微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范流程

1、xxxxxxx中藥飲片廠微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程編RZL - SOP - 05 - 062-01頁(yè) 數(shù)共9頁(yè)制定人制定日期年 月 日修訂日期年 月 日審核人審核日期年 月 日頒發(fā)部門質(zhì)量管理部批準(zhǔn)人批準(zhǔn)日期年 月 日生效日期年 月 日分發(fā)部門質(zhì)量管理部、質(zhì)量控制科目的 建立微生物限度檢查法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范操作，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。范 圍 成品、輔料、內(nèi)包裝袋及純化水的檢驗(yàn)。責(zé) 任 微生物限度檢驗(yàn)人員內(nèi) 容 本檢驗(yàn)操作規(guī)程依據(jù)中國(guó)藥典 2015年版四部通則1105非無(wú)菌產(chǎn)品微生物 限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法和通則1106非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查 法進(jìn)行檢查。微生物計(jì)數(shù)法一、計(jì)數(shù)方法1

2、、微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。2、計(jì)數(shù)方法 本法包括平皿法、薄膜過濾法。3、計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性檢查供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確定采用的方法適合于該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。4、菌種及菌液的制備4.1 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保藏。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用 性試驗(yàn)。4.2 菌液制備 按規(guī)定培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽 抱桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用 PH7.0無(wú)

3、菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液或0.9%無(wú) 菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。采用適宜的方法吸出抱子懸液至無(wú)菌試管中，用含 0.05% (ml/ml)聚 山梨酯80的PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃 度的黑曲霉抱子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在 2-8 C,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉抱子懸液可保存在2-8 C,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。雌藥悻試驗(yàn)苗糧的制備計(jì)榭百界基適用性檢否1怪方斷性試蛉需班商

4、總裁霉菌*DS母 菌翻需氧菌總救萼苗和附 重然金黃色葡萄厚苗皿用褥CCMOC(B)腰酩大豆原瓊脂培養(yǎng)基 我懶 大豆廝濯體理界 :，河養(yǎng)溫度3035Cr培養(yǎng)時(shí)1司整24h膜酪大豆麻 瓊胎塘赤基 我腰酩大豆 麻液體招養(yǎng) 基，培養(yǎng)褂 魔30 35C.用界 時(shí)間不超過 3 天.Stt 量不大于 lOOcfo*腰酪大豆豚 諫脂培界基 或噗酪大豆 麻液體培養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫 度效增界 時(shí)間不超過 3 天.量不大于 1。1二Fg聊假單胞葭Psfudamcrnas aenjguKfsa CMCC(BJ 10104枯蕈身泥桿菌Bxilhts subtihs (CMCC(BJ 63501)白色念珠菌Candida a

5、lUams CMCC(F) 98001)沙氏H萄蓿瓊脂培養(yǎng)基 或沙氏葡萄糖做體場(chǎng)界 基塔界科度2025c. 濟(jì)弄呵間27天鼠酪大豆麻 瓊脂培養(yǎng) 基*理養(yǎng)溫 演30 35C，塢養(yǎng) 時(shí)間不超過 5天.接種 量不大于 lOOcfu.沙氏需萄精 碟盾培養(yǎng) 基.招養(yǎng)混 度20 25c,培養(yǎng) 時(shí)間不超過 5天.我神 量下大于 lOOtfu,族能大豆麻 瓊脂培養(yǎng) 基，培養(yǎng)損 度為 BC.焙界 時(shí)間不超過 5天,受腫 量不大于 100cfuv沙氐犧噓 尊照?qǐng)勿B(yǎng) 基，培養(yǎng)海 度20 25c培養(yǎng) 時(shí)間不超過 5天，接胖 量不大于 100 血.黑朗嘉西Asperg Hus fliger CMCCff) 93003)

6、沙氏需萄格瓊脂陽(yáng)界基 或馬智暮愜瓊脂塞 界基.環(huán)界態(tài)度20 25CJ的時(shí)間57天， 或宜多聯(lián)得不事的肝4.3 陰性對(duì)照 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú) 菌生長(zhǎng)。4.4 培養(yǎng)基適用性檢查 按照表規(guī)定，接種不大于100cfu的菌液至胰酪大豆豚液體培 養(yǎng)基或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置規(guī)定的條件下 培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢 培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均 數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致。被檢 液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基

