基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

1、基于核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)研究進(jìn)展生命科學(xué)領(lǐng)域的核磁共振技術(shù)生命科學(xué)領(lǐng)域的核磁共振技術(shù)代謝組學(xué)概述代謝組學(xué)概述基于核磁共振的代謝組學(xué)研究進(jìn)展基于核磁共振的代謝組學(xué)研究進(jìn)展一、生命科學(xué)領(lǐng)域的核磁共振一、生命科學(xué)領(lǐng)域的核磁共振磁共振成像磁共振成像(NMRI, Nuclear Magnetic Resonance Imaging)磁共振定域譜磁共振定域譜(MRS, Magnetic Resonance Spectroscopy)核磁共振波譜核磁共振波譜(NMR, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)核磁共振二、代謝組學(xué)概述二、代謝組學(xué)概述Jeremy K

2、NicholsonImperial College London，UK代謝組學(xué)的定義代謝組學(xué)的定義Metabonomics: the quantitative measurement of the multi-parametric metabolic response of living systems to pathophysiological stimuli or genetic modifications對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動(dòng)態(tài)多參對(duì)生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測(cè)定。數(shù)代謝應(yīng)答的定量測(cè)定。J. K. Nicholson, J. C.

3、Lindon, E. Holmes. Xenobiotica, 1999, 29: 1181-89.技術(shù)：技術(shù)：NMR動(dòng)物代謝分析：動(dòng)物代謝分析：動(dòng)物的體液和組織動(dòng)物的體液和組織Oliver FiehnUniversity of CaliforniaHealth Sciences DriveDavis, USAMetabolomics: comprehensive analysis of all the metabolites of an organism. The quantitative measurement of all low molecular weight metabolites

4、 in an organisms cells at a specific time under specific environmental conditions.生物體所有代謝物的系統(tǒng)分析。本質(zhì)是生物體所有代謝物的系統(tǒng)分析。本質(zhì)是“給定細(xì)胞在給定時(shí)給定細(xì)胞在給定時(shí)間和條件下所有小分子代謝物的定量分析間和條件下所有小分子代謝物的定量分析”。 O. Fiehn. Plant Mol. Biol., 2002, 48: 155171.技術(shù)：技術(shù)：GC-MS植物代謝分析：細(xì)植物代謝分析：細(xì)胞胞代謝組學(xué)的發(fā)展代謝組學(xué)的發(fā)展198219831984198919992000200120022004 Fir

5、st publication on 1H-NMR of blood and plasmaMulti-component analysis of spectra data from rat urineNicholson and Wilson: NMR spectroscopy of biofluidsDe fi n i t i o n o f Metabonomics First independent Pharma publication of Metabonomics Publicat i on i n Na t ure on MetabonomicsExplanation of stati

6、stics in Metabonomics: publication of MS for urine profiling19701997Definition of MetabolomeMetabolic profiles of metabolites in human代謝組學(xué)的中心任務(wù)代謝組學(xué)的中心任務(wù) 對(duì)生物體液和組織中內(nèi)源性代謝物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)量和分析。對(duì)生物體液和組織中內(nèi)源性代謝物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)測(cè)量和分析。 對(duì)生物體在受到病理生理上的刺激以及某種基因修飾所帶來(lái)對(duì)生物體在受到病理生理上的刺激以及某種基因修飾所帶來(lái)的代謝物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行量化和編錄，從而得到生物體代謝的代謝物的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行量化和編錄

7、，從而得到生物體代謝隨時(shí)間及生化過(guò)程的變化而改變的信息。隨時(shí)間及生化過(guò)程的變化而改變的信息。 將這些信息與病生理過(guò)程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而確定此將這些信息與病生理過(guò)程中的生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來(lái)，從而確定此變化規(guī)律相關(guān)的靶器官和作用部位，進(jìn)而確定相關(guān)的生物標(biāo)志物變化規(guī)律相關(guān)的靶器官和作用部位，進(jìn)而確定相關(guān)的生物標(biāo)志物。系統(tǒng)生物學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)(Systems Biology)的組成的組成表現(xiàn)型表現(xiàn)型(phenotype)個(gè)體個(gè)體(individual)器官器官(organ)組織組織(tissue)細(xì)胞細(xì)胞(cell)代謝物代謝物(metabolite)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(protein)mRNADNA代

