基因檢測行業(yè)調(diào)研

1、基因檢測行業(yè)調(diào)研繼上次基因檢測產(chǎn)業(yè)調(diào)研之后，這兩周我們再次調(diào)研了幾家基因檢測公司，并且拜訪了一些行業(yè)專家，現(xiàn)將調(diào)研的重點內(nèi)容整理如下，歡迎大家交流探討。一、基因檢測公司梳理目前全國涉及基因檢測概念的公司有200余家，按照業(yè)務(wù)范圍劃分，這些公司可以分為：最上游的基因檢測儀器開發(fā)企業(yè)（測序儀、芯片掃描儀、PCR設(shè)備），提供樣本處理試劑和耗材的中上游企業(yè)（建庫試劑盒、檢測試劑盒、工具酶、基因芯片），提供第三方基因檢測服務(wù)的中游企業(yè)，提供測序數(shù)據(jù)存儲、分析和出具報告的下游企業(yè)，還有將這三部分整合起來提供CRO服務(wù)的商業(yè)公司，當然如果公司研發(fā)實力和經(jīng)濟實力允許，大部分公司會選擇向上下游產(chǎn)業(yè)鏈延伸，進一步

2、提升自己的盈利能力。按照基因檢測公司的服務(wù)內(nèi)容，主要可以分為四類：科研服務(wù)、第三方臨床基因檢測服務(wù)、直接面向個人的檢測服務(wù)、非醫(yī)療基因檢測服務(wù)（例如食品、環(huán)境、刑偵等方面的應(yīng)用）。1 科研中的基因檢測服務(wù)又分為兩種情況，第一種是純科研服務(wù)，檢測目的純粹是滿足科研需要，不作為醫(yī)學診斷的依據(jù)；第二種是以科研的名義為患者提供醫(yī)學診斷服務(wù)，醫(yī)生在其中起主導(dǎo)作用，推薦有需要的患者去做基因檢測，醫(yī)生在其中所獲得的好處是得到用藥指導(dǎo)依據(jù)、科研數(shù)據(jù)、獲得銷售提成，這是當前腫瘤基因測序普遍采用的手段，因為目前國內(nèi)還沒有一種獲批臨床的腫瘤高通量檢測試劑盒，只能以科研的形式變相的進行醫(yī)學診斷從而獲取收益。純科研基因

3、檢測市場在百億級別。2 第三方臨床檢測機構(gòu)是指批準為醫(yī)院提供檢測外包服務(wù)的獨立醫(yī)學檢驗實驗室，大部分第三方臨檢機構(gòu)都能開展分子診斷服務(wù)（需通過臨檢中心的PCR實驗室認證），例如QPCR、ddPCR、基因芯片等，但是高通量測序在臨床檢測上的應(yīng)用當前受到限制，只有在試點名單上的機構(gòu)才能出具正式的臨檢報告，目前出臺了第一批四個領(lǐng)域的試點名單，分別是遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷、腫瘤基因測序，試點單位名單由衛(wèi)計委醫(yī)政醫(yī)管局和婦幼司共同制定。臨床基因檢測的市場空間在千億級別。3 提供面向個人基因檢測服務(wù)的商業(yè)公司，提供的是非診斷性基因檢測，例如23andMe是美國本地唯一一家被FDA

4、批準的能夠直接向個人提供基于基因檢測分析服務(wù)公司，業(yè)務(wù)范圍也僅僅提供祖源分析、遺傳病篩查、酒精耐受、基因?qū)びH這四類遺傳分析服務(wù)，23andMe此前的疾病風險篩查和藥物過敏分析被禁止，而我國有許多直接面向個人的基因檢測商業(yè)機構(gòu)，業(yè)務(wù)范圍甚至包括疾病風險、天賦基因、個性特征分析等一系列基因分析服務(wù)，未來有加強監(jiān)管和整合的壓力。商業(yè)化B2C基因檢測的市場空間在十億級別。4 非醫(yī)療基因檢測服務(wù)的應(yīng)用包括食品、環(huán)境微生物、刑偵檢測、檢驗檢疫等方面，主要由非醫(yī)學的商業(yè)檢測中心來開展，主要采用的技術(shù)是熒光定量PCR、基因芯片，測序技術(shù)用得較少。例如中德美聯(lián)是法醫(yī)DNA檢測領(lǐng)域的龍頭，主要采用熒光PCR技術(shù)，