7、管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。5、計(jì)數(shù)方法適用性檢查5.1 供試品制備 根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性，采用適宜的方法制備供試液。制備時(shí)若需加溫應(yīng)加熱均勻且溫度不得超過45 C o供試液從制備到加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基不得超過1小時(shí)。5.1.1 成品、輔料供試液的制備 取供試品，力口 PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白凍緩沖溶液 或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基或稀釋制成1:10供試液，若需要，調(diào)節(jié)供試液PH至6-8,必要時(shí)用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍稀釋系列。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。5.1.2 內(nèi)包裝膜、袋：取供試品100cm2 ,剪碎，力口 PH7.0無(wú)菌氯化鈉

8、-蛋白陳緩沖 液或PH7.2磷酸鹽緩沖溶液，或胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制成 1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 PH至6-8,必要時(shí)用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍稀釋系列。5.2 接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗(yàn)用供試 液。所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的 1%。為確認(rèn)供試品中微生物能被充分檢 出，應(yīng)首先選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。5.2.1 試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每 1ml供試液所含 菌量不大于100cfu o5.2.2 供試品對(duì)照組 取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。5.2.3

9、菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液，按試驗(yàn)組操作 加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。5.3 供試品中微生物的回收 表1所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行 微生物回收，微生物回收采用平皿法。5.3.1 平皿法采用傾注法，表1中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備 2個(gè)平皿。取照 上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試淅1,置直徑90mm的無(wú)菌平皿中， 注入15-20m1溫度不超過45 c熔化的胰酪大豆陳瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌液，計(jì)算各試 驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。5.3.2 薄膜過濾法采用的濾膜孔徑不大于0.

10、45um。濾膜直徑一般為50mm。濾器及 濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水 溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤(rùn)濕濾膜。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率， 應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要 用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量不超過100ml ,總沖洗量不得超過1000ml; 以免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”和“接種和稀釋”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml、10cm2的供試品，若供試品中所含菌數(shù)校對(duì)，供 試液可酌情減量），加至適量的稀釋液總，混勻，過濾，用適量的沖洗液沖洗濾膜。測(cè)定需氧菌總數(shù)

11、，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板上；測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，按規(guī)定條件培養(yǎng)、技術(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備1張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照組和菌液對(duì)照組菌數(shù)。6、結(jié)果判斷 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用平皿法或薄膜過濾法，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5-2范圍內(nèi)。若各試驗(yàn)驗(yàn)菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。若存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，應(yīng)選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品檢查。二供試品的檢查1、檢驗(yàn)量 即一次

12、試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml或cm2）。一般隨機(jī)抽取不少于 2個(gè)最小包裝的供試品，混合，取 10g、10ml或100cm2進(jìn)行檢驗(yàn)。2、供試品檢查 按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。2.1 陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋液代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。若有菌生長(zhǎng)應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。2.2 平皿法取規(guī)定量的供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備 2個(gè)平板。2.2.1 培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 胰酪大豆陳

13、瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于 3035c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35大。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于 2025c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)57天，觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延成片的平板不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌落數(shù)。若 同稀釋級(jí)兩個(gè)平板的菌落數(shù)平均值不小于 15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或 以上。2.2.2 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則需氧菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu的稀釋級(jí)、霉菌和酵 母菌總數(shù)宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告的依據(jù)。取最高平 均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml或10cm2供試品中所含微生物，取兩位有效數(shù)字報(bào)告。如

14、 各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均茵落數(shù) 小于1時(shí)，以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù)。2.3 薄膜過濾法 按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取 適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。2.4 培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過100cfu。2.5 菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)

15、告菌數(shù)；若濾膜 上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以 1報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品），或 1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。3、結(jié)果判斷3.1 需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落 數(shù)）0若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微 生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基(如玫瑰紅鈉培養(yǎng)基)進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇 性培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。3.2 各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：10

16、1cfu:可接受的最大菌數(shù)為20; 102cfu:可接受的最大菌數(shù)為200; 103cfu:可接受的最大菌數(shù)為2000,以 此類推。3.3 若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定?？刂凭鷻z查法1、簡(jiǎn)述 控制菌檢查法是用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在某些特定微生物。本標(biāo)準(zhǔn)的控制菌為大腸埃希菌CMCC(B) 44102、銅綠假單胞菌CMCC(B) 10104和金黃色葡萄球菌CMCC(B) 26003供試品檢出控制菌或其他致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再?gòu)?fù)試。供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

17、要求同“微生物計(jì)數(shù)法”。2、培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn) 供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行適用性驗(yàn)證。2.1 菌種 試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過 5代(從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0袋)，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保藏。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )CMCC(B) 26003銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104大腸埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44102) 乙型副傷寒沙門菌(Salmonella paratyphi

