最新WB實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)總結(jié)資料

1、蛋白提?。ㄋ胁僮髟诒线M(jìn)行）1. 裂解1）配裂解液：PMSF=100 : 1，（裂解液和 PMSF在-20 C保存，提前一天 4C解凍）取2ml裂解液，加20 M PMSF混勻2）稱取30mg組織，切碎放入標(biāo)記好的AP管中，加入600訕上述1中液體（加入液體與組織比例為 20： 1），冰上靜置10mi n2. 勻漿先用超純水潤洗一下勻漿機(jī)的鋼頭，（同時進(jìn)行幾組勻漿時，組間也要潤洗鋼頭）在勻漿機(jī)（在生化室）上每次勻漿10s,兩次（間隔5s），冰上靜置30min3. 離心（在基礎(chǔ)4樓416室）1）自帶1ml槍以及藍(lán)槍頭和黃槍頭，三個1.5的離心管（，兩個標(biāo)記，加少量超純水，號是為了離心平衡，對稱

2、放置）2）將離心機(jī)預(yù)冷至 4 C為止，以1200X10r/min離心15min3）用移液槍將上層清液取出放入號管中4. 變性（上樣緩沖液：樣品=4: 1）將樣品轉(zhuǎn)移至23個0.5mlAP管中加上樣緩沖液，100 C變性10mi n儀器屏幕：S500 :10S5100 .000 :101溫度（C）時間（時：分鐘）5. 保存變性結(jié)束后，打開 AP管蓋放一下氣，然后 4C保存，點(diǎn)樣是取出即可用WB實(shí)驗(yàn)步驟1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后風(fēng)干， 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。2. 配制分離膠1）準(zhǔn)備：1ml槍（藍(lán)色槍頭），200訕槍（黃色槍頭）10訕（白色槍頭）2）10%分

3、離膠的配置：（用 50ml燒杯。1.0mm板配1.5塊膠，1.5mm板配2塊板）5.91ml超純水4.95ml丙烯酰胺（30% ）避光保存極易失效3.75mlPh8.8Tris ?HCL150 M10%SDS150AP （催化劑促凝作用）9訕TEMED混合搖勻（用移液槍抽吸混勻液體，不要將液體完全打出防止氣泡）3. 灌膠沿玻璃板右上角緩慢勻速加入分離膠（用1ml移液槍，不要將移液管內(nèi)液體完全打出防止氣泡）保持液面平穩(wěn)上升至上方綠色線為止4. 水封立即用1ml超純水進(jìn)行水封（利用重力把膠壓平），如有氣泡則用針頭吸出防止影響電泳效果，等待20-30mi n5. 濃縮膠的配制（5% ）4.13ml超

4、純水1ml丙烯酰胺（30% ）避光保存極易失效750 MPh6.8 Tris ?ICL60 m10%SDS60 MAP （催化劑促凝作用）6訕TEMED攪拌混勻立即灌膠至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝膠30min或20min6. 電泳（電泳液最多使用兩次）1）安裝電泳裝置低板對內(nèi)，上方夾住，往兩板中加入電泳液至黑線并觀察是否漏液，緩慢拔掉梳子（注意兩手平衡拔 岀防止拔歪）2）點(diǎn)樣（不易時間過長，防止樣品條帶擴(kuò)散）Mark4訕（Protern ladder ）推薦9禺實(shí)際4卩已經(jīng)足夠樣品8訕7-10訕均可內(nèi)參挑齊即可組數(shù)少時盡量靠中間點(diǎn)樣，邊緣易跑歪3）連接電泳儀電泳池與電泳蓋連接：黑對黑，

5、紅對紅電永池的兩個電極插入電極蓋孔內(nèi)，打開開關(guān)恒壓電泳先調(diào)電壓至70mV，跑約20min。（ Mark跑開，分出彩帶即可）再調(diào)電壓至120mV，跑約60min。（不能跑過下面的玻璃板）注：Mark的條帶從紅色條帶往下依次為：70 -55 -40- 35 -20，待測蛋白的分子量再哪一區(qū)域就在哪L段剪。用綠色的切板切割待測區(qū)域，邊緣留點(diǎn)空余，以防止切到條帶。放入裝有轉(zhuǎn)移液的皿中浸 泡7. 轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移液可用3-4次）1）剪四層濾紙（大小與膜相，近可大不可?。┙朕D(zhuǎn)移液皿中。然后再講其剪成與膠一致大?。z始終 保持濕潤）2）剪PVDF膜（用上述濾紙，勿用手直接接觸PVDF膜），然后用甲醇活化 10s