5、法醫(yī)DNA檢測的市場空間在20億左右，但是全國共有700多個司法檢測實驗室，有一定的整合難度。整體來看非醫(yī)療基因檢測服務(wù)是碎片化市場，涉及領(lǐng)域多，空間在百億級別。當然我們重點關(guān)注的還是基因檢測在醫(yī)學診斷上的運用，這個領(lǐng)域受眾廣，附加值高，市場空間大。二、基因檢測行業(yè)到底如何監(jiān)管？我國基因產(chǎn)業(yè)處在市場興起的初期階段，監(jiān)管制度還十分不完善，給人的感覺十分混亂。2014年以前，我國基因測序行業(yè)處于無監(jiān)管狀態(tài)；2014年2月，CFDA和衛(wèi)計委叫停所有基因測序業(yè)務(wù)，對行業(yè)進行集中整頓；2014年3月，衛(wèi)計委發(fā)布關(guān)于開展高通量基因檢測技術(shù)臨床應(yīng)用試點單位申報工作的通知，通知要求已經(jīng)開展高通量基因測序技術(shù)，

6、且符合申報規(guī)定條件的醫(yī)療機構(gòu)可以申請試點，同時明確申請試點的基因測序項目。2014年12月，衛(wèi)計委醫(yī)政醫(yī)管局發(fā)布遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷這三個專業(yè)的第一批基因測序臨床試點名單；隨后2015年1月，衛(wèi)計委婦幼司正式批準108家醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)開展NIPT高通量測序技術(shù)臨床試點，并審核通過13家機構(gòu)開展植入前胚胎遺傳學診斷臨床試點；2015年3月，醫(yī)政醫(yī)管局發(fā)布了第一批腫瘤診斷與治療項目高通量測序臨床試點名單。此后CFDA批準了幾款用于高通量測序的儀器、檢測試劑等。那么基因檢測產(chǎn)業(yè)到底由誰監(jiān)管，怎么監(jiān)管，監(jiān)管的范圍是什么？我們做了以下梳理。監(jiān)管部門：整個基因檢測行業(yè)涉及細分產(chǎn)業(yè)

7、眾多，包括醫(yī)院、臨檢中心、儀器試劑、商業(yè)公司、不同的技術(shù)平臺等，所以涉及的監(jiān)管部門也較多。發(fā)改委，從宏觀上制定基因檢測產(chǎn)業(yè)的發(fā)展規(guī)劃：2015年6月，發(fā)改委發(fā)布國家發(fā)展改革委關(guān)于實施新興產(chǎn)業(yè)重大工程包的通知，其中提到要重點發(fā)展基因檢測等新型醫(yī)療技術(shù)，并將在3年時間內(nèi)建設(shè)30個基因檢測技術(shù)應(yīng)用示范中心，快速推進基因檢測臨床應(yīng)用以及基因檢測儀器試劑的國產(chǎn)化；此外地方發(fā)改委還參與基因檢測項目的定價，例如四川發(fā)改委定價無創(chuàng)產(chǎn)前2400元/次。衛(wèi)計委主要是對開展基因檢測機構(gòu)的資質(zhì)進行審查和規(guī)范，具體由三個部分監(jiān)管，分別是醫(yī)政醫(yī)改局、婦幼司、臨檢中心：醫(yī)政醫(yī)改局先后發(fā)布遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷、植入前胚

8、胎遺傳學診斷、腫瘤診斷與治療這四個專業(yè)的第一批基因測序臨床試點名單，藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南（試行），腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）等規(guī)范；婦幼司則針對產(chǎn)前檢測在醫(yī)政醫(yī)改局試點名單的基礎(chǔ)上增加了108家醫(yī)療服務(wù)機構(gòu)開展NIPT高通量測序技術(shù)臨床試點，并審核通過13家機構(gòu)開展植入前胚胎遺傳學診斷臨床試點；臨檢中心的職責是承擔臨床檢驗質(zhì)量管理與控制工作，運行全國臨床檢驗室間質(zhì)量評價計劃，建立、應(yīng)用臨床檢驗參考系統(tǒng)，對開展基因檢測服務(wù)的醫(yī)學實驗室進行評估和驗收，例如。CFDA，對基因檢測鏈上的儀器、試劑、分析軟件進行監(jiān)管，例如EGFR、KRAS、BRAF、C-KIT、CYP2C9

9、、CYP2C19等基因的檢測試劑盒、基因芯片等；在高通量測序方面，CFDA先后批準了幾款應(yīng)用于NIPT的測序儀和檢測試劑，但是在腫瘤的診斷方面，目前還沒有高通量測序儀和高通量檢測試劑盒獲批，試點單位只能以自制試劑（LDTs）的形式開展檢測。技術(shù)的監(jiān)管：基因檢測中的技術(shù)平臺主要有PCR（qPCR、ddPCR）、FISH（熒光原位雜交技術(shù)）、基因芯片、測序（一代測序、高通量測序），目前除高通量測序臨床服務(wù)制訂了限制政策，只有試點單位才能出具臨檢報告，其他基因檢測技術(shù)，如PCR、FISH、一代測序等的使用沒有限制，臨檢單位只要通過了PCR實驗室、病理學實驗室認證就可以應(yīng)用這些技術(shù)。機構(gòu)的監(jiān)管：什么樣