18、B) CMCC(B) 50094白色念珠菌(Candida albicans ) CMCC(F) 98001生抱梭菌(Clostridium sporogenes ) CMCC(B) 649412.2 菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆豚液體培養(yǎng)基上，3035 c培養(yǎng)1824h ;將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025 c培養(yǎng)23天；將生抱梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下 3035c培養(yǎng)2448h,或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中3035c培養(yǎng)1824h。上述培養(yǎng)物用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白

19、凍緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。 菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在2-8 C,可在24 小時(shí)內(nèi)使用。生抱梭菌抱子懸液可替代新鮮的菌懸液， 抱子懸液保存在2-8 C,在驗(yàn) 證過的貯存期內(nèi)使用。2.3 陰性對(duì)照 為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú) 菌生長(zhǎng)。2.4 培養(yǎng)基適用性檢查 控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。檢查項(xiàng)目 包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢查項(xiàng)目及所用菌株。表控制檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力-抑制能力及指示特性控制前檢查培養(yǎng)基特性試除葡株耐月西革攔艇的題*菌增苗液體J直養(yǎng)基促生檜能力

20、大覷般希苗.啊般華 陶笛抑制前力金黃色裔塞耳菌紫紅粒鹽南甜糖麻朋塔養(yǎng)基便生長(zhǎng)能力 詠 示的惟大題埃奇兩、手吩捺單ISW大艇埃布西促空長(zhǎng)能力大輛埃卷菌抑制能力金黃色葡帝球菌復(fù)國(guó)機(jī)京脂焙界基促生長(zhǎng)能力H冒小杯性大舸淀亳葩沙門西KV沙門的Iff/悻拓君基1足生代就力乙堂舟僚喋色1曲師制能力至黃庫(kù)能JiT荀本錯(cuò)犯氨登脫氧膽酸油導(dǎo)蠟 培養(yǎng)基便繪標(biāo)能力討8示將性乙型副南京沙門葩三地快球制埴養(yǎng)基指示能力乙型的指暮紗門苗f陞f(xié)微單腦曲4H用范比十六烷基三甲接球增堀促生長(zhǎng)胡力七用亢展華的融押期能力大底域而朝2.4.1 液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查 分別接種不大于100cfu的的試驗(yàn)菌株與被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在

21、相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí) 問下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基比較，被檢培養(yǎng)基試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。2.4.2 固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌株與被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)應(yīng)一致。2.4.3 培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu的試驗(yàn)菌株與被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)， 試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。2.4.4 培養(yǎng)基指示特性的檢查用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗(yàn)菌株與被檢 培養(yǎng)

22、基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最 短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑能力 等英語(yǔ)對(duì)照培養(yǎng)基一致。2.5 控制菌檢查方法適用性檢查2.5.1 供試液制備：按“供試品檢查”中規(guī)定的方法制備供試液。2.5.2 試驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢查控制菌選擇相應(yīng)的試驗(yàn)菌株。確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法是，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn) 菌。2.5.3 適用性檢查按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于100cfu的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中，采用薄膜過濾法是取規(guī)定量供試液，過濾沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗(yàn)菌，過濾后注入規(guī)

23、定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相 應(yīng)控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度和最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相 應(yīng)的反應(yīng)特征。2.5.4 結(jié)果判斷上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液之被罰和控制菌檢查方法進(jìn)行 供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，營(yíng)銷處供試品中的抑菌活性(中國(guó)藥典2015年版四 部通則1105中抗菌活性的去除或滅活)，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。若經(jīng)過試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消除，可認(rèn)為受抑制的微生物不易存在于該供 試品中，選擇抑菌成分消除相對(duì)徹底的方法進(jìn)行供試品的檢查。3、供試品檢查供試品的控制菌檢查應(yīng)經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行。3.1 陽(yáng)性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)方法同供

24、試品的控制菌檢查，對(duì)照菌的加入量應(yīng)不大于 100cfu ,陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。3.2 陰性對(duì)照 以稀釋劑代替供試液照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生 長(zhǎng)。3.3 大腸埃希菌(Escherichia coli)3.3.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“微生物計(jì)數(shù)法”制成:10的供試液，取 相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，接種于適宜體積（經(jīng)方法適用性試驗(yàn)確定）的胰 酪大豆豚液體培養(yǎng)基中，混勻，3035 c培養(yǎng)1824h。3.3.2 選擇和分離培養(yǎng) 取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244 c培養(yǎng)2448h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035 c培養(yǎng)1872h。3.3.3 結(jié)果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行分離、純化及適宜 的鑒定試驗(yàn)，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長(zhǎng)， 或雖有菌落生長(zhǎng)但鑒定結(jié)果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。3.4 銅綠彳貿(mào)單胞菌（Pseudomonas aerug