8、謝組代謝組(metabonome/metabolome)蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome)轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)基因組基因組(genome)代謝組學(xué)代謝組學(xué)(metabonomics/metabolomics)蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)系統(tǒng)生物學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)(Systems Biology)不同組學(xué)關(guān)系及分析技術(shù)不同組學(xué)關(guān)系及分析技術(shù)NMR, GC&MSGeneMetabolomics is More Time Sensitive Than Other “Omic

9、s”MetabolomicsProteomicsGenomicsResponseResponseResponseTimeGenomicsTranscriptomicsProteomicsMetabonomicsTarget materialGene, chromosome (genetic code)mRNA (genetic code)Protein (function of the protein)Low molecular weight metabolitesMW100,000-120,000 100,000-120,0005,000-20,000100- 5000Characteris

10、ticsContext independent Context dependentContext dependentContext dependentAnalysisMapping, sequencingSequencingSeparation, characterizationSeparation, characterizationMethodsDNA sequencerHybridization2D gel, Maldi TOFNMR, MS, GC, LCHuman30,000 genome109?2,500各種組學(xué)技術(shù)的比較各種組學(xué)技術(shù)的比較代謝組學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)代謝組學(xué)分析檢測(cè)技術(shù) U

11、PLC, HPLC CE/microfluidics LC-MS FT-MS QqQ-MS NMR spectroscopy X-ray crystallography GC-MS LIF detection 簡(jiǎn)便簡(jiǎn)便：樣品不需復(fù)雜預(yù)處理，檢測(cè)不需嚴(yán)格分析條件，避免引入干擾物的可能。 快捷快捷：常規(guī)1H NMR譜只需幾分鐘，且對(duì)低分子量和高分子量的代謝物均能給出定性和半定量的信息。 避免漏檢避免漏檢：不需預(yù)先選定化合物，在對(duì)待測(cè)物知識(shí)非常有限的情況下意義尤為重要?；诨贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)的代謝組學(xué)的特點(diǎn) 不破壞樣品的原有組成不破壞樣品的原有組成：NMR方法具有無(wú)損傷性, 可以在生理?xiàng)l件下

12、對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)且不影響混合物的生理生化性質(zhì)甚至化學(xué)平衡，以達(dá)到模擬體內(nèi)條件和進(jìn)行分子水平的分析需要。 NMR方法可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)方法可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)?；诨贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)的代謝組學(xué)的特點(diǎn) 分析組織的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)分析組織的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)(HR-MAS) NMR方法方法：消除了磁場(chǎng)不均勻性、化學(xué)位移各向異性和偶極偶極相互作用帶來(lái)的譜線增寬影響，從而可以獲得與液體高分辨NMR 相媲美的分辨率。 無(wú)偏向性無(wú)偏向性: NMR對(duì)所有化合物的靈敏度是一樣的, 氫譜中譜峰和化合物的氫原子是一一對(duì)應(yīng)的, 所測(cè)的每個(gè)氫原子都有其相關(guān)的譜峰, 并且信號(hào)的強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對(duì)含量

13、。基于基于NMR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)的代謝組學(xué)的特點(diǎn) 多參數(shù)多參數(shù)：從核磁譜圖中的多種參數(shù)得出結(jié)構(gòu)信息。對(duì)于藥物代謝來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)化學(xué)位移、譜峰的多重性、偶合常數(shù)、弛豫時(shí)間、NOE 效應(yīng)、譜峰強(qiáng)度等多種參數(shù)對(duì)同一問(wèn)題做全面的反映。 多核與多維多核與多維NMR：解決同一問(wèn)題可采用多核（1H、13C、15N、31P、23Na、7Li、139La 等）和多維（2D COSY、NOESY、TOCSY、HSQC）等多種核磁共振編輯手段和實(shí)驗(yàn)方法?；诨贜MR的代謝組學(xué)的特點(diǎn)的代謝組學(xué)的特點(diǎn) 檢測(cè)靈敏度低檢測(cè)靈敏度低：500MHz譜儀的1H NMR的檢測(cè)限理論為10M。 水峰過(guò)強(qiáng)水峰過(guò)強(qiáng)：體液中的生物分子一

14、般其濃度為毫摩爾級(jí)，水中質(zhì)子濃度約為100 mol/L，是生物分子濃度的105 倍! 檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有限：很難同時(shí)檢測(cè)同一樣品中含量相差很大的物質(zhì)。 譜峰重疊及譜線較寬。譜峰重疊及譜線較寬。NMR檢測(cè)生物樣品中存在的問(wèn)題檢測(cè)生物樣品中存在的問(wèn)題代謝組學(xué)中主流技術(shù)的比較代謝組學(xué)中主流技術(shù)的比較ChromatographyMass SpectrometryNMRObjectiveYesYesYesReproducibilityPoorGoodGoodResolutionFairFairGoodSensitivitySelectiveSelectiveFairUnbiased dete