10、的機構(gòu)能夠開展高通量測序臨床服務(wù)？除了醫(yī)政醫(yī)改局和婦幼司發(fā)布的試點高通量基因測序技術(shù)臨床試點單位名單外，還有衛(wèi)計委批準的“個體化醫(yī)學檢測試點單位“（業(yè)內(nèi)常簡稱為LDT試點），首批試點單位包括中南大學湘雅醫(yī)學檢驗所、北京博奧醫(yī)學檢驗所和中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院這3家機構(gòu)，個體化醫(yī)學檢測試點的廣度和范疇，要高于高通量基因測序試點；此外還有一些地方衛(wèi)生部門所批準成立的檢驗所，例如“南京高新精準醫(yī)學檢驗所”。但是即使沒有這些資質(zhì)，測序服務(wù)機構(gòu)也能以科研報告的形式提供檢測服務(wù)（規(guī)避醫(yī)學檢驗的限制），或者與試點醫(yī)院成立聯(lián)合實驗室，享受利潤分成。這些都折射出當前我國基因行業(yè)監(jiān)管的不成熟，美國臨檢機構(gòu)采取的是

11、CLIA/CAP認證的形式，很大可能我國未來也會采取類似的認證資質(zhì)。應(yīng)用領(lǐng)域的監(jiān)管：目前高通量測序臨床上的應(yīng)用還只能試點應(yīng)用于遺傳病診斷、產(chǎn)前篩查與診斷、植入前胚胎遺傳學診斷和腫瘤診斷與治療四個專業(yè)方向。但是在心血管領(lǐng)域、感染性疾病、腸道微生物宏基因組學等領(lǐng)域，二代測序都有良好的應(yīng)用前景，當前的臨床高通量測序試點只是LDT試點在某個專業(yè)方向的具體應(yīng)用，未來應(yīng)用領(lǐng)域會越來越廣。儀器試劑的監(jiān)管：由CFDA進行審批，高通量測序中需要申報的有測序儀（綁定上機試劑）、建庫試劑盒、檢測試劑盒、分析軟件等。NIPT方面，CFDA先后批準了華大基因（BGISEQ-100基于life的Ion Torrent技術(shù)

12、、BGISEQ-1000基于華大基因之前收購的Complete Genomics的測序技術(shù)）、達安基因（DA Proton基于life的Ion Torrent技術(shù)）、博奧生物（BioelectronSeq 4000基于life的Ion Torrent技術(shù)）、貝瑞和康（與Illumina合作的NextSeq CN500）的NIPT二代基因測序儀和配套試劑（13、18、21號染色體三體檢測試劑盒、上機測序試劑）；在腫瘤方面，目前目前還沒有高通量測序儀和高通量檢測試劑盒獲批，試點單位只能以自制試劑（LDTs）的形式開展檢測服務(wù)。從長遠來看，多目標基因panel（幾十上百個基因或靶點）高通量檢測試劑盒

13、基本沒有獲批的可能，因為位點突變率很低，很難找到足夠的病人開展臨床試驗，并且檢測結(jié)果也無法去驗證，所以這類試劑盒只能以LTDs的形式在臨檢實驗室使用，無法外售；而少量目標基因（數(shù)個基因，少量突變位點）的檢測試劑盒可能會被CFDA審批，但是從檢測成本來說，少量目標基因的檢測成本不會比多目標基因檢測低，所以終端價格相差不大，當與多目標基因panel一起進行市場推廣的時候，并不具有優(yōu)勢?？偨Y(jié)：當前國內(nèi)高通量測序在臨床上的應(yīng)用監(jiān)管還很不成熟，試點名單是名義上具有出具臨床檢驗報告資質(zhì)的機構(gòu)，并不是其他機構(gòu)開展測序服務(wù)的限制條件（能以科研的形式開展服務(wù)），儀器、試劑的審批也不具備限制性，市場處于洗牌階段，

14、基因檢測公司需要積極進行兩手準備，一方面籌備臨檢資質(zhì)的申報，積極布局醫(yī)院終端，一方面著手儀器、試劑的審批。我國未來可能采取和美國類似的CLIA/CAP審批，優(yōu)先布局醫(yī)院渠道的有望受益。案例（美國CLIA認證）：在美國，只要通過了CLIA（Clinical Laboratory Improvement Amendments，臨床實驗室改進法案）認證，第三方實驗室就可以根據(jù)市場需求，開發(fā)出各種新的診斷試劑或服務(wù)，即自建項目或者自制試劑（LDTs）。這種檢測只能在該實驗室內(nèi)使用，不能外傳或者出售給其他任何實驗室或者醫(yī)療保健機構(gòu)，從而將風險控制在有限的范圍，因而不需要FDA的批準。同時，由于CLIA認

