且穩(wěn)定的物質(zhì) 6. 所有試劑不能與組織細胞有非特異性的吸附所有試劑不能與組織細胞有非特異性的吸附主要步驟1.組織處理：不固定（冷凍切片，新鮮）組織處理：不固定（冷凍切片，新鮮） 固固 定（特殊固定劑，低溫包埋）定（特殊固定劑，低溫包埋）2

8、.孵育孵育3.顯色顯色4.顯微鏡下觀察顯微鏡下觀察各步驟需要注意的問題各步驟需要注意的問題：1. 組織處理：組織處理：“最大限度保存酶活性最大限度保存酶活性” 最常用：新鮮組織，快速冷凍，冰凍切片最常用：新鮮組織，快速冷凍，冰凍切片 長期保存需密封長期保存需密封，-70 丙酮固定，低溫脫水、包埋（丙酮固定，低溫脫水、包埋（eg. -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶） 常規(guī)方法（極少數(shù)酶類：氯乙酸酯酶）常規(guī)方法（極少數(shù)酶類：氯乙酸酯酶） 染色前的染色前的預(yù)固定預(yù)固定 保持組織良好形態(tài)保持組織良好形態(tài) 丙酮丙酮:氯仿氯仿=1 : 1 4oC，510 分鐘分鐘 多聚甲醛，甲醛，戊二醛多聚甲醛，甲醛，戊二醛

9、 Note: 含有抑制酶活性含有抑制酶活性/細胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽細胞化學(xué)成分活性的重金屬鹽Hg/Cr/Pb等等 不用做固定劑不用做固定劑 固定方法：浸泡固定固定方法：浸泡固定 灌流固定灌流固定 細胞涂片、培養(yǎng)細胞細胞涂片、培養(yǎng)細胞: 干燥、密封、低溫干燥、密封、低溫2.2.切片制作切片制作: : 一般一般8 81212m m 3.3.緩沖液緩沖液： 用于用于配置固定液，漂洗液，酶反應(yīng)孵育液配置固定液，漂洗液，酶反應(yīng)孵育液 配制酶反應(yīng)配制酶反應(yīng)孵育液孵育液 （1 1）清洗器皿，過酸沖洗）清洗器皿，過酸沖洗 （2 2）現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮）現(xiàn)用現(xiàn)配，保持新鮮 （3) 3) 嚴格配比，保持平和嚴

10、格配比，保持平和 （4 4）防止污染）防止污染 過濾為佳過濾為佳 （5 5）優(yōu)選試劑，注意純度）優(yōu)選試劑，注意純度4. 4. 孵育反應(yīng)孵育反應(yīng) a. a. 溫度及時間溫度及時間：3737o oC C，15-30min15-30min b. b. 孵育反應(yīng)：切片孵育；漂浮孵育孵育反應(yīng)：切片孵育；漂浮孵育 5. 5. 酶顯示方法酶顯示方法 （1 1）同步顯示法）同步顯示法 （2 2）二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法）二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法） （3 3）底物自身顯示法）底物自身顯示法6. 6. 酶特異性對照實驗用酶活性抑制劑用酶活性抑制劑激活劑激活劑采用無底物的孵育液采用無底物的孵育液過固定或加熱過固定或

11、加熱改變孵育液改變孵育液選擇選擇PHPH值值細胞內(nèi)的定位差異細胞內(nèi)的定位差異對結(jié)果分析要考慮的問題經(jīng)冷凍和原位固定后經(jīng)冷凍和原位固定后，酶究竟能保存多少，酶究竟能保存多少? ?酶是否在原位酶是否在原位? ?反應(yīng)酶起了多少作用？反應(yīng)酶起了多少作用？酶的活性是否代表了細胞生活時的狀態(tài)酶的活性是否代表了細胞生活時的狀態(tài)? ?沉淀的產(chǎn)物是否代表酶本身，時間延長是否會有改沉淀的產(chǎn)物是否代表酶本身，時間延長是否會有改變，有沒有擴散移位？變，有沒有擴散移位？常用酶顯示常用酶顯示方法方法 （1 1）同步顯示法同步顯示法：PRP + PRP + 輔助物輔助物 有色有色FRPFRP 某些金屬本身或化合物生成顏色某