15、ction (Simultaneous)NoNoYesHolisticNoNoYesMolecular informationPoorFairRichSample preparationExtensiveExtensiveLittlePre-knowledge requirementsYesYesNoin vivo/in situImpossibleAlmost impossibleYesThroughputFairHighHighRecurrent expenditureHighHighLowLabour intensivenessFairFairLowCost per sampleFair

16、/lowFairLowAnalytical ApproachesBio-systemsExogenousEndogenousExposure assessmentBio-monitoringDisease diagnostics Time courseDose responseToxins, DrugsEnvironmentaletcMetabolic pathwaysDatabasesMol. Biosyst. 2009, 5: 288; J. Proteome. Res. 2009, 8: 5657; 2009, 8: 352.代謝組學(xué)方法和流程代謝組學(xué)方法和流程三、基于三、基于NMR的代

17、謝組學(xué)研究進(jìn)展的代謝組學(xué)研究進(jìn)展 在藥物毒理代謝組學(xué)的研究領(lǐng)域，最為矚目的 工 作 是 國(guó) 際C O M E T ( C o n s o r t i u m f o r Metabonomic Toxicology)計(jì)劃，旨在建立代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)，并為目標(biāo)器官及其位點(diǎn)的毒性建立預(yù)測(cè)性專家系統(tǒng)。他們已經(jīng)建立起了第一個(gè)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的實(shí)驗(yàn)室嚙齒動(dòng)物肝臟和腎臟毒性預(yù)測(cè)的專家系統(tǒng)。1. 毒理研究毒理研究腎毒素腎毒素：HgCl2、CdCl2、Na2CrO4、硝酸鈾酰、苯酚、對(duì)氨基苯酚、六氯丁二烯(HCBD)、順鉑、2-溴乙胺(BEA)、丙烯亞胺(PI)等 肝毒素肝毒素：肼、異硫氫酸萘(ANIT)、半乳糖胺(G

18、aIN)、羥丁基甲苯(BHT) 例例1.各種腎毒素對(duì)大鼠尿液1H NMR 譜的影響。A, 對(duì)照組；B，20 mg/kg Na2CrO4(腎臟近曲小管毒)組；C，50 mg/kg 對(duì)氨基苯酚(腎臟近直小管毒)組；D，50 mg/kg 丙烯亞胺(令腎髓質(zhì)壞死)組；E，250 mg/kg 2-溴乙胺(產(chǎn)生急性腎乳頭壞死)組。-25-20-15-10-50510152025-30-20-10010PC1PC2PAPANITControl-15-10-5051015-40-30-20-10010PC1PC2ANITControla-naphthylisothiocyanite (ANIT)p-Amino

19、phenol (PAP)Control尿中乳酸升高：急性腎小管受損尿中乳酸升高：急性腎小管受損TMAO、DMA、DMG和琥珀酸水平升高：腎乳和琥珀酸水平升高：腎乳頭受損頭受損氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受損氨基酸，乳酸（血中）升高：急性肝受損氨基酸，乳酸（尿中）升高：腎小管損壞氨基酸，乳酸（尿中）升高：腎小管損壞尿中琥珀酸升高，尿中琥珀酸升高，-酮戊二酸升高，檸檬酸降低：酮戊二酸升高，檸檬酸降低：腎小管酸中毒或線粒體酶活性降低腎小管酸中毒或線粒體酶活性降低?；撬嵘撸焊闻K受損牛磺酸升高：肝臟受損酮體含量升高：線粒體中酶代謝紊亂酮體含量升高：線粒體中酶代謝紊亂肌酸含量升高：睪丸毒肌酸含量升高