6、以上3）“夾三明治”再大塑料盆中加入少量轉(zhuǎn)移液，將夾板、海綿、濾紙、膜均放入浸泡，夾板黑板在下、兩層濾紙-膠-膜-兩層濾紙（膠的大分子量條帶在上方，即在右上方）4）安裝轉(zhuǎn)膜裝置：黑板對黑板，電極黑對黑，紅對紅。加入轉(zhuǎn)膜液至滿（否則儀器無法啟動）5）6）打開開關(guān)，調(diào)節(jié)電流至 100mA，轉(zhuǎn)膜2h （恒流）盆中加滿冰轉(zhuǎn)膜成功標(biāo)志：膠上的條帶均轉(zhuǎn)移的膜上，膠呈無色8. 圭寸閉2）配制5%脫脂奶粉：2.5g脫脂奶粉卜 小燒杯中混勻加入皿中50mlTBST3）4）將膜取出放入上述加入了 5%脫脂奶粉中的皿中常溫慢搖60min （轉(zhuǎn)移液回收其余清理掉，轉(zhuǎn)移液可以重復(fù)利用2次）9.9. 一抗1)2） 用TB

7、ST配，每一格加 5ml TBST，再分別加入抗體抗體的量:2l (Psmad2l)免抗1:10005 訕：5ml58 （分子量）2l (Psmad2l)免抗1:50010 訕：5ml58Jnk免抗1:10005 訕：5ml雙帶內(nèi)參（小鼠抗GAPH） 單抗，中杉金橋1:50001 訕：5ml363）膜上用圓珠筆標(biāo)記，分別放入小格中（正面朝上）4）4°C冰箱中，慢搖過夜（正面朝上，搖床416室）10. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。11. 二抗1）用3%的脫脂奶粉1.5g的脫脂奶粉、>小燒杯中混勻加入皿中50mlTBST丿2）每格吸入5ml 3%脫脂奶粉，

8、抗體與奶粉比例均為1:5000，即加入1訕注意：吸入微升時，一定要檢查是否吸到液體，一抗用鼠抗則二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用 免抗3）膜分別加入小格，慢搖 1-2h （常溫）12. 洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。13. 顯影： U盤A液，B液（顯影液。4C保存）所需物品<200 pl槍+槍頭（黃）i 膜（置于皿中）1）開機(jī)后自動預(yù)冷，溫度降到 1-20 'C才可2）顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用（A液：B液=1 : 1）3）膜正面朝上放于暗箱，（即大分子量再左上角）用移液槍吧顯影液均 勻涂在膜上4）先點(diǎn)擊自動曝光，看下效果，顯示不清晰再手動該曝光時間，內(nèi)參一 般顯影15s

9、 （影像的條帶粗細(xì)深淺一致則說明已調(diào)齊）內(nèi)參好說明各步實(shí)驗(yàn)操作均無誤，目的蛋 白結(jié)果好壞就取決于抗體的專一性。5）每張圖保存多張不同清晰度的以備用，拷貝至 U盤試劑配方:5) 30% Aci Bic (37.5:1)丙(Acr)28,1 g中更雙尚烯酰胺CBic) 0.75g超純水至1叫訕取Acr 28.1 g,加超純水(約80 ml),攪拌.待Acr®解后,加Bic 0.75 g,溶解陽定容至100 ml,轉(zhuǎn)移至硬質(zhì)肢歸瓶(100 ml) 'Is 4£避光保存口6) L5MTris HC1 (pH&8)Tus (MW 121.14)45.43 g超純水20

10、0 ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至R.*,室溫保存.7) l.OMTris HC1 (pH7.5)TrisMW 12L14)30,29 總f超純水200 ml落解后，用濃鹽戰(zhàn)調(diào)pH 7,5 濃鹽酸加入體積約161111),家溫滋作。8) 05MTns HC1 (pH6.S)Tris (MW 121,14)15.14 g超純水200 ml溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH至6.8,宅溫保存。9) 10% SDS十二烷皐硫酸鈉)SDS10 g超純水100 ml§0。匚水浴，至充分辭解'室溫保存。如果怏期保存屮出現(xiàn)沉淀，水浴溶化斤，可繼續(xù)使用)10) 10%AP過流酸飲)AP0.1 g超純水1

11、ml瘠解厲，護(hù)匚避光保存，保存時間為1MU11) 20% Tweeii20Tween2020 nil超存水80 ml混勻肩.4疋保存*12) 10%分離膠(1塊膠)超純水3.94 ml30%Aci/Bic3.33mlL5MTris HC1 (pHS.S)2 5nil10% SDS100 ul10% AP100 plTEMED6ul13) 15%分離膠(1塊膠)超純水2.3ml30?4Acr Bic5.0 ml1.5 M Tris HC1pH&8)2.5 nil10% SDS10%AP100 “1TEMED6 pl14）5%濃縮膠（2塊膠）趙純水4.13 ml30° o Acr. BicL0 ml0.5 MTns HCl(pH6.S)0.75 ml10% SDS60 pl10% AP60 plTEMED6 pl應(yīng)在三天內(nèi)使用卩15) 電泳液(1000ml)甘氨酸TnsSDS超純水3,04 £lg1000 ml攪拌溶解后備用,應(yīng)在三天內(nèi)使用。16)轉(zhuǎn)移液(1000 ml)甘氨酸14 4 gTris3.04 gSDS0.75s超純水800 ml攪拌溶解后，加屮醇200 ml混勻，靜S 20 nun后，轉(zhuǎn)移至鰹質(zhì)玻朋瓶中.蓋上®