第八章 污染生態(tài)學的一般研究方法

1、1污染生態(tài)學污染生態(tài)學Pollution ecology 第八章第八章 污染生態(tài)學的一般研究方法污染生態(tài)學的一般研究方法 （Chapter 8: General Methods for Pollution Ecology Research ）主講：環(huán)境科學與工程學院主講：環(huán)境科學與工程學院 王宏鑌王宏鑌 2012年年12月月14日日2講授內(nèi)容講授內(nèi)容一、野外調(diào)查一、野外調(diào)查二、受控實驗二、受控實驗 （一）體內(nèi)研究（一）體內(nèi)研究整體生物試驗整體生物試驗 （二）體外研究（二）體外研究器官、細胞和亞細胞水平器官、細胞和亞細胞水平試驗試驗三、多學科交叉三、多學科交叉四、新技術(shù)的運用四、新技術(shù)的運用 （

2、一）生化和分子水平研究（一）生化和分子水平研究 （二）環(huán)境因素（二）環(huán)境因素“三致三致”作用的研究技術(shù)作用的研究技術(shù) （三）微宇宙試驗（三）微宇宙試驗3一、野外調(diào)查一、野外調(diào)查野外調(diào)查是真實獲得生物與污染環(huán)境相互野外調(diào)查是真實獲得生物與污染環(huán)境相互關(guān)系第一手資料的關(guān)鍵步驟。關(guān)系第一手資料的關(guān)鍵步驟。 能否采集到有代表性的樣本是野外調(diào)查的能否采集到有代表性的樣本是野外調(diào)查的關(guān)鍵關(guān)鍵 。在開展野外調(diào)查前，需要精心做好準備。在開展野外調(diào)查前，需要精心做好準備。采樣的記錄根據(jù)調(diào)查目的而定，但要完整，采樣的記錄根據(jù)調(diào)查目的而定，但要完整，所記載的參數(shù)要全面。所記載的參數(shù)要全面。 4一、野外調(diào)查一、野外調(diào)

3、查野外觀測研究技術(shù)野外觀測研究技術(shù) 生態(tài)環(huán)境樣品采集技術(shù)生態(tài)環(huán)境樣品采集技術(shù) 自然環(huán)境觀測技術(shù)自然環(huán)境觀測技術(shù) 土壤樣品采集技術(shù)土壤樣品采集技術(shù) 小氣候觀測技術(shù)小氣候觀測技術(shù) 水樣品采集技術(shù)水樣品采集技術(shù) 生物環(huán)境觀測技術(shù)生物環(huán)境觀測技術(shù) 大氣樣品采集技術(shù)大氣樣品采集技術(shù) 野外實驗設計技術(shù)野外實驗設計技術(shù) 生物樣品采集技術(shù)生物樣品采集技術(shù)5二、受控實驗二、受控實驗受控實驗是在模擬自然生態(tài)系統(tǒng)的受控生受控實驗是在模擬自然生態(tài)系統(tǒng)的受控生態(tài)實驗系統(tǒng)中研究單項或多項因子相互作態(tài)實驗系統(tǒng)中研究單項或多項因子相互作用及其對種群或群落影響的方法技術(shù)（鄭用及其對種群或群落影響的方法技術(shù)（鄭師章等，師章等，1

4、994）。）。由于野外干擾因素多，生物對污染的反應由于野外干擾因素多，生物對污染的反應是對綜合環(huán)境條件的反應，要探索單一污是對綜合環(huán)境條件的反應，要探索單一污染物或污染物之間對生物的聯(lián)合作用，在染物或污染物之間對生物的聯(lián)合作用，在實驗室內(nèi)需要進行添加外源污染物的受控實驗室內(nèi)需要進行添加外源污染物的受控實驗。實驗。 6（一）體內(nèi)研究（一）體內(nèi)研究整體生物試驗整體生物試驗根據(jù)暴露時間的長短可分為急性、亞慢性（亞急根據(jù)暴露時間的長短可分為急性、亞慢性（亞急性）和慢性毒性試驗。性）和慢性毒性試驗。急性毒性試驗是研究化學物等有害因子大劑量急性毒性試驗是研究化學物等有害因子大劑量一一次暴露或次暴露或24h