20、：睪丸毒一些重要的一些重要的NMR markers 基于基于NMR 的代謝組學(xué)方法不僅能區(qū)分組的代謝組學(xué)方法不僅能區(qū)分組織器官的正常與非正常的狀態(tài)，而且能給出織器官的正常與非正常的狀態(tài)，而且能給出毒性作用的靶器官以及作用機(jī)制，識(shí)別出毒毒性作用的靶器官以及作用機(jī)制，識(shí)別出毒性的生物標(biāo)記物。性的生物標(biāo)記物。2. 藥物代謝及藥物代謝及 安全性評(píng)價(jià)安全性評(píng)價(jià)藥物種類藥物種類：利尿劑（乙酰唑胺），抗菌素（氨比西林、芐基青霉素、先鋒霉素、氟氯西林、青霉素），中樞神經(jīng)藥（脫氧麻黃堿），抗炎解熱鎮(zhèn)痛藥（氨茴酸、萘普生、布洛芬、阿斯匹林、退熱凈、撲熱息痛），抗滴蟲(chóng)藥（滅滴靈），治關(guān)節(jié)炎藥（青霉胺），抗癌藥物（

21、Au(Ph2P(CH2)2PPh2)2Cl 、IF、 Carboplation Pt(II)(NH3)2 ）樣本樣本：鼠尿，鼠膽汁，人尿，人淋巴液，血漿方法方法：1H NMR, 13C, 19F NMR, 31P, 1H-1H COSY, 1H-19F COSY 在藥物開(kāi)發(fā)階段，代謝組學(xué)不僅可以進(jìn)行早期活體毒理測(cè)試，而且能為藥物分子的篩選提供依據(jù)； 在藥物臨床應(yīng)用前，它能幫助確定藥物的安全性生物標(biāo)記物和代謝表型； 評(píng)價(jià)將動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于人類疾病的可行性。3. 病理診斷及病理生理學(xué)病理診斷及病理生理學(xué) 代謝組學(xué)相對(duì)于基因組學(xué)研究來(lái)說(shuō)，在疾病（如癌癥，糖尿病，心血管疾病，肥胖，哮喘）領(lǐng)域是一個(gè)相

22、對(duì)較新，不斷獲得更加廣泛認(rèn)可的分析方法。利用代謝組學(xué)的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷，通過(guò)對(duì)生物標(biāo)記物的尋找和相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的研究，探尋生物標(biāo)記物的代謝途徑和疾病的產(chǎn)生機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的診斷。v1957年， “NMR醫(yī)學(xué)研究系”v1979年，利用體液的氫譜對(duì)癌癥進(jìn)行診斷v 1986年，利用人血漿中脂蛋白峰的甲基和亞甲基的線寬區(qū)別進(jìn)行惡性腫瘤的診斷v近年來(lái)，通過(guò)對(duì)血漿、血清、腦脊液、卵巢囊液、組織液、鼠肝提取液的NMR分析，對(duì)體液NMR技術(shù)進(jìn)行癌癥或一些特異的腫瘤如：子房瘤、卵巢瘤、腦瘤、肝臟淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性膠質(zhì)瘤進(jìn)行檢測(cè)診斷的可能性進(jìn)行了研究。v 臨床和生化研究的一個(gè)重要領(lǐng)域：利用高分辨NMR

23、技術(shù)研究慢性腎功能衰竭(chronic renal failure, CRF)者的生化異常。v 利用NMR技術(shù)可以研究先天性代謝失常，包括2-羥基戊二酸尿癥、棕色糖尿病、酪氨酸血癥、先天性血色沉著病、先天性尿道鈣結(jié)石，在其它疾病如腦白質(zhì)病、糖尿病、神經(jīng)病等方面也取得了一些有益的研究成果。例例1. Urine samples Cataract（白內(nèi)障）（白內(nèi)障）例例2. Serum samples-cardiovascular disease (冠心病冠心病)Brindle JT et al., 2002. Nat Med. 8(12), 1439-45.4. 食品安全及質(zhì)量控制食品安全及質(zhì)量控

24、制 目前對(duì)飲食的安全可靠性和食品的質(zhì)量控制引起了科學(xué)領(lǐng)域和公眾的特別關(guān)注，促進(jìn)了在食品領(lǐng)域的代謝組學(xué)分析和對(duì)其質(zhì)量控制方面的研究。 目前主要研究方向：酒精飲料和釀造食品（啤酒、葡萄酒、蒸餾酒、醬油、醋），咖啡和茶類，水果和蔬菜（果汁、柑橘、獼猴桃、芒果、黑樹(shù)莓、甜瓜、西瓜、西紅柿、萵苣、蕓苔、土豆、胡蘿卜、玉米、小麥），橄欖油，牛奶和乳制品（牛奶、奶酪、黃油和人造黃油），蜂蜜，魚(yú)和肉類。還有其它的研究如松露、菌類和藏紅花。PCA (A) and OPLS-DA (B) 3D score plots derived from the 1H NMR spectra of beef sirloin