15、證的是實驗室，所以并不需要對每個新服務(wù)或產(chǎn)品作出審批申請。醫(yī)院或者病人可以根據(jù)自己的需要，選擇相應(yīng)的診斷項目。這個政策給了第三方實驗室極大的自由空間，也帶來了美國獨立實驗室的繁榮發(fā)展。CLIA 認證最獨特的地方在于，實驗室自建項目即使在沒有FDA批準的情況下，也完全可以在其實驗室范圍內(nèi)提供分子檢測業(yè)務(wù)來指導(dǎo)臨床。只要是有CLIA執(zhí)照的實驗室，他們自己研發(fā)的制劑、技術(shù)等也可以合法地進入臨床，合理收費。這樣做的好處就是：在巨大的醫(yī)療需求、和日新月異的新技術(shù)面前，所有的CLIA實驗室可以跟據(jù)市場需求，快速地開發(fā)出各種新的診斷應(yīng)用。同時，美國政府不必對應(yīng)接不暇的每個新應(yīng)用做出回應(yīng)。而病人可以根據(jù)自己的

16、需要，即時得到新的診斷服務(wù)。同時FDA可以選擇FDA認為真正好的診斷方法做進一步認證，并以FDA的名義發(fā)布認證，以加速FDA認為好的診斷方法在市場上的應(yīng)用。申報企業(yè)只要通過了CLIA認證，并能保證產(chǎn)品的質(zhì)量，那么就可以直接應(yīng)用于臨床上。三、基因測序重在服務(wù)基因測序重在服務(wù)，很難單獨依靠商品（檢測試劑盒、芯片）來建立優(yōu)勢，這與免疫診斷、化學發(fā)光有所不同，因為基因檢測歸根結(jié)底都是DNA一級序列的檢測，與二級、三級結(jié)構(gòu)無關(guān)，檢測原理相對簡單，都是通過DNA引物靶定待測序列，然后通過引物延伸來實現(xiàn)序列的測定；相反，樣品DNA的提取、建庫和捕獲的操作倒是比較繁瑣，需要專業(yè)的技術(shù)人員去操作。上游儀器已然被

17、少數(shù)幾個公司所壟斷，中上游的試劑盒產(chǎn)品并不具有很高的技術(shù)壁壘（當然如果能在建庫環(huán)節(jié)和捕獲環(huán)節(jié)形成明顯技術(shù)優(yōu)勢，或者是開發(fā)出效率更高的工具酶，也是很有發(fā)展前景的），而且高通量基因檢測試劑盒的審批存在較大的不確定性（未來可能參照美國CLIA認證的方式，具有資質(zhì)的檢測機構(gòu)以LTDs自制試劑的形式使用，但是不通過藥監(jiān)局的審批就無法對外銷售），醫(yī)院樣本量有限，先進入的肯定會占據(jù)諸多優(yōu)勢，NIPT市場已經(jīng)接近飽和，腫瘤醫(yī)院的爭奪也日趨白熱化，所以率先通過服務(wù)來搶占市場，這或許是較為穩(wěn)妥的選擇。醫(yī)院是否會自行購置測序儀開展高通量測序？如果醫(yī)院自己測序，那么臨檢測序機構(gòu)勢必難以競爭，所以思考這個因素是有必要的

18、。這個問題要分開來看，一方面考慮用戶的數(shù)量和需求，一方面考慮測序成本。以當前高通量測序用的最廣泛的是NIPT和腫瘤診治為例進行分析：在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，我國每年的新生兒在1500萬人左右，潛在客戶基數(shù)大，NIPT能夠給出明確的診斷結(jié)果和對應(yīng)的防治措施，而且結(jié)果關(guān)系到下一代的健康，檢測價格在2400元左右，受眾廣泛；此外，NIPT對測序的精度要求不是特別高（目前主要是針對13、18、21號染色體的三體檢查），檢測是一個定量的過程，通常采用life ion torrent平臺（目前獲批的5款儀器里面3家申報的是ion torrent，而且美國已經(jīng)有機構(gòu)采用基因芯片來做NIPT），很多大型醫(yī)院能夠自

19、行開展NIPT服務(wù)，第三方測序機構(gòu)的目標市場應(yīng)該在中小型醫(yī)院。但是高通量測序在腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用就不太一樣，我國每年新增腫瘤患者在450萬人左右，腫瘤panel測序的價格在8千到2萬之間，而且現(xiàn)在做腫瘤panel測序的患者主要目的是獲得靶向藥物用藥指導(dǎo)，靶向藥物價格比較昂貴（每個月的用藥開銷在5萬左右），所以目標人群就更加狹窄了；此外，腫瘤檢測對測序精度要求比較高，主要針對點突變或者微缺失微重復(fù)，對技術(shù)平臺的要求高，通常采用Illumina Hiseq/next Seq測序儀，儀器設(shè)備昂貴，并且開機試劑耗材的花費高（一次開機在15萬左右），如果沒有足夠的樣本量，基本上每次開機都是虧損；并且腫瘤數(shù)據(jù)