5、內(nèi)內(nèi)多次暴露對所試生物引起的毒性試多次暴露對所試生物引起的毒性試驗。驗。亞慢性（亞急性）毒性試驗是指機體亞慢性（亞急性）毒性試驗是指機體連續(xù)多日連續(xù)多日接接觸環(huán)境污染物的毒性效應試驗，一般暴露時間為觸環(huán)境污染物的毒性效應試驗，一般暴露時間為1-3月月。慢性毒性試驗是指機體慢性毒性試驗是指機體長期接觸長期接觸環(huán)境污染物的毒環(huán)境污染物的毒性效應試驗，一般暴露時間為性效應試驗，一般暴露時間為6個月至個月至2年年，甚至，甚至終生染毒。終生染毒。二、受控實驗二、受控實驗7劑量效應關(guān)系和劑量反應劑量效應關(guān)系和劑量反應關(guān)系曲線圖關(guān)系曲線圖劑量10050反應強度（）圖 1劑量反應曲線（直線型）劑量10050死

6、亡率（）圖2 劑量反應曲線（拋物線型）對數(shù)劑量10050死亡率（）圖3 劑量反應曲線（S形線型）死亡率（概率單位）對數(shù)劑量10050圖4 劑量反應曲線8（二）體外研究（二）體外研究器官、細胞器官、細胞和亞細胞水平試驗和亞細胞水平試驗器官灌流技術(shù)；器官灌流技術(shù)；單細胞懸液；單細胞懸液；細胞分離技術(shù)；細胞分離技術(shù)；生物離心技術(shù)。生物離心技術(shù)。9（三）微宇宙試驗（三）微宇宙試驗微宇宙法（微宇宙法（microcosm）是研究污染物在生）是研究污染物在生物種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)和生物圈水平上物種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)和生物圈水平上生物效應的一種方法，又被稱為模型生態(tài)生物效應的一種方法，又被稱為模型生態(tài)系統(tǒng)法（

7、系統(tǒng)法（model ecosystem）。）。微宇宙是自然生態(tài)系統(tǒng)的一部分，包括有微宇宙是自然生態(tài)系統(tǒng)的一部分，包括有生物和非生物的組織及其過程，能提供自生物和非生物的組織及其過程，能提供自然生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)和功能。然生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)和功能。微宇宙不完全等于自然生態(tài)系統(tǒng)，沒有自微宇宙不完全等于自然生態(tài)系統(tǒng)，沒有自然生態(tài)系統(tǒng)龐大和復雜，不能包含自然生然生態(tài)系統(tǒng)龐大和復雜，不能包含自然生態(tài)系統(tǒng)的所有組成。態(tài)系統(tǒng)的所有組成。10（三）微宇宙試驗（三）微宇宙試驗標準化水生微宇宙標準化水生微宇宙（Standardized Aquatic Microcosm，SAM）用于在實驗室測定有毒物質(zhì)在多物種水

8、平對淡用于在實驗室測定有毒物質(zhì)在多物種水平對淡水生態(tài)系統(tǒng)的影響。水生態(tài)系統(tǒng)的影響。試驗時間試驗時間64天，容器為天，容器為4L的玻璃廣口瓶，試驗的玻璃廣口瓶，試驗生物包括生物包括10種藻、種藻、4種無脊椎動物、種無脊椎動物、1種細菌。種細菌。對溫度、光照強度、對溫度、光照強度、pH值等理化參數(shù)均有具體值等理化參數(shù)均有具體要求。要求。11（三）微宇宙試驗（三）微宇宙試驗燒杯水生微宇宙燒杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC）又稱燒杯混合培養(yǎng)，試驗時間又稱燒杯混合培養(yǎng)，試驗時間1214周，容器周，容器為為1L的玻璃廣口瓶，試驗生物包括的玻璃廣口瓶，試驗生物包括4種藻、種藻、2

9、種無脊椎動物、一些細菌和原生動物。對溫度、種無脊椎動物、一些細菌和原生動物。對溫度、光照強度、光照強度、pH值等理化參數(shù)均有具體要求。值等理化參數(shù)均有具體要求。與與SAM不同的是通過加入來自生態(tài)系統(tǒng)浸出液不同的是通過加入來自生態(tài)系統(tǒng)浸出液提供給微宇宙中生物群落所需的基質(zhì)。提供給微宇宙中生物群落所需的基質(zhì)。12（三）微宇宙試驗（三）微宇宙試驗室外水生微宇宙室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm）又稱中宇宙（又稱中宇宙（Mesocosm），試驗單元），試驗單元6 m3，試驗生物包，試驗生物包括浮游植物、浮游動物、魚類、大型水生植物和無脊括浮游植物、浮游動物、魚類、大型水