12、些金屬本身或化合物生成顏色（eg.eg.金屬離子沉淀反應(yīng)）金屬離子沉淀反應(yīng)） 硫化鈷（黑色）硫化鈷（黑色） 硫化鉛（棕黑色）硫化鉛（棕黑色） （2 2）二步顯示法二步顯示法（孵育后偶聯(lián)法）（孵育后偶聯(lián)法） 酶與底物作用產(chǎn)生的酶與底物作用產(chǎn)生的PRPPRP沉積于原位，隨后行顯色反應(yīng)沉積于原位，隨后行顯色反應(yīng) 適用于：適用于：PHPH反應(yīng)差別大；底物反應(yīng)差別大；底物/ /輔助物易分解輔助物易分解 局局 限：要求限：要求PRPPRP彌散度低彌散度低 （3 3）底物自身顯示法底物自身顯示法 可溶有色底物可溶有色底物 不溶有色底物不溶有色底物 底物分子重組底物分子重組(1) 金屬離子沉積法金屬離子沉積法

13、 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 Gomori反應(yīng)反應(yīng)（1941年）年） 以以beta-甘油磷酸鈉為底物，在酸性甘油磷酸鈉為底物，在酸性PH值值(4.4-5.5)下，被下，被酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（ACP）水解，釋放出磷酸鹽。遇鉛離子（水解，釋放出磷酸鹽。遇鉛離子（硝酸硝酸鉛鉛/醋酸鉛）生成磷酸鉛醋酸鉛）生成磷酸鉛(PRP)，再被，再被S2-置換，最終生成硫化置換，最終生成硫化鉛棕黑色沉淀鉛棕黑色沉淀。 酶促反應(yīng)酶促反應(yīng) R-PO4Na2+H20 R-OH +Pb3(PO4) 2 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng) Pb3(PO4)2 + 3 S2- 3PbS （棕黑色沉淀）（棕黑色沉淀） 該方法金屬離子容易反應(yīng)，沉著顆

14、粒微細，反應(yīng)色調(diào)美該方法金屬離子容易反應(yīng)，沉著顆粒微細，反應(yīng)色調(diào)美麗，反差明顯麗，反差明顯 。 ACPPb 2+ 激活劑激活劑：Mn2+ 抑制劑抑制劑：NaF定定 位位：溶酶體，：溶酶體，ER， 胞胞漿漿該酶活性比較高的器官該酶活性比較高的器官：肝、腎、腸、脾、腎上腺：肝、腎、腸、脾、腎上腺注意事項注意事項:鉛離子鉛離子 濃度是關(guān)鍵：非特異性吸附濃度是關(guān)鍵：非特異性吸附，NaF處理排除假陽性處理排除假陽性孵育時間不宜過長：彌散，核非特異著色孵育時間不宜過長：彌散，核非特異著色鉛法適用于鉛法適用于: ACP； 5-核苷酸酶；核苷酸酶； G6P酶酶；膜膜ATPase； 線粒體線粒體ATPase；

15、TTPase(硫氨酸焦磷酸酶）硫氨酸焦磷酸酶）（2 2）偶氮鹽偶聯(lián)反應(yīng)）偶氮鹽偶聯(lián)反應(yīng) 人工合成的酶底物在酶的作用下產(chǎn)生人工合成的酶底物在酶的作用下產(chǎn)生PRP，后者與重氮鹽，后者與重氮鹽結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其生成不溶性的偶氮色素結(jié)合，引起偶聯(lián)偶氮反應(yīng)，使其生成不溶性的偶氮色素 堿性磷酸酶堿性磷酸酶 a-萘基磷酸鈉萘基磷酸鈉 磷酸氫二鈉磷酸氫二鈉 + a -萘酚萘酚 -萘酚萘酚 + Fast Blue 偶氮染料偶氮染料 （藍色沉淀）（藍色沉淀） 酯酶、轉(zhuǎn)肽酶、肽酶酯酶、轉(zhuǎn)肽酶、肽酶酶酶+水水重氮鹽種類不同，其偶氮顏色多樣（藍色，紫色，紅色，重氮鹽種類不同，其偶氮顏色多樣（藍色，紫色，紅色，

