常見(jiàn)細(xì)胞核熒光染料

1、細(xì)胞核常用熒光染料有：吖啶橙（Acridine Orange，AO）、溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD、RedDot1、2 等等。透膜的染料如下：AO：具有膜通透性，能透過(guò)細(xì)胞膜，將核DNA和RNA分別染成綠色和紅色，因此使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色熒光。EB：一種高度靈敏的熒光染色劑，在標(biāo)準(zhǔn)302nm處激發(fā)出橙紅色信號(hào)。DAPI：藍(lán)色一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，其與DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，而與單鏈DNA結(jié)合無(wú)熒光的增強(qiáng)。DAPI對(duì)雙鏈D

2、NA的染色靈敏度要高于EB和PI，熒光強(qiáng)度比Hoechst低，但光穩(wěn)定性高于Hoechst。Hoechst染料：藍(lán)色一類在顯微觀察中標(biāo)記DNA的熒光染料，最常見(jiàn)的兩種是Hoechst33342和Hoechst33258。這兩種染料都在紫外350nm處被激發(fā)，在461nm處最大發(fā)射光附近發(fā)射青/藍(lán)色熒光。與DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更強(qiáng)的親脂性，因此能更好的透過(guò)完整的細(xì)胞膜，并且細(xì)胞毒性更小。RedDot 1染料： 紅色，超強(qiáng)的細(xì)胞核選擇性，其光譜相似于Draq?5 和 Draq?7。RedDot?染料可被幾種常見(jiàn)的激光激發(fā)并可在遠(yuǎn)紅外區(qū)激發(fā)熒光。RedDot

3、? 的紅色近紅外熒光有效的與其他常用熒光探針區(qū)分開(kāi)來(lái)。不透膜的染料，如下：PI：不同通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。PI作為紅色熒光復(fù)染劑首選，PI經(jīng)常與Calcein-AM或者FDA等熒光探針合用，區(qū)分死/活細(xì)胞。EthD III、7-AAD、RedDot 2： 不能透過(guò)細(xì)胞膜，但能將壞死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)；更適合凋亡壞死實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)；細(xì)胞核熒光染料（PI DAPI Hoechst33342）細(xì)胞核熒光染料PI碘化丙啶（簡(jiǎn)稱PI）是一種常用的細(xì)胞核熒光染色劑。它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但PI能透過(guò)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的膜而將細(xì)胞核染紅，PI在綠色光（540nm波長(zhǎng)）的激發(fā)下，會(huì)在6

4、00nm（紅色光）處發(fā)出明亮的熒光，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合的PI發(fā)出的熒光，與未結(jié)合的PI相比，強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)20-30倍。40016Propidium iodide(PI)100mg40017Propidium iodide, 1.0mg/1mL solution in water10mL碘化丙啶 英文名：Propidium iodide, Propidium diiodide; PI 分子式：C27H34I2N4 分子量：668.39 外觀：紅棕SF末 應(yīng)用：DNA染色 染色原理： 碘化丙啶(PI)是一種溴化乙啶的類似物，它在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破

5、損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。PI經(jīng)常被用 來(lái)與Calcein-AM或者FDA等熒光化合物一起使用，能同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色。 光譜性質(zhì)：PI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為535nm和 615nm。 染色過(guò)程： 1 用PBS或適當(dāng)?shù)木彌_液制備1050M的PI溶液。a) 2 將1/10培養(yǎng)基體積的PI溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中。b) 3 在37培養(yǎng)細(xì)胞10-20分鐘。 4 用PBS或合適的緩沖液洗滌細(xì)胞兩次。 5 用535nm激發(fā)波長(zhǎng)，615nm發(fā)射波長(zhǎng)的濾光器的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。 a) 由于PI可能具有致癌性，請(qǐng)小心操作。 b) 也可以用1/10濃度的PI緩沖液代替培養(yǎng)基。 保存條件：4避光保存

6、 對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互結(jié)合的熒光染料常用與熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)為358nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍約在400nm左右。DAPI的發(fā)散光為藍(lán)色

7、，且DAPI和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)散波長(zhǎng)，僅有少部分重疊，研究員可以善用這項(xiàng)特性在單一的樣品上進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?。DAPI能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對(duì)生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。使用過(guò)程中應(yīng)注意操作與拋棄的處理程序。DAPI 為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對(duì)雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記的效率高(幾乎為100 %

8、) ，且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒副作用。DAPI染色常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。DAPI也常用于普通的細(xì)胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。細(xì)胞經(jīng)熱激處理后用DAPI染色3分鐘，在熒光顯微鏡下可以看到到細(xì)胞核的形態(tài)變化。Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活細(xì)胞時(shí)候能輕松進(jìn)入;DAPI是半透性的,有選擇性的進(jìn)入.因此Hoechest 33258 一般用來(lái)染活細(xì)胞,可以長(zhǎng)驅(qū)直入;DAPI一般是染固定細(xì)胞.2、兩者都可以用紫外看，參見(jiàn)以下的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm；Hoechst 33258和

9、雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。DAPI的最大激發(fā)波長(zhǎng)為340nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為488nm；DAPI和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為364nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為454nm。Hoechst 33342/PI雙染色法1懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)狀態(tài)下加入Heochst 33342，終濃度為1g/ml；帖壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用含有0.02EDTA的0.25胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用1ml全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，加入Heochst 33342，終濃度為1g/ml，37孵育710min。24 5001000r/min離心棄去染液。3加入1.0ml PI染液，4避光染色

10、15min。  碘化丙啶染色     1原理  碘化丙啶(propidium iodide，PI)不能穿人完整的活細(xì)胞膜中，即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不固定的情況下對(duì)PI拒染，而壞死細(xì)胞由于失去膜的完整性，PI可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，根據(jù)此特點(diǎn)，使用PI染色可鑒別死細(xì)胞。如果對(duì)活細(xì)胞染色必須在染色前進(jìn)行固定，以增加細(xì)胞膜對(duì)染料的通透性。     2溶液配制  使用001molLPBS(pH 74)配制終濃度為05mgml的PI工作液。     3染色程序    (1)單層細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)預(yù)冷70乙醇固定1小時(shí)，4；    (2)001