10、生植物和無脊椎動物。椎動物。土壤核心微宇宙土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM ）該法采用野外環(huán)境的土壤核心，將其設置在環(huán)境條件控該法采用野外環(huán)境的土壤核心，將其設置在環(huán)境條件控制的實驗室中，試驗生物因土壤核心采集場所不同而制的實驗室中，試驗生物因土壤核心采集場所不同而不同，可研究化學物質(zhì)和營養(yǎng)元素對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的不同，可研究化學物質(zhì)和營養(yǎng)元素對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的影響及其環(huán)境歸趨。影響及其環(huán)境歸趨。模擬農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)模擬農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)（Modeling agricultural ecosystem）該系統(tǒng)模擬農(nóng)田條件，無陸生動物，為同時測定農(nóng)藥在該系統(tǒng)模擬農(nóng)田條件，無陸生動物

11、，為同時測定農(nóng)藥在土壤、植物、水溶液和空氣中的殘留而設計，采用土壤、植物、水溶液和空氣中的殘留而設計，采用0.75 m3的矩形玻璃室，可打入足夠數(shù)量的空氣，通的矩形玻璃室，可打入足夠數(shù)量的空氣，通過玻璃室模擬微風并能收集揮發(fā)的農(nóng)藥。過玻璃室模擬微風并能收集揮發(fā)的農(nóng)藥。13生態(tài)環(huán)境樣品實驗室技術(shù)生態(tài)環(huán)境樣品實驗室技術(shù)植物樣品分析技術(shù)植物樣品分析技術(shù)動物樣品分析技術(shù)動物樣品分析技術(shù)微生物樣品分析技術(shù)微生物樣品分析技術(shù)環(huán)境樣品分析技術(shù)環(huán)境樣品分析技術(shù)14三、多學科交叉三、多學科交叉生態(tài)學和環(huán)境科學等學科的研究方法均可借鑒到生態(tài)學和環(huán)境科學等學科的研究方法均可借鑒到污染生態(tài)學的研究中污染生態(tài)學的研究中

12、 。在實際研究過程中，經(jīng)常要借助化學、土壤學、在實際研究過程中，經(jīng)常要借助化學、土壤學、物理化學、植物學、動物學、微生物學、地理學、物理化學、植物學、動物學、微生物學、地理學、水文學、氣象學等學科的研究手段。水文學、氣象學等學科的研究手段。 為了更進一步研究微觀和宏觀層次下生物與環(huán)境為了更進一步研究微觀和宏觀層次下生物與環(huán)境的相互關(guān)系，還需要借助分子生物學、細胞生物的相互關(guān)系，還需要借助分子生物學、細胞生物學、遺傳學、生物化學、生理學、景觀生態(tài)學、學、遺傳學、生物化學、生理學、景觀生態(tài)學、全球生態(tài)學等的研究方法。全球生態(tài)學等的研究方法。 15四、新技術(shù)的運用四、新技術(shù)的運用（一）（一）生化和分

13、子水平研究生化和分子水平研究一般代謝酶的活性測定一般代謝酶的活性測定 乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿酯酶 三磷酸腺苷酶三磷酸腺苷酶解毒系統(tǒng)酶類誘導作用的檢測解毒系統(tǒng)酶類誘導作用的檢測 混合功能加氧酶混合功能加氧酶 谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶抗氧化防御系統(tǒng)檢測抗氧化防御系統(tǒng)檢測 PCR-SSCP（聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性）單鏈構(gòu)象多態(tài)性）技術(shù)技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù) DNA損傷試驗損傷試驗基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)16單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）單鏈單鏈DNA在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)。這種二在中性條件下會形成二級結(jié)構(gòu)。這種二級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的

14、序列。即使只有一個堿基級結(jié)構(gòu)依賴于其堿基的序列。即使只有一個堿基的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并可引起非變的不同，也會形成不同的二級結(jié)構(gòu)并可引起非變性條件下的電泳遷移率的差異。性條件下的電泳遷移率的差異。技術(shù)路線：技術(shù)路線：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物95 C變性變性5分鐘，立即置冰上。分鐘，立即置冰上。10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液聚丙烯酰胺凝膠電泳。條件：電泳緩沖液0.5 TBE，電壓，電壓70v, 4 C環(huán)境下電泳過夜（環(huán)境下電泳過夜（0.2%硝硝酸銀染色）。酸銀染色）。17熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù)（熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ Hyb