20、的分析比較復(fù)雜，需要專門的生物信息學人才和數(shù)據(jù)庫，所以在腫瘤領(lǐng)域（在其他病患更少的領(lǐng)域更是如此），我們認為高通量測序還是以第三方臨檢機構(gòu)為主，目標市場在大型醫(yī)院。四、液態(tài)活檢技術(shù)（ctDNA、CTC、外泌體）要弄清楚液態(tài)活檢（Liquid Biopsy）是什么，可以先了解一下什么是活檢?！盎顧z”即活體組織檢查，是指從患者體內(nèi)切取、鉗取或穿刺等取出病變組織，進行病理學檢查的技術(shù)。這是診斷病理學中最重要的部分，對絕大多數(shù)送檢病例都能做出明確的組織病理學診斷，被作為臨床的最后診斷。普通的活檢通常要經(jīng)過手術(shù)或者穿刺來獲得組織樣本，而且有時候需要反復(fù)多次的進行取樣，不僅繁瑣，給患者增加痛苦，而且有時候取

21、樣不準確，例如穿刺有時取到正常組織。而液態(tài)活檢是對患者血液中的游離的標志物進行檢查，不僅取樣更加方便，而且能夠在疾病的更早期獲得檢測結(jié)果。液體活檢對于我們來說其實并不陌生，例如目前已經(jīng)較為成熟的NIPT就是液體活檢技術(shù)，以前要對胎兒進行檢測要進行“羊水穿刺”，這會造成一定的流產(chǎn)風險，而NIPT就是對母體外周血中游離的胎兒DNA進行檢測，從而實現(xiàn)了無創(chuàng)檢測。液態(tài)活檢的另外一大應(yīng)用是癌癥領(lǐng)域，常規(guī)組織活檢在癌癥診治中有一定的局限性：第一，癌癥有異質(zhì)性，對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者而言，僅僅取某個部位的癌組織，并不能反映患者整體的情況，但是，對所有的癌組織都取樣又不好操作；第二，有些患者自身的情況決定

22、了他不適合組織活檢；第三，有些腫瘤在受到手術(shù)的擾動之后，有加速轉(zhuǎn)移的風險；第四，即使所有的條件都適宜，組織活檢的滯后性對患者的治療也是不利的。癌癥液態(tài)活檢的標志物主要有三種：ctDNA、CTC、外泌體。4.1 看好ctDNA檢測ctDNA(circulating tumor DNA)即循環(huán)腫瘤DNA，是人體血漿中游離的DNA (cell-free DNA，cfDNA）的一種，ctDNA是癌細胞死亡時產(chǎn)生的DNA碎片，攜帶了大量癌細胞的信息，因此通過分析血液ctDNA，可以了解患者癌細胞的突變情況。這些突變的信息能夠反映患者體內(nèi)癌癥的進展情況，以及為患者選擇合適的治療藥物。ctDNA檢

23、測的技術(shù)平臺：目前在ctDNA檢測領(lǐng)域潛力最大的技術(shù)平臺是第二代測序（NGS）和數(shù)字PCR（ddPCR），這兩個技術(shù)靈敏度較高，保證了檢出下限，ctDNA含量很低，大多低于cfDNA總量的1%，其他技術(shù)很難從正常組織DNA中檢測出異常的ctDNA。雖然目前也有研究用qPCR和基因芯片（產(chǎn)前檢測）檢測ctDNA的，但是靈敏度肯定還是大大低于NGS和ddPCR，而且隨著未來靶向藥物數(shù)量的增加，對檢測通量會有更高的要求，這或許會限制低通量檢測技術(shù)的應(yīng)用。需要注意的是ddPCR、qPCR、基因芯片都只能檢測已知突變位點。ctDNA高通量測序中的主要技術(shù)：1 cfDNA的提取，有慮柱法（以Qiagen為

24、主）和磁珠法兩種，如果是ctDNA檢測那么一般采用Qiagen的慮柱法，因為提取效率高，而且ctDNA測序所需的外周血量大，一般為5mL；磁珠法可以用于NIPT的檢測，因為母體中胎兒游離的DNA量比較豐富，可以達到母體外周血中cfDNA總量的10%，磁珠法的優(yōu)勢是簡單快速，所需的外周血低至0.1mL。2 在cfDNA中篩選ctDNA，有兩種方法：第一種是多重擴增子技術(shù)，即針對要檢測的癌癥相關(guān)基因涉及相應(yīng)的引物，通過引物擴增來獲得目標序列，這種方法的好處是能夠通過擴增提高檢出下限，但是多重擴增涉及到反應(yīng)均一性的問題，所以一般用于幾十個目標基因的檢測；第二種方法是捕獲技術(shù)，設(shè)計探針直接從提取的cf