16、褐色等）褐色等） 常用重氮鹽常用重氮鹽: 堅牢蘭堅牢蘭RR 堅牢蘭堅牢蘭B 堅牢蘭堅牢蘭RC 堅牢蘭堅牢蘭TR 堅堅牢蘭牢蘭B 六偶氮副品紅六偶氮副品紅 六偶氮新品紅六偶氮新品紅常用底物：萘酚常用底物：萘酚AS-B1 萘酚萘酚AS-D 萘酚萘酚AS-MX 萘酚萘酚AS-TR應(yīng)用：應(yīng)用：ALPase, ACPase 酯酶，酯酶， 轉(zhuǎn)肽酶，肽酶，轉(zhuǎn)肽酶，肽酶， beta-葡糖葡糖苷酶苷酶方法：同時偶聯(lián)法方法：同時偶聯(lián)法 后偶聯(lián)法：防止重氮鹽對酶的抑制作用后偶聯(lián)法：防止重氮鹽對酶的抑制作用(3) 四唑反應(yīng)四唑反應(yīng) 底物底物 氫離子氫離子 與無色四唑鹽結(jié)合與無色四唑鹽結(jié)合常用四唑鹽種類常用四唑鹽種類:

17、 三苯四唑氯化物三苯四唑氯化物 TTC 藍四唑鹽藍四唑鹽 BT 新四唑鹽新四唑鹽 NT 硝基蘭四唑鹽硝基蘭四唑鹽(nitroblue tetrazolium, NBT) 四硝基蘭四唑四硝基蘭四唑TNBT 噻唑蘭噻唑蘭 (3(4,5-dimethyl thiazolyl-2YL) 2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)紅色紅色 / 藍色沉淀藍色沉淀 脫氫酶脫氫酶/氧化酶氧化酶被還原被還原單胺氧化酶和幾乎所有的脫氫酶單胺氧化酶和幾乎所有的脫氫酶都可以用都可以用四唑反四唑反應(yīng)應(yīng)顯示顯示 例例：四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶四唑鹽法顯示琥珀酸脫氫酶 以琥珀酸（鈉鹽）為底物

18、，在酶的作用下脫氫，人工合成的硝基藍四唑（NBT）為受氫體，還原為紫色不溶物以代表琥珀酸脫氫酶的活性 琥珀酸脫氫酶是線粒體的標(biāo)記酶之一，存在于所有有氧呼吸的細胞，以心肌、腎曲管上皮、肝細胞含量最豐富(4) 聯(lián)苯胺色素法聯(lián)苯胺色素法過氧化物酶過氧化物酶（聯(lián)苯胺法）（聯(lián)苯胺法） NH2NH2酶酶 + H2O2NHNH棕色沉淀棕色沉淀2H聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺藍 過氧化物酶過氧化物酶催化各種物質(zhì)被過氧化氫所氧化見于乳腺、甲狀腺、唾液腺、肥大細胞等髓過氧化物酶見于中性/嗜酸性白細胞及其前體細胞，對造血系統(tǒng)疾病的鑒別診斷極為重要辣根過氧化物酶（HRP）作為大分子示蹤劑 DAB 3-二氨基聯(lián)苯胺(5) 靛藍反應(yīng)靛藍

19、反應(yīng) 底物被酶分解為二個底物被酶分解為二個PRP，其中之一可在一定條件下形，其中之一可在一定條件下形成不溶的靛藍成不溶的靛藍 酯酶酯酶 吲哚酚酯吲哚酚酯 吲哚酚吲哚酚 + RCOOH 2 吲哚酚吲哚酚 靛藍靛藍 膽鹼酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特異酯酶膽鹼酯酶、磷酸酶、糖苷酶、非特異酯酶 酶酶 + 水水氧化氧化酶組織化學(xué)的應(yīng)用了解組織、細胞的代謝活動了解組織、細胞的代謝活動細胞類型的判斷細胞類型的判斷了解細胞定位了解細胞定位用于腫瘤的研究用于腫瘤的研究用于免疫組化和雜交組化的顯示手段用于免疫組化和雜交組化的顯示手段（1）觀察組織細胞代謝）觀察組織細胞代謝心肌梗死心肌梗死2小時小時 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶 細胞色素氧化酶細胞色素氧化酶 HE無改變無改變 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶 磷酸化酶磷酸化酶Reyes Syndrome又稱腦病脂肪肝綜合征，是一種急性腦病和肝臟脂又稱腦病脂肪肝綜合征，是一種急性腦病和肝臟脂肪浸潤綜合征肪浸潤綜合征,常常發(fā)生于某些急性病毒性傳染病以后，常常發(fā)生于某些急性病毒性傳染病以后，多見于兒童