15、ridization, FISH）問世于）問世于70年代后期，年代后期，其原理是標記了熒光的單鏈其原理是標記了熒光的單鏈DNA（探針）（探針）和與其互補的和與其互補的DNA（玻片上的標本）退火（玻片上的標本）退火雜交，通過觀察熒光信號在染色體上的位置雜交，通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應基因的情況。來反映相應基因的情況。18熒光原位雜交技術(shù)熒光原位雜交技術(shù) DNA變性：變性： 當溶液中的當溶液中的DNA分子處于高溫或高分子處于高溫或高pH值值(13)條件下，維持雙螺旋在一起的堿基互補對就被破條件下，維持雙螺旋在一起的堿基互補對就被破壞，壞，DNA雙鏈解離成兩條單鏈，這一過程叫雙鏈解離

16、成兩條單鏈，這一過程叫DNA變性。變性。 DNA復性：復性： 當溫度降低至合適溫度或恢復當溫度降低至合適溫度或恢復pH值至中性，值至中性，兩條裂解的單鏈按堿基互補配對原則重新形成雙兩條裂解的單鏈按堿基互補配對原則重新形成雙鏈結(jié)構(gòu)，這一過程叫鏈結(jié)構(gòu)，這一過程叫DNA復性，又叫復性，又叫DNA雜交。雜交。192021實驗方法：實驗方法：1.1.探針及標本的變性探針及標本的變性探針變性探針變性：標本變性標本變性：222.2.雜交雜交 DNA探針探針10L滴于已變性并脫水的玻滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上片標本上，蓋上1818蓋玻片，用蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中封片，置于潮濕暗

17、盒中37雜雜交過夜（約交過夜（約1517h）。）。 233.洗脫洗脫 244.4.雜交信號的放大雜交信號的放大 255.封片封片 可采用不同類型的封片液。如果封片液可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在封好的玻片標本可以在-20-70的冰箱的冰箱中的暗盒中保持數(shù)月之久。中的暗盒中保持數(shù)月之久。 262728主要臨床特征主要臨床特征：嚴重智力低下，生長遲緩嚴重智力低下，生長遲

18、緩枕骨扁平，發(fā)際低枕骨扁平，發(fā)際低眼距寬，外眼角上斜，內(nèi)眥贅皮眼距寬，外眼角上斜，內(nèi)眥贅皮鼻根低平，舌大，腭弓高尖鼻根低平，舌大，腭弓高尖通貫手，小指內(nèi)彎，有一指褶紋通貫手，小指內(nèi)彎，有一指褶紋男性不育、女性偶有生育能力男性不育、女性偶有生育能力發(fā)病率發(fā)病率1/600800 新生兒新生兒先天愚形先天愚形(21三體綜合征，三體綜合征，Down syndrome)2921q22.2 BAC克隆在克隆在Down綜合征間期細胞中的雜交信號綜合征間期細胞中的雜交信號FISH（熒光原位雜交）（熒光原位雜交）: 熒光標記熒光標記21號染色體探針，與外周血或號染色體探針，與外周血或絨毛、羊水細胞進行原位雜交，

19、患者細胞出絨毛、羊水細胞進行原位雜交，患者細胞出現(xiàn)三個熒光信號?，F(xiàn)三個熒光信號。核型報告核型報告： 正常男性核型：正常男性核型： 46，XY 正常女性核型：正常女性核型：46，XXDown綜合征：綜合征： 47，XX（XY），），+2130（二）環(huán)境因素（二）環(huán)境因素“三致三致”作用的研究技術(shù)作用的研究技術(shù)細菌回復突變試驗（細菌回復突變試驗（bacterial reverse mutation assay）哺乳動物細胞基因突變試驗（哺乳動物細胞基因突變試驗（mammalian cell gene mutation assay）染色體畸變試驗（染色體畸變試驗（chromosome aberrat

20、ion test）微核試驗（微核試驗（micronucleus, MN）顯性致死試驗（顯性致死試驗（dominant lethal）小鼠精子畸形試驗（小鼠精子畸形試驗（sperm shape abnormality test in mice）31細菌回復突變試驗（細菌回復突變試驗（Ames試驗）試驗）利用鼠傷寒沙門氏菌突變株，即組氨酸缺陷型，其原始菌株利用鼠傷寒沙門氏菌突變株，即組氨酸缺陷型，其原始菌株菌體內(nèi)的組氨酸是通過自身一系列酶催化反應合成的，這菌體內(nèi)的組氨酸是通過自身一系列酶催化反應合成的，這種能自身合成所需營養(yǎng)成份的菌株叫做野生型菌株。種能自身合成所需營養(yǎng)成份的菌株叫做野生型菌株。本試驗用鼠傷寒沙門氏菌為突變株，其不能合成組氨酸，而本試驗用鼠傷寒沙