25、DNA中找到ctDNA，然后通過載體將探針與ctDNA復(fù)合物拉下來，再進行分離，當前的捕獲效率一般在70%左右；捕獲技術(shù)的優(yōu)點是可以設(shè)計大量的探針，目標基因可以達到上千個。3 當前測序公司ctDNA的測序深度在2000x到20000x左右，所采用的技術(shù)平臺主要是Illumina的Hiseq/NextSeq以及l(fā)ife的ion Proton，據(jù)調(diào)研反饋，Illumina技術(shù)平臺的穩(wěn)定性比Life的要好一些，有公司正在籌備拿Illumina的NextSeq和life的ion Proton向CFDA申請腫瘤測序?qū)徟tDNA在腫瘤診治中的廣闊前景：1 腫瘤實時監(jiān)測，ctDNA的含量與腫瘤

26、負荷及疾病進展相關(guān), 通過NGS對ctDNA進行定量分析，可以評估腫瘤大小變化，實現(xiàn)疾病實時監(jiān)測。2 檢測腫瘤進化（耐藥），通過高測序可以檢測腫瘤的主要突變位點變化，而定點檢測手段（如ddPCR、qPCR），在評估和監(jiān)測腫瘤克隆演化方面具有較大的局限性。3 應(yīng)用于腫瘤早期篩查方面，多項研究證明ctDNA在腫瘤早期已經(jīng)存在于外周血中，若與高靈敏度檢測技術(shù)結(jié)合，將有非常好的腫瘤早期篩查和殘留微病灶（MRD）檢測潛力。4 檢測腫瘤基因分型，有研究表明ctDNA與組織樣本中得到的檢測結(jié)果總體吻合率在80%左右，可以根據(jù)ctDNA的測序結(jié)果制定用藥策略，比如歐盟于2014年批準了阿斯利康易瑞沙（Ires

27、sa）血液ctDNA伴隨診斷，用于篩查受益人群。國內(nèi)在ctDNA測序領(lǐng)域比較靠前的是：思路迪、世和基因、燃石生物、華大基因、貝瑞和康等。隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，技術(shù)靈敏度和特異性不斷提高，最有希望在臨床得到廣泛應(yīng)用的也許會是ctDNA。4.2 CTC檢測CTC即循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cell,CTC）是指從實體瘤中脫離出來并進入外周血液循環(huán)的腫瘤細胞。CTC在患者的血液中的含量實際上是極低的，大約每100萬個血細胞（約1mL血液）中才混雜著1個腫瘤細胞，因此從血液中捕獲CTC技術(shù)難度較高。主要的分離方法和免疫治療原理十分類似，依靠具有癌細胞特異性的抗體識別癌細胞

28、表面的抗原，從而達到捕獲癌細胞的目的。另外，CTC要比血細胞大，還可以根據(jù)體積大小用“慮篩”的方法分離。CTC的幾種分離方法：CTC的應(yīng)用：已經(jīng)完成及正在進行的大量研究顯示，CTC在臨床上具有較大的應(yīng)用價值。目前，CTC在臨床上的應(yīng)用主要包括以下幾個方面：早期篩查：研究發(fā)現(xiàn)，在早期腫瘤患者中，利用影像學還未發(fā)現(xiàn)病灶時已經(jīng)可以在外周血中檢測到CTC，因此CTC可以用于腫瘤的早期診斷，2007年ASCO就將CTC納入了腫瘤標志物。在臨床上，也遇到過非常典型的案例，一受檢者利用CTC做腫瘤早期篩查，在外周血中檢出1個CTC，后又通過數(shù)字PCR技術(shù)對ctDNA進行了定量分析，結(jié)果提示該患者腫瘤與結(jié)直腸

29、相關(guān)性較大。在隨后進行的腸鏡檢查中，在受檢者結(jié)直腸部位發(fā)現(xiàn)一個低分化腺瘤?？焖侬熜гu估作為腫瘤生物動力學標志物：通過CTC在不同治療階段的數(shù)目變化，可輔助快速評估手術(shù)、放化療及其他治療手段的療效。輔助腫瘤患者分期分級：通過檢測CTC數(shù)目，輔助評估腫瘤患者的分期及分級。血液系統(tǒng)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑，是否發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是判斷臨床分期的標準之一。近年來，CTC檢測在臨床上的應(yīng)用使之成為了TNM傳統(tǒng)分期系統(tǒng)的有效補充，從而指導(dǎo)下一步的治療。判斷患者是否需要輔助化療：術(shù)后CTC數(shù)目大于閾值，建議強化術(shù)后輔助化療；CTC數(shù)目小于閾值，建議采用標準輔助化療。監(jiān)測癌癥轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風險：CTC數(shù)目上升，提示腫瘤進展，