25、(or chuck) extracts obtained from Australia, Korea, New Zealand, and the United States of America.例例1. Extracts from beef sirloin (牛里脊肉牛里脊肉)例例2. Beer（啤酒）（啤酒）The same company, protocol (Genome), pipe-line (Proteome), but different taste (Metabolome)例例3. Wine（葡萄酒）（葡萄酒）Red wineMore tannins and phenolic

26、sWhite wineMore amino acid例例4. 蜂蜜（蜂蜜（Honey）CJ (Chinese jujube，棗花，棗花), LJ (Lonicera japonica，金銀花，金銀花), FS (Flos sophorae，槐花，槐花), FCI (Flos chrysanthemi indici，菊花，菊花), EJ (Eriobotrya japonica，枇杷，枇杷)不同花蜜的不同花蜜的NMR譜譜例例4. 蜂蜜（蜂蜜（Honey）相同產(chǎn)地相同產(chǎn)地不同花源不同花源-0.50.00.5-101PC2 (20.4%)PC1 (71.7%)FloralCJLJFSFCIEJ-10

27、1-3-2-10123PC2 (19.5%)PC1 (77.4%)FujianShanghaiZhejiang-1.0-0.50.00.51.0-101PC2 (22.1%)PC1 (65.2%)12345相同花源相同花源不同產(chǎn)地不同產(chǎn)地相同廠家相同廠家不同批次不同批次5. 營(yíng)養(yǎng)代謝研究營(yíng)養(yǎng)代謝研究 代謝組學(xué)的方法可以幫助識(shí)別和常量營(yíng)養(yǎng)物的最終攝入效應(yīng)密切相關(guān)的代謝物，并且有助于定義各種常量營(yíng)養(yǎng)物的正常攝入范圍。營(yíng)養(yǎng)代謝組學(xué)營(yíng)養(yǎng)代謝組學(xué)（Nutrimetabolomics）定義的提出。 飲食與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)與代謝組學(xué)相結(jié)合系統(tǒng)地表征在不同健康狀態(tài)（健康，亞健康，疾?。┫?，飲食習(xí)慣，地域差異，營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)

28、（種類和用量），營(yíng)養(yǎng)相關(guān)疾病等對(duì)機(jī)體造成的細(xì)微代謝變化，這些變化概況為探索不同飲食或營(yíng)養(yǎng)條件下機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞，組織和器官的生物標(biāo)記物，代謝整體水平以及代謝作用機(jī)制，并有可能為機(jī)體的健康狀況動(dòng)態(tài)地況進(jìn)行診斷和營(yíng)養(yǎng)搭配提供新的策略。6. 功能基因組的研究功能基因組的研究 隨著人類基因組測(cè)序工作的完成，人們已經(jīng)步入到了后基因組時(shí)代即對(duì)功能基因組學(xué)的研究。通常，功能基因組學(xué)利用基因組提供的信息和產(chǎn)物，運(yùn)用遺傳或其他新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)識(shí)別基因在一個(gè)或多個(gè)生物模型中的作用來(lái)全面認(rèn)識(shí)和分析基因的功能。 基因產(chǎn)生變異的生物體在生長(zhǎng)速率等表型上可能沒(méi)有顯著的改變，這是因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的代謝物濃度的改變補(bǔ)償了變異產(chǎn)生的影響。但是這也同時(shí)意味著生物體在代謝表型代謝表型上可能會(huì)有顯著的變化。代謝組學(xué)作為功能基因組學(xué)研究應(yīng)用的一個(gè)重要方法，主要是從基因表達(dá)譜的終點(diǎn)代謝物組的信息來(lái)鑒定或推測(cè)出基因的功能?！盎蚪M學(xué)告訴我們什么可能發(fā)生，代謝組學(xué)則告訴我們發(fā)生了什么”，二者相互關(guān)聯(lián)，將會(huì)從現(xiàn)象到本質(zhì)探尋生命的奧秘。7. 中醫(yī)藥現(xiàn)代化中醫(yī)藥現(xiàn)代化 代謝組學(xué)有可能在中醫(yī)“病、證、方”的研究體系中發(fā)揮作用，在規(guī)范中醫(yī)基于證的診斷標(biāo)準(zhǔn)、探索證候的動(dòng)態(tài)內(nèi)涵和演變規(guī)律，以及提示證與疾病療效的相