細胞因子的ELISA方法檢測

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上實驗報告實驗名稱細胞因子的ELISA方法檢測實驗日期院 系醫(yī)學院專 業(yè)醫(yī)檢班 級姓 名學 號一、實驗目的掌握ELISA法的基本步驟和原理。二、實驗器材試劑：酶標抗體、底物A、底物B、終止液、2000pg/ml PGF1標準品、待測標本1、待測標本2器材：酶標架、已包被抗體的酶標條、封口膜、洗滌液、微量加樣槍、酶標儀三、實驗原理1.細胞因子測定的3類主要方法：1）生物學方法：測細胞因子具有的生物學活性；代表實際活性，方法繁復、其它細胞因子干擾。2）免疫學方法：細胞因子作為抗原被測定濃度；簡便靈敏，不等于實際活性。3）分子生物學方法：測細胞因子mRNA水平，間接反映濃度；

2、較簡便更靈敏，不等于實際活性和濃度。2. 三類方法各有優(yōu)缺點：以免疫學方法較為簡便和常用。免疫學方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)放射免疫測定法(RIA)等，而酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)則可用于檢測單個細胞的細胞因子產生情況。3. 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ enzymelinked immunosorbentassay，ELISA ）的基本原理是：雙抗夾心法1）包被：將細胞因子抗體吸附在酶標板表面，形成固相抗體。2）用封閉液中的蛋白如牛血清白蛋白封閉酶標板表面剩余的吸附位點。以避免對后續(xù)測定中抗原抗體的非特異性吸附。3）加入被測標本進行孵育，則其中的被測細胞因子就與固相上的抗體發(fā)生特異性

3、結合，不發(fā)生結合的其他成分可通過洗滌去除。4）加入辣根過氧化物酶HRP標記的抗細胞因子抗體進行孵育，則酶標抗體也與細胞因子發(fā)生特異性結合。被結合的酶標抗體的數(shù)量與細胞因子的濃度成正比。5）洗滌去除多余的酶標抗體，再加入酶催化的底物，在酶的催化下，底物形成有色產物。6）作用一定時間后，終止酶促反應。測定產物顏色，可以反應酶濃度高低，間接反映被測細胞因子的濃度。通過已知標準樣品的對照，就可以推算出待測細胞因子的濃度。四、實驗過程及步驟1.取已包被抗體并完成封閉的酶標條2條，分別裝于酶標架上。在每條酶標條的16孔分別加入稀釋液100微升。2.向第6、7孔加入分別加入2000pg/ml PGF1標準品

4、100微升。3.用加樣槍吹吸混勻第6孔的液體，注意避免氣泡形成?；靹蚝笃錆舛燃s為1000pg/ml。4.再吸出100微升加入第5孔，吹吸混勻。其濃度變?yōu)?00pg/ml。以此類推，一直加到第2孔。吸去多余的100微升。5.向第8、9孔各加入100微升樣品1。10、11孔加入100微升樣品2.6.封口膜覆蓋酶標板，防止水分揮發(fā)。7.將酶標板置于37溫箱孵育120min。8.取出孵育后的酶標板，揭開封口膜，甩去孔中液體，注意甩動方向，避免液體流入相鄰酶標孔，造成交叉污染。9.加入洗滌液，注意不要溢出至相鄰孔，造成交叉污染。靜置3min后甩去孔中液體，重復以上洗滌過程4次。在吸水紙上拍干孔中液體。1

5、0.每個孔各加入酶標記抗體100微升。封口膜覆蓋酶標板，將酶標板置于37溫箱孵育60min。11. 取出孵育后的酶標板，揭開封口膜，甩去孔中液體。再加入洗滌液，靜置3min后，甩去孔中液體，重復以上洗滌過程4次。在吸水紙上拍干孔中液體。12. 每個孔各加入底物A 100微升，再加入底物B各100微升。晃動酶標板混勻。將酶標板放入37溫箱孵育15min顯色。13. 取出孵育后的酶標板，見酶標板孔中液體呈藍色。14. 每個孔各加入終止液100微升，可見液體變成淡黃色。15.用酶標儀在450nm處測OD值。結果如下：16. 分析結果：將2組標準品的OD值和標本1、標本2的4個副本的OD值合并得到平均值。根據各自的OD值，在半對數(shù)坐標上標出62.5、125、250、500、1000、2000這6個不同稀釋度標準品所處的位置，將6個點連線集會成標準曲線。根據2個標本的OD值標出其在OD值普通坐標上的位置，虛線連接其在標準曲線上的位置，再用虛線連接確定其在濃度坐標上