30、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風險增大；CTC數(shù)目下降，提示腫瘤緩解，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風險降低。提供預(yù)后相關(guān)的分子生物學特征：目前研究已經(jīng)證實血液中檢測到的CTC可以作為乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤的獨立預(yù)后因素。CTC監(jiān)測數(shù)目越高，提示患者預(yù)后較差。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者接受系統(tǒng)治療之前，每7.5 ml血液中CTC計數(shù)超過5 個, 提示更短的無進展生存時間和總生存時間。在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者中，每7.5ml血液中CTC計數(shù)超過3個，患者中位總存活期和無進展存活期都明顯縮短。監(jiān)測耐藥情況基于獲得連續(xù)樣本的便利性：通過檢測CTC數(shù)目變化，實時監(jiān)測腫瘤藥物耐藥性的發(fā)生。CTC液態(tài)活檢應(yīng)用總結(jié)：當前CTC的檢測還面臨一些挑戰(zhàn)，主要體現(xiàn)

31、在：提高CTC的檢出率（不依賴抗體的CTC分離策略，CellCullector策略）；準確地判斷具有生物學活性/功能的CTC（EPISPOT,CAM等策略）；CTC細胞分離，單細胞核酸WGA操作等樣品制備的SOP和QC方案；CTC本身的異質(zhì)性等。目前CTC的檢測還主要圍繞數(shù)量指標，CTC的簡單計數(shù)并不能反應(yīng)腫瘤細胞內(nèi)在的生物學特性，而正是這種特性是決定了不同的腫瘤細胞對治療具有不同的反應(yīng)。因此，對CTC細胞的分子特性（例如單細胞測序，藥物靶向基因的表達，藥物耐受相關(guān)基因突變的檢測）的精細刻畫，將有利于充分發(fā)掘CTC在指導(dǎo)臨床治療的價值。4.3 外泌體檢測外泌體是細胞分泌出的小泡，這個

32、小泡包含的內(nèi)容非常多，有蛋白質(zhì)、DNA、信使RNA以及一些非編碼RNA，是細胞之間溝通的載體。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞釋放的外泌體的量較大，這些外泌體與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及抗藥性具有一定的相關(guān)性。外泌體攜帶的信息多樣化，其中的蛋白質(zhì)和核酸，均可用于癌癥的早診、復(fù)發(fā)監(jiān)測、抗藥性監(jiān)測等相關(guān)方面的分析。而且外泌體在數(shù)量上多于CTC，更易富集；在形式上分泌小泡能夠有效保護核酸類物質(zhì)，克服了ctDNA在血液中容易降解的問題，在臨床有較大的應(yīng)用前景。但是到目前為止，仍沒有一種提取方法能同時保證外泌體的含量、純度以及生物活性。外泌體的幾種分離方法：離心法：這是目前外泌體提取最常用的方法，此種方法得到的外泌體量

33、多，但是純度不足，電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標準，也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。過濾離心：過濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質(zhì)量。這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題。密度梯度離心法：密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區(qū)，分為連續(xù)和不連續(xù)梯度離心法。用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準備工作繁雜，耗時，量少。免疫磁珠法：泌體相關(guān)抗原的抗體(如CD9、CD63、Alix

34、)與外泌體共同孵育，然后分離純化。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性。色譜法：色譜法是利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進行分離的分析的方法。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不廣泛。外泌體在液體活檢中的應(yīng)用總結(jié)：目前有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上，在臨床檢測中的應(yīng)用還不成熟。對CTC、外泌體的檢測分析最終還是要落實到標志物數(shù)量、蛋白質(zhì)、DNA、RNA上，蛋白和核酸的分析技術(shù)相對成熟，所以問題的關(guān)鍵還是在于如何高效的分離并

35、純化腫瘤CTC和外泌體。五、基因測序公司（NGS）的發(fā)展方向：測序是起點而不是終點如果是基因測序產(chǎn)業(yè)上游的公司，產(chǎn)品銷售的目標客戶廣泛，橫跨科研、醫(yī)療、商檢領(lǐng)域，產(chǎn)品包括測序儀、DNA提取試劑盒、捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒、建庫試劑盒、上機測序試劑盒，其中測序儀、上機測序試劑盒兩者是綁定的，DNA提取試劑盒、捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒、建庫試劑盒是可以用第三方的產(chǎn)品，國內(nèi)企業(yè)可以從這三個方向切入，但是試劑盒中的最關(guān)鍵的工具酶以及分離材料等都還是以進口產(chǎn)品為主，壁壘較高，如果能實現(xiàn)這兩個產(chǎn)品的進口替代，說明企業(yè)具有較強的技術(shù)實力。在科研和商檢領(lǐng)域，試劑盒的審批門檻較低，但是需要提供定制化服務(wù)

36、；在醫(yī)療診斷領(lǐng)域，多基因的捕獲試劑盒/多重子擴增試劑盒不大可能通過CFDA審批（前面已經(jīng)說明原因），只有通過認證的臨檢實驗室才能夠以自制試劑使用，因此這部分企業(yè)（思路迪、世和基因、燃石生物等）需要做兩手準備，籌備建設(shè)臨檢中心，向服務(wù)端布局。測序是起點而不是終點，做中游測序服務(wù)的機構(gòu)，最大的市場還是在醫(yī)療診斷領(lǐng)域，除了通過提供服務(wù)獲得收益外，測序機構(gòu)最大的潛在優(yōu)勢是能夠獲得特殊患者的組織樣本，并且獲得基因數(shù)據(jù)的積累，這對于藥物開發(fā)是十分便利的條件。比如說，腫瘤患者在使用某靶向藥物后出現(xiàn)耐藥性，測序機構(gòu)通過基因測序發(fā)現(xiàn)了新的耐藥位點（這是PCR、基因芯片這種檢測已知突變位點的技術(shù)所不具備的優(yōu)勢），

37、那么這個位點就是下一款靶向藥物的開發(fā)方向，并且測序機構(gòu)還可以獲得患者的腫瘤組織，以此培養(yǎng)原代細胞株，作為藥物開發(fā)的細胞模型，這就比其他的藥物研發(fā)機構(gòu)擁有更多的先發(fā)優(yōu)勢。我個人看好思路迪的發(fā)展模式，以自己的測序服務(wù)為橋梁，打通患者、醫(yī)院、CRO企業(yè)，測序結(jié)果提供用藥指導(dǎo)，同時反過來鏈接下游藥物開發(fā)和臨床試驗，形成良好的反饋機制。案例（美國腫瘤測序公司Foundation Medicine）：Foundation Medicine是一家專注于腫瘤高通量測序的商業(yè)公司，該公司專有的平臺可產(chǎn)生對病人的個體癌癥可操作的基因組信息，使醫(yī)生能夠在臨床實踐中優(yōu)化治療，使生物制藥公司制定有針對性的癌癥療法更加有

38、效。該公司以二代基因測序技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)癌癥基因測序結(jié)果給腫瘤患者提供精準的用藥指南。該公司的基因測序技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)導(dǎo)至患者罹患癌癥的基因突變，讓“個體化用藥”走進了新領(lǐng)域，讓醫(yī)生能夠根據(jù)患者的遺傳信息進行有針對性的癌癥治療。Foundation Medicine的服務(wù)需要醫(yī)生訂購，患者只需提供10余個病例組織切片或者一管幾毫升的血液。從提取腫瘤細胞的DNA到最終的報告，持續(xù)時間14-21天，其中包含了檢測出來的癌癥基因突變情況，以及針對每一種突變基因給出的用藥指導(dǎo)建議。Foundation Medicine提供兩種產(chǎn)品，F(xiàn)oundationOne和FoundationOne Heme。兩種產(chǎn)品

39、均是以二代基因測序為基礎(chǔ)，使用的測序儀包括Illumina HiSeq 2000 system和 Life Technologies' Ion Torrent。FoundationOne檢測適用于所有實體瘤，檢測315個癌癥相關(guān)基因的編碼區(qū)域以及28個基因的內(nèi)含子重排，費用為$5800。FoundationOne Heme檢測針對血液惡性疾病、淋巴瘤、白血病等，檢測405個基因的編碼區(qū)序列和31個基因的內(nèi)含子重排，以及265個基因的RNA序列來檢測基因融合，費用為$7200。FoundationOne檢測的方法在2013年10月時發(fā)表在了Nature Biotechnology上。進行

40、癌癥基因測序檢測需要癌癥基因的數(shù)據(jù)庫，公司因而建立了數(shù)據(jù)庫FoundationCORE。公司在2014年12月推出了瀏覽器ICE 2，該瀏覽器的一大特點是“患者匹配”功能。臨床醫(yī)生可以通過它在已有的知識庫FoundationCORE中搜索，尋找與患者腫瘤基因組類似的其他患者的信息。ICE 2的一個新的組成部分是PatientMatch，是一種利用FoundationCORE來增加FoundationOne和 FoundationOne Heme使用率的技術(shù)工具。通過PatientMatch，使用ICE 2網(wǎng)絡(luò)的醫(yī)生可以與在治療具有類似基因資料病人的醫(yī)生相聯(lián)系，和他們分享診斷結(jié)果合治療方案。根據(jù)公司2015年第三季度的報告，F(xiàn)oundationCORE已包含6萬個臨床病例信息。Foundation Medicine一直在努力的一個領(lǐng)域是醫(yī)保問題。2014年，密歇根州的大溪城重點衛(wèi)生部門宣布把Foundation Medicine的癌癥基因組分析服務(wù)納入醫(yī)保范圍；Google表